التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Summary

هنا نقترح أساليب بسيطة للحث على نقص الأكسجين في مزارع الخلايا واختبارات بسيطة لتقييم حالة نقص الأوكسجين من الثقافات.

Abstract

يتم تعريف نقص الأكسجة بأنه انخفاض أو نقص الأكسجين في الأجهزة والأنسجة أو الخلايا. وهذا يمكن تخفيف حدة التوتر الأكسجين يكون راجعا إلى انخفاض حجم المعروض في الأكسجين (تشمل الأسباب غير كافية شبكة الأوعية الدموية ، خلل الأوعية الدموية ، وفقر الدم) أو إلى زيادة استهلاك الأكسجين النسبي لتوريد (الناجمة عن ارتفاع معدل الانتشار المفاجئ الخلية) . يمكن أن يكون نقص الأكسجين فيزيولوجية أو مرضية مثل سرطانات الصلبة ^1-3 ، الخ التهاب المفاصل الروماتويدي تصلب الشرايين... كل الأنسجة والخلايا لديها القدرة على التكيف مع مختلف هذه الحالة الجديدة. أثناء نقص الأكسجين ، واستقرت نقص الأكسجين محرض ألفا عامل (مؤسسة الحرمين) ، وينظم جينات مختلفة مثل المتورطين في الأوعية الدموية أو نقل الأوكسجين ^4. استقرار هذا البروتين هو السمة المميزة لنقص الأكسجين ، وكشف ذلك يستخدم بشكل روتيني للكشف عن مؤسسة الحرمين ^5-7 نقص الأكسجة.

في هذا المقال ، فإننا نقترح طريقتين بسيطة للحث على نقص الأكسجين في خلايا الثدييات الثقافات واختبارات بسيطة لتقييم حالة نقص الأوكسجين في هذه الخلايا.

Protocol

1. نقص الأكسجين الناجم عن حل كوكلي ₂

كلوريد الكوبالت hexahydrate (II) (كوكلي ₂ • 6H ₂ O ، MW = 237.9) هو محفز الكيميائية للعامل ⁸ - 1.3 - نقص الأكسجين محرض. هذا المنتج هو قابل للذوبان في الماء (100 ملغ / مل) ، والرضوخ واضحة ، والحل الحمراء.

1. إعداد محلول المخزون 25mM في الماء المعقم د (إعداد مباشرة قبل الاستعمال)
2. استخدام كوكلي ₂ في التركيز النهائي لل100μM الخاص في وسائل الإعلام العادية خلية ثقافة للحث على نقص الأكسجين.
3. إضافة كوكلي ₂ الوسائط التي تحتوي على خلايا الجسم واحتضانها للثقافات 24hours في الحاضنة التقليدية (37 درجة مئوية ؛ C0 ₂ 5 ٪).

تركيز أعلاه يعمل لخطوط الخلية اختبرناها ولكن يجب اختبار كل سطر الخلية بتركيزات مختلفة (لإنشاء منحنى الجرعة) وكذلك في أوقات مختلفة في حضانة أجل الحد من سمية الدواء ذات الصلة وتحسين مقايسة.

