Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Özet

Burada kültürlerin hipoksik durumunu değerlendirmek için, hücre kültürleri ve basit testler hipoksi ikna etmek için basit yöntemler öneriyoruz.

Özet

Hipoksi, organ, doku veya hücrelerin oksijen azalması veya yokluğu olarak tanımlanır. Bu azalma, oksijen gerginlik azalmış oksijen kaynağı (yetersiz kan damarı ağı, arızalı kan damarı ve anemiye neden olur) ya da tedarik göre (ani bir yüksek hücre proliferasyon oranı neden) oksijen tüketiminin artmasına bağlı olabilir . Hipoksi, ^1-3, romatoid artrit, ateroskleroz, vb katı kanserleri gibi fizyolojik veya patolojik olabilir ... Her doku ve hücrelerin bu yeni duruma uyum sağlamak için farklı bir yeteneği var . Hipoksi sırasında, hipoksi indüklenebilir faktör alfa (HIF) stabilize ve oksijen ⁴ anjiyogenez veya nakliye dahil olanlar gibi çeşitli genler düzenler. Bu nedenle, bu proteinin istikrar HIF ^rutin hipoksi 5-7 için ekran için kullanılır tespit, hipoksi bir özelliğidir.

Bu makalede, biz, bu hücrelerin hipoksik durumunu değerlendirmek için memeli hücre kültürleri ve basit testler hipoksi ikna etmek için iki basit yöntem öneriyoruz.

Protokol

1. CoCl ₂ çözüm indüklediği hipoksi

Kobalt (II) Klorür hekzahidrat ve _(CoCl 2 • _{6H 2} O, MW = 237.9), hipoksi-indüklenebilir ^faktör-1.3 8 indükleyen kimyasal bir madde. Bu ürün, açık, kırmızı bir çözüm verimli, su (100 mg / ml) çözünür.

1. 25mm bir stok solüsyonu steril gg su hazırlayın, (hemen önce kullanıma hazırlamak)
2. Hipoksi ikna etmek için normal bir hücre kültürü medya 100μM son konsantrasyonda _CoCl 2 kullanın .
3. Hücrelere CoCl ₂ içeren medya ekleyin ve kültürlerin geleneksel bir inkübatör 24 saat inkübe (37 ° C,% 5 C0 _2).

Yukarıdaki konsantrasyonu hücre hatları için test ettik ama her hücre hattı, ilaca bağlı toksisite sınırı ve tahlil optimize etmek amacıyla çeşitli inkübasyon sürelerinde yanı sıra çeşitli konsantrasyonlarda (doza bağımlı bir eğri kurmak için) test edilmelidir çalışır.

2. Modüler İnkübatör Odası indüklediği hipoksi

1. En az iki özdeş (ikiz kültür) hücre kültürleri hazırlayın. Hücre kültürleri, şişeler, tabak ya da kültür yemekleri olabilir. Odanın açmak için, ilk oda (hipoksik gaz tasfiye enjeksiyon / için kullanılan tüpler) ve yavaşça, çelik halka kelepçe açık bağlı borular üzerinde bulunan iki beyaz plastik kelepçeleri açın.
2. Kelepçe bırakın. Kapak ve tepsiler artık kaldırılabilir.
3. Hipoksik odasında hücre kültürü yerleştirin. Ayrıca odasında kültürlerinin yeterli nemlendirme sağlamak için steril su içeren bir Petri kabı yerleştirin.
4. Normoxia "ikiz" hücre kültürü kontrolü yerleştirin.
5. Tepsiler güvenli ve hareket etmiyor ve sonra kapağı odasına yakın emin olun. Doğru odasının Hermetik kapanmasını sağlamak ve bunu kapatmak için çelik halka kelepçe yerleştirin.
6. Hipoksi oluşturmak için,% 1 O ₂ gaz karışımı içeren bir "hipoksi tankı" tüp takın. Tankına bağlı bir debimetre varsa odasına doğrudan gaz tankı-debimetre odacıklı () bağlı olacaktır. Biz regülatör kurulmuş bir debimetre kullanın.
7. Bunu yapmak için 7-10 dakika dakika başına 20 litre akış hızında gaz tankı açarak odasına floş odasında ve medya tüm oksijen mevcut, eğer en kaldırmak için önemlidir; sonra hızlı bir şekilde kapatmak- gaz akışı ve odanın her iki beyaz kelepçeler kapatarak tamamen kapatın.
8. Zaman istenilen süre için geleneksel bir inkübatör odasına dönün. 2 saat sonra tekrar aynı hizada büyük kültürleri kullanıyorsanız, 1 için de gaz kültürlerde medya izin verir.
   Yukarıdaki adımları yapıcı öneriler '(Billups-Rothenberg, Inc.) Dayanmaktadır. Gaz tankeri, her zaman için güvenli olduğundan emin olun.

