وبنقل العدوى إلى الإنسان Nucleofecting الجذعية المحفزة المستحثة خلايا

Summary

على الرغم من التطورات الأخيرة في التعديل الوراثي، ترنسفكأيشن من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESCs) لا تزال عملية متقلبة. على حد علمنا، لم أساليب منهجية وفعالة لبالنقل الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان خلايا (iPSCs) للأنباء. هنا، نحن تصف بروتوكولات قوية لبالنقل بكفاءة وnucleofect iPSCs الإنسان.

Abstract

التعديل الوراثي هو استمرار لتكون أداة أساسية في دراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية ويبين في التطبيقات السريرية المحتملة للخلايا الجذعية الجنينية (HESCs) ^1. في حين وصفت العديد من التحسينات في طرق إيصال الجين ^2-9، ترنسفكأيشن لا تزال متقلبة لعملية HESCs، وحتى الآن لم يتم الإبلاغ عن صنع الإنسان في الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). في هذا الفيديو، ونحن لشرح كيفية مختبرنا transfects بشكل روتيني وnucleofects iPSCs الإنسان باستخدام البلازميد مع تعزيز مضان مراسل الأخضر (EGFP) البروتين. يتم تكييفها iPSCs الإنسان والحفاظ عليه المغذية خالية الثقافات للقضاء على إمكانية ترنسفكأيشن الخلية المغذية والسماح اختيار كفاءة مستقرة استنساخ اللجنة التوجيهية المعدلة وراثيا بعد ترنسفكأيشن. لnucleofection، وiPSCs الإنسان مسبقا تعامل مع مثبط ROCK ^11، trypsinized إلى كتل صغيرة من الخلايا، وnucleofected replated على مغذيات في الخلية المغذية للهواءالمتوسطة لزيادة الانتعاش الخلية. ويمكن الحصول على التحوير، معربا عن iPSCs الإنسان بعد 6 ساعات. يتم تطبيق اختيار المضادات الحيوية بعد 24 ساعة وخطوط مستقرة المعدلة وراثيا تظهر ضمن 1 أسبوع. بروتوكول لدينا قوية وقابلة للتكرار لخطوط التوجيهية الإنسان دون تغيير تعدد القدرات من هذه الخلايا.

Protocol

بروتوكول لدينا يبدأ مع طريقة للتكيف مع iPSCs الإنسان على الثقافات المغذية خالية، تليها بروتوكولات لiPSCs بنقل العدوى إلى الإنسان باستخدام GeneJuice (EMD) وnucleofection من iPSCs الإنسان باستخدام جهاز nuclefector AMAXA.

ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراءات التالية في غطاء تدفق الصفحي العقيمة. جميع وسائل الإعلام والحلول معايرتها إلى 37 ° C أو درجة حرارة الغرفة قبل البدء ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. إنشاء iPSCs الإنسان على التغذية خال من نظام

يمكن تقسيم المحافظة iPSCs الإنسان سابقا على الخلايا المغذية، نقل على Geltrex المغلفة طبق ويحتفظ به لاثنين من الممرات قبل المغذية خالية ترنسفكأيشن.

1. ذوبان الجليد بين عشية وضحاها في Geltrex C. ° 4 لإعداد Geltrex طلاء، تمييع مطلق Geltrex 1:50 في DMEM الباردة. مزيج الحلول بلطف.

ملاحظة: Geltrex، مثل Matrigel هو شكل قابل للذوبان من matr الغشاء القاعديتاسعا تنقيته من الفئران Engelbreth-هولم-سرب الخلايا السرطانية (EHS). وبدلا من ذلك، يمكن استخدام Matrigel باعتبارها مصفوفة خارج الخلية لإنشاء وحدة التغذية الخالية من الثقافات اللجنة التوجيهية الإنسان.

2. تغطية كاملة من الآبار السطحية الثقافة مع الحل Geltrex (1 مل 35-جيدا لمم أ). معطف الآبار مع Geltrex في 37 ° C الحاضنة لمدة 1 ساعة.
3. لiPSCs مرور الإنسان، إضافة 1 مل من accutase لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة حتى تبدأ معظم الخلايا لفصل.