2. نقص الأكسجين يتسبب في غرفة حاضنة وحدات

1. إعداد ما لا يقل عن ثقافتين خلية متطابقة (الثقافة التوأم). يمكن أن يكون في مزارع الخلايا لوحات ، وقوارير أو أطباق الثقافة. لفتح غرفة ، وهما أولا فتح المشابك البلاستيكية البيضاء الواقعة على أنابيب موصولة إلى الغرفة (الأنابيب المستخدمة في الحقن / تطهير الغاز ميتة) وفتح بلطف حلقة المشبك الفولاذية.
2. الافراج عن المشبك. ويمكن الآن للغطاء والصواني يمكن إزالتها.
3. وضع الثقافة في قاعة خلية ميتة. أيضا وضع طبق بتري تحتوي على الماء المعقم في الغرفة لتوفير الترطيب الكافي من الثقافات.
4. وضع "التوأم" ثقافة خلية في normoxia والسيطرة.
5. تأكد من الأدراج الخاصة بك المضمون وليس تتحرك ، ومن ثم إغلاق الغرفة مع غطاء لها. الموقف بشكل صحيح المشبك خاتم الفولاذ لضمان إغلاق سحري للغرفة وإغلاقه.
6. لخلق نقص الأكسجين ، إرفاق أنابيب إلى "نقص الأكسجة دبابات" يحتوي على 1 ٪ خليط الغاز O _2. وإذا كان لديك متر تدفق متصلة دبابتك يكون متصلا مباشرة غرفة لها (الغاز تدفق دبابات متر غرفة). نستخدم متر مسجلة في تدفق منظم لدينا.
7. ومن المهم لإزالة معظم إن لم يكن جميع الحاضرين الأوكسجين في الغرفة وسائل الاعلام الخاصة بك في أن تفعل ذلك بمسح الغرفة عن طريق فتح خزان الوقود بمعدل تدفق قدره 20 لترا لكل دقيقة لدقائق 70-10 ، ثم سرعان ما تتحول قبالة تدفق الغاز وأغلق تماما للغرفة عن طريق إغلاق كل من المشابك البيضاء.
8. عودة الى غرفة الحاضنة التقليدية للفترة من الوقت المطلوب. إذا كنت تستخدم الثقافات الكبيرة ، السماح لوسائل الإعلام في الثقافات إلى التقليل من الغاز لمدة 1 -- 2 ساعة ثم كرر دافق.
   وتستند الخطوات المذكورة أعلاه على التوصيات منشئ "(بيلوبس - روتنبرغ ، المؤتمر الوطني العراقي). تأكد من المضمون بشكل صحيح كنت خزان الغاز في كل وقت.

ملاحظات :

• من أجل القضاء على O ₂ الواردة في وسائل الإعلام ينصح الغاز إعادة الغرفة مرة واحدة بعد 3hours - 1.
• لفترة أطول من فترة حضانة 48hours ينصح أيضا لإعادة غرفة الغاز.
• ومجسات الأكسجين (الأقطاب الكهربائية / مقياس ضغط الدم) التي تسمح للقياسات O ₂ الواردة في الخلايا / الغرفة توفر مقياسا أدق ليا جواني / ₂ تحتوي على غرفة).
• واستنبات الخلايا في الوقت أطوال مختلفة لجعل الوقت منحنى مساعدة في تحديد الوقت الأمثل للتعبير - 1α مؤسسة الحرمين في خلايا معينة.