Notlar:

• 1-3hours sonra yeniden gaz odasına kez tavsiye medya bulunan O ₂ ortadan kaldırmak için.
• 48hours daha uzun inkübasyon süresi için de yeniden gaz odasına tavsiye edilir.
• O ₂ hücre / odasında yer alan ölçümleri sağlayan oksijen sensörleri (elektrotlar / manometre), oda / hücre içi _O 2 içerir) daha hassas ölçüm sağlayacaktır .
• Bir zaman eğrisi yapmak için çeşitli süre kültür hücrelerinin belli hücreleri HIF-1α uygun zaman ifade belirlemenize yardımcı olacaktır.

3. Hipoksi Değerlendirilmesi

1. Western blot HIF-1 α algılama.
   1. Yeniden açın odası olarak bölüm 2.2 'de açıklanan ve hemen buz üzerinde kültürler yerleştirin.
   2. Plakalar% 5 SDS çözümü ile hipoksi arıtılmış ve arıtılmamış hücreler Lyse sonra, tüpler sonikasyon, yavaşlatmayı hücre artıkları hücre lyzate transferi ve süpernatantı toplamak.
   3. Tedbir protein konsantrasyonu BCA kiti kullanılarak, 5 dakika boyunca 95 yükleme tamponu ve ısıtma ° C ekleyerek örnek hazırlayın.
   4. % 8 SDS-poliakrilamid jel ve Selülozik membranlara transfer Electrophorese proteinler.
   5. 1 saat oda sıcaklığında veya çalkalayıcı üzerinde 4 ° C gecede% 5 yağsız kuru süt içeren PBS membran ve% 0.1 Tween 20 engelleyin.
   6. 4 aynı tampon anti-HIF-1α birincil monoklonal antikor (1 / 600) bir gecede immüno ° C.
   7. PBS PBS içinde HRP-ikincil antikor (1 / 2000) +% 0.1 Tween 20 45 dakika oda sıcaklığında, 5dakika her zaman ve inkübe% 0.1 Tween 20 içeren 3 kere yıkayın.
   8. PBS, 5dakika / saat oda sıcaklığında% 0.1 Tween 20 içeren 3 kere yıkayın.
   9. Protein bandı göstermek için Pierce ECL kiti ve X-ray film kullanın.
2. Hipoksi Duyarlı Elemanlar (HRE).
   HIF-1α Hipoksi Düzenlenmesi Element (HRE) olarak adlandırılan bir dizi bağlanarak çok sayıda genler (yani VEGF, EPO) düzenler. HRE ilişkili bir marker gen I⁹ HIF aktivite tespit etmek mümkündür. Bu yöntemi kullanmak için, önce hücrelerin adapte transfeksiyon yöntemi kullanılarak HRE lusiferaz plazmid hücreleri transfect gerekir. Örneğin biz Lipofectamine 2000 kullanılır. Hücreler hipoksi ve normoxia inkübe önce, en az 4 saat transfekte olması gerekiyor. Bu sefer, bu ilk adım, hipoksi etkilenmez, böylece DNA'nın hücrelere girmek için izin verir. Lusiferaz sinyal Lusiferaz Assay Kit kullanılarak tespit edilmiştir.
   1. Hipoksi, modüler odasında HRE-transfekte hücreler inkübe veya CoCl ₂ ile inkübe HRE transfekte hücreleri normoxia kontrolü içerir.
   2. Istenilen bir kuluçka döneminden sonra, hücre büyümesi orta çıkarın.
   3. PBS içinde hücreler durulayın, PBS çıkarın.
   4. Kültür çanak içine 400μl 1X reaktifi Uygulama ve ekli hücreleri kazıyın, sonra onları bir mikro tüp transferi.
   5. Kısa süreli santrifüj Pelet enkaz.
   6. Mix 20μl hücre Lusiferaz Testi Reaktif 100μl supernatant lizatları ve lüminesans lüminometre kullanarak ölçmek.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

K562 hücrelerinin (insan lösemi hücre hattı) normoxia kıyasla düşük oksijen kültürlü 2 gün, hipoksi western blot (Şekil 1) tespit edildi HIF-1α protein bir artışa neden olur.

HRE lucifeares, hipoksi kültür (embriyonik böbrek hücre hattı) 293 hücreler değiştirilen önemli bir HIF-1α aktivitesi artmış hipoksik hücreleri tespit edildi (Şekil 2). Kullanarak

Şekil 1: hipoksik hücrelerin HIF-1α artırın. K562 hücrelerinin 48 saat için normoxia ve hipoksi (hipoksik odasına) kültür ve HIF-1α için özel bir antikor kullanarak western blot ile analiz. Aktin için bir antikor özel yükleme kontrolü için kullanılmıştır.

Şekil 2: HIF-1α aktivite. HRE lusiferaz 293 hücreleri hipoksi ve 48 saat için normoxia kültüre edildi değiştirilmiş ve daha sonra bir lusiferaz tahlil kiti ve luminometre kullanarak lusiferaz sinyali tespit etmek için parçalanmış. Sonuçlar göreli lüminesans birimi (RLU) olarak ifade edilir.

Tartışmalar

Hipoksik koşullarda hücre proliferasyonu ve canlılığı, hücre türlerine bağlı olarak çok değişir. Bu nedenle, hücre sayısı ile başlar, deneyler için yeterli hücre / proteinlerin olacaktır emin olmak için kültürler plakaların sayısı ayarlamanız gerekir.

Kobalt klorür yöntemi, ucuz ve hızlı bir avantaja sahiptir. Bu ürün HIF-1/3α uyararak hipoksi taklit eder ama bu ürün bu "taklit bağımsız özel hücrelerin fonksiyon ve fenotip başka ne gibi etkileri olabilir kontrol ederek projeye adapte olduğundan emin olun, diğer genlerin düzenlenmesi hipoksik "etkisi. Ayrıca hipoksi taklit etmek için kullanılan başka bir ilaç deferoksamin mesilat (DFO, 100 mcM final konsantrasyonda kullanılır). Bu ilaçların kullanımı experimentator "hipoksik durum" etkilemeden kültür plaka / çanak / şişesi birçok kez açmak için izin verir.

Gaz karışımı bulunan oksijen düzeyi hipoksi değerleri, doku ve hücre tipleri bağlı olarak değişir deneyler ve hücre tiplerini bağlı olarak değişebilir. Gerçekten de, bazı hücreler O ₂ ihtiyacı% 1'den daha az O ₂ hipoksik% 5 hipoksik. Kültürlerin pH stabilize etmek için% 5 CO ₂ gaz karışımı eklenir, gaz geri kalanı genellikle Azot.

Hipoksik odaları oksijen gerilimi bağımsız hücre davranış alternatif ilaçlar kullanarak avantajı var. Ancak, her açılışında oksijen odasına tekrar girer ve böylece hipoksi azaltır olarak her türlü deney yapılabilir. Deneylerde bu faktör göz önünde bulundurmalıdır; hipoksi / yeniden-oksijenasyon, bazı hücre tiplerinin etkileyebilir belirli bir durumdur. Alternatif bir hipoksi iş istasyonları (ön karışık gaz tankları veya gaz karışım sistemlerine bağlı) veya deney ortamı değiştirmek ve sürekli hipoksik ortamda hücreleri manipüle etmek için izin büyük hipoksi inkübatör (torpido gözü ile hipoksi işlem odası) kullanmaktır. Çeşitli hipoksik odaları son on yıl içinde satışa sunulmuştur ve sizin laboratuar, proje, uzay, boyut, ve bütçe göre seçilmelidir. Her zaman doğru kültür koşulları garanti altına almak için odasının iyi kullanmak ve durumu sağlamak. Genel olarak bir oda kullanırken, hipoksi düzeyi çeşitli gaz karışımları (yani% 1,% 5,% 10 oksijen) seçerek modüle edilebilir.

HIF-1α tespiti ile ilgili olarak, bilmek önemlidir ki, bazı kanser hücre hattı normoxia olarak ifade HIF-1α. Bu nedenle, bu hücre hatları HIF bazal düzeyini belirlemek için bir normoxia kontrol kullanmak için kritik öneme sahiptir. HIF-1α hücre stimülasyon veya stres sonrası non-malign hücrelerin normoxia de mevcut olabilir. Bu aynı zamanda, bu hücreleri aç meydana hücre kültürleri doğru beslenmek ve korunur emin olun.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
Anti-HIF-1α	Invitrogen	458400
Kobalt (II) Klorür	Sigma	C8661-25G
İnkübatör Odası	Billups-Rothenberg	MIC-101
HRE-Lusiferaz plazmid	Adgene	26731 Plazmid