3. تقييم نقص الأكسجة

1. مؤسسة الحرمين الكشف α - 1 التي لطخة غربية.
   1. إعادة فتح الغرفة الخاصة بك كما هو موضح في القسم 2.2 والمكان على الفور الثقافات الخاصة بك على الجليد.
   2. ليز نقص الأكسجة الخلايا المعالجة وغير المعالجة ، مع حل SDS 5 ٪ في لوحات ثم نقل إلى خلية lyzate مواسير يصوتن ، spindown حطام خلية وجمع طاف.
   3. قياس تركيز البروتين باستخدام BCA عدة ، وإعداد نموذج بإضافة العازلة التحميل والتدفئة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   4. البروتينات Electrophorese على هلام بولي أكريلاميد SDS - 8 ٪ ، ونقل إلى الأغشية النتروسليلوز.
   5. كتلة الغشاء في برنامج تلفزيوني تحتوي على 5 ٪ من غير دسم الحليب الجاف و 0.1 ٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل على شاكر.
   6. بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة ضد مؤسسة الحرمين ، وحيدة النسيلة 1α الابتدائية (1 / 600) في المنطقة العازلة نفسها طخة مناعية في 4 درجات مئوية.
   7. تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة ، 5min في كل مرة واحتضان مع HRP الثانوية الأضداد (1 / 2000) في برنامج تلفزيوني + 0.1 ٪ توين 20 لمدة 45 دقيقة.
   8. تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة ، 5min الوقت /.
   9. استخدام طقم ECL بيرس وفيلم الأشعة السينية لإظهار الفرقة البروتين
2. المستجيبة العنصر نقص الأكسجة (HRE).
   مؤسسة الحرمين - 1α ينظم العديد من الجينات (أي VEGF ، EPO) ملزمة لتسلسل يسمى نقص الأكسجة العنصر تنظيم (HRE). تعليم حقوق الإنسان المرتبطة به الجين علامة طر هو ممكن للكشف عن نشاط مؤسسة الحرمين ^9. لاستخدام هذا الأسلوب ، تحتاج أولا إلى الخلايا transfect الخاص مع البلازميد HRE - luciferase باستخدام أسلوب ترنسفكأيشن تكييفها لخلايا الجسم. على سبيل المثال كنا Lipofectamine 2000. الخلايا تحتاج إلى transfected لا يقل عن 4 ساعات قبل أن تكون المحتضنة في نقص الأكسجين وnormoxia. هذا الوقت يسمح للحمض النووي لدخول الخلايا بحيث لا تتأثر هذه الخطوة الأولى من نقص الأكسجين. يتم الكشف عن إشارة luciferase باستخدام أدوات الفحص Luciferase.
   1. احتضان الخاص بتعليم حقوق الإنسان ، transfected الخلايا في نقص الأكسجين في الغرفة أو استخدام وحدات تعليم حقوق الإنسان ، transfected الخلايا المحتضنة مع كوكلي ₂ ، تشمل السيطرة normoxia.
   2. بعد فترة حضانة المطلوب ، وإزالة الخلايا من النمو المتوسط.
   3. شطف الخلايا في برنامج تلفزيوني ، إزالة برنامج تلفزيوني.
   4. الاستغناء 400μl كاشف تحلل 1X في صحن الثقافة وتتخلص من الخلايا المرفقة ، ثم نقل منها إلى الأنبوب الصغير.
   5. بيليه الحطام بواسطة الطرد المركزي وجيزة.
   6. 20μl مزيج من الخلايا lysates طاف مع 100μl من الكاشف Luciferase الفحص وقياس التألق باستخدام luminometer.

4. ممثل النتائج :

K562 في الخلايا (خلايا الإنسان خط اللوكيميا) مثقف 2 يوما في الأوكسجين منخفضة ، مقارنة normoxia ، نقص الأكسجة يدفع بزيادة قدرها مؤسسة الحرمين - 1α البروتين الذي اكتشفه لطخة غربية (الشكل 1).

باستخدام HRE - 293 luciferase تعديل الخلايا (خلايا جنينية خط الكلى) المستزرعة في نقص الأكسجين ، وهي زيادة كبيرة ، مؤسسة الحرمين 1α النشاط تم الكشف عن خلايا ميتة في (الشكل 2).

الشكل 1 : زيادة مؤسسة الحرمين ، في خلايا ميتة 1α. وكانت الثقافة في الخلايا K562 normoxia ونقص الأكسجة (الغرفة ميتة) لمدة 48 ساعة وتحليلها بواسطة لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة لمؤسسة الحرمين ، 1α. تم استخدام الأجسام المضادة لأكتين محددة لمراقبة التحميل.

Figure2 : مؤسسة الحرمين - 1α النشاط. تعليم حقوق الإنسان ، وتعديل luciferase 293 مثقف ونقص الأكسجين في الخلايا لمدة 48 ساعة normoxia وlysed ثم لاكتشاف إشارة luciferase استخدام عدة ومقايسة luciferase luminometer ملف. يتم التعبير عن النتائج على النحو التلألؤ وحدة نسبية (RLU).

Discussion

تكاثر الخلايا وقدرتها على البقاء في ظروف نقص الأوكسجين تختلف كثيرا تبعا للأنواع الخلايا. لذا ، يجب عليك ضبط عدد الخلايا أو عدد من لوحات تبدأ مع الثقافات للتأكد من سيكون لديك ما يكفي من الخلايا / البروتينات لإجراء التجارب الخاصة بك.

كلوريد الكوبالت الأسلوب له ميزة أن تكون غير مكلفة وسريعة. يحاكي هذا المنتج عن طريق حفز HIF-1/3α نقص الأكسجين ولكن يمكن أيضا تنظيم جينات أخرى ، تأكد من تكييف هذا المنتج إلى المشروع الخاص بك عن طريق التحقق من غيرها من الآثار ما كان يمكن أن يكون على وظيفة والنمط الظاهري للخلايا معينة ، بصرف النظر عن تقليد " ميتة "تأثير. دواء آخر يستخدم أيضا لنقص الأكسجين هو تقليد mesylate ديفيروكسامين (DFO ، الذي استخدم في تركيز 100 ميكرومتر النهائي). استخدام هذه العقاقير يسمح experimentator لفتح لوحة الثقافة / صحن / قارورة مرات عديدة دون أن يؤثر ذلك على "حالة نقص الأوكسجين".

لا يمكن للمستوى الأكسجين الموجود في خليط الغاز تختلف تبعا لتجاربك وأنواع الخلايا كقيم نقص الأكسجة تختلف تبعا لأنواع الأنسجة والخلايا. في الواقع ، بعض الخلايا هي ميتة في 5 ٪ O ₂ الحاجة الأخرى أقل من 1 ٪ O ₂ لتكون ميتة. يتم إضافة 5 ٪ CO ₂ إلى خليط الغاز لتحقيق الاستقرار في الرقم الهيدروجيني للثقافات ، والنيتروجين عادة ما تبقى من الغاز.

غرف ميتة لديها ميزة عدم استخدام العقاقير التي يمكن أن سلوك الخلية بشكل مستقل بديل للتوتر الأوكسجين. ومع ذلك ، يمكن القيام به ليست كل أنواع التجريب وإعادة الأوكسجين يدخل غرفة في كل افتتاح ويقلل بالتالي نقص الأكسجين. يجب عليك أن تنظر في هذا العامل تجاربك ؛ نقص الأكسجة / إعادة الأوكسجين هو شرط محدد يمكن أن تؤثر على بعض أنواع الخلايا. بديل لاستخدام محطات العمل نقص الأكسجة (متصلة خزانات الغاز قبل مختلطة أو لأنظمة الغاز الاختلاط) أو أكبر حاضنة نقص الأكسجة (نقص الأكسجة تجهيز الغرفة مع علبة القفازات) التي تسمح للتجريب وسائل الإعلام لتغيير والتلاعب في خلايا ميتة البيئة المستمر. وقد تم تسويقها غرف ميتة مختلفة على مدى العقد الماضي ، وينبغي أن يختار وفقا لاستخدام المختبر الخاص ، والمشاريع ، والفضاء ، والحجم ، والميزانية. ضمان الاستخدام الجيد دائما وحالة الغرفة الخاصة بك لضمان ظروف التربية الصحيحة. بشكل عام عند استخدام الغرفة ، يمكن أن يكون مستوى نقص الأكسجين عن طريق التضمين اختيار يمزج الغاز المختلفة (أي 1 ٪ ، 5 ٪ 10 ٪ أكسجين).

فيما كشف 1α ، مؤسسة الحرمين ، فمن المهم أن نعرف أن بعض الخلايا السرطانية عن خط مؤسسة الحرمين في normoxia - 1α. ومن ثم فهي حاسمة لاستخدام normoxia مراقبة لتحديد المستوى القاعدي لمؤسسة الحرمين في هذه الأسطر الخلية. مؤسسة الحرمين ، ويمكن أيضا أن تكون 1α موجودة في normoxia في غير الخبيثة الخلايا التالية تحفيز الخلية أو الإجهاد. يمكن أن يحدث هذا أيضا إذا تجويع هذه الخلايا ، تأكد من أن يتم بشكل صحيح الثقافات صومعتك الأعلاف والمحافظة عليها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
المناهضة للمؤسسة الحرمين - 1α	Invitrogen	458400
الكوبالت (II) كلوريد	سيغما	C8661 - 25G
غرفة الحاضنة	بيلوبس - روتنبرج	MIC - 101
HRE - Luciferase البلازميد	Adgene	البلازميد 26731