لiPSCs مرور الإنسان، إضافة 1 مل من accutase لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة حتى تبدأ معظم الخلايا لفصل.

4. إضافة الخرز الزجاجي 10-15 إلى الخلايا ودوامة بلطف لوحة. إضافة 2 مل من DMEM خروج المغلوب / F12 ويسحن بلطف. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 10 مل.
5. تدور في 800 دورة في الدقيقة الخلايا لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. نضح طاف من الأنبوب، وترك الإنسان اللجنة التوجيهية بيليه سليمة. نفض الغبار بلطف أنبوب لتفريق الخلية بيليه.
7. إزالة Geltrex من البئر المغلفة.
8. إعادة تعليق بيليه اللجنة التوجيهية بلطف الإنسان في حجم مناسب لSTEMPRO. توزيع بين آبار مغذيات، تبعا لمعدل انتشار). يمكن passaged iPSCs الإنسان في نسبة انقسام 1:02 حتي 01:06.
9. بعناية مكان إلى 5٪ CO ₂ حاضنة لوحة دوامة بعناية لضمان توزيع عادل للخلايا عبر الآبار.
10. الخلايا الأعلاف يوميا حتى الخلايا جاهزة للتقسيم مرة أخرى (عندما الخلايا يصل إلى 80٪ confluency).
11. iPSCs مرور الإنسان على بئر جديدة Geltrex المغلفة (الخطوة 1،3 حتي 1،9) في نسبة انقسام 1:2. ينبغي تشكيل مستعمرات صغيرة وموزعة بالتساوي على Geltrex المغلفة جيدا قبل ترنسفكأيشن.

2. ترنسفكأيشن من iPSCs الإنسان مع GeneJuice

ينبغي الخلايا (نمت على 6 لوحات جيدا) يكون حوالي 40 -50٪ متموجة في يوم ترنسفكأيشن لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ترنسفكأيشن. فمنليس من الضروري تغيير المتوسطة الخلية حتى في اليوم التالي.

1. إعداد 100 ميكرولتر KO-DMEM/F12 في أنبوب إيبندورف العقيمة 1،5 مل. إضافة 27 ميكرولتر ترنسفكأيشن GeneJuice كاشف. تخلط جيدا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
2. إضافة 4 DNA البلازميد ميكروغرام. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اختيار البلازميد أمر بالغ الأهمية لتحقيق الكفاءة المثلى ترنسفكأيشن. نستخدم البلازميد مع البروتين الأخضر مضان محسن (EGFP) يقودها المساعدة النقدية المروج ⁵ (pCAG-EGFP). المساعدة النقدية المروج هو المروج القوية التي تنشط في transcriptionally iPSCs الإنسان، وبالتالي يمكن استخدامها لدفع التعبير التحوير في هذه الخلايا. في أيدينا، لم الخطية من البلازميد لا يبدو أنها تؤثر على كفاءة ترنسفكأيشن.
3. إضافة GeneJuice-DNA إلى الخلايا خليط ودوامة لوحة. تدور في 1200 دورة في الدقيقة لوحة لمدة 5 دقائق (طريقة 'spinoculation') لزيادة الاتصال من خليط ترنسفكأيشن مع iPSCs الإنسان على البئر.
4. احتضان الخلايا في 37 ودرجة؛ C بين عشية وضحاها.
5. رصد لكفاءة ترنسفكأيشن في اليوم التالي.
6. لترنسفكأيشن مستقرة، تغيير المتوسطة في اليوم التالي مع STEMPRO الطازجة. إضافة اختيار المضادات الحيوية المناسبة بعد 24 - 48 ساعة.

3. Nucleofection من iPSCs الإنسان

ويمكن استخدام iPSCs الإنسان نمت على مغذيات أو Geltrex لnucleofection. ومع ذلك، فإننا نوصي بشدة replating iPSCs الإنسان على الخلايا الليفية الماوس nucleofected الجنينية (MEF) أو الخلايا الليفية الإنسان القلفة (HFF) مغذيات عالية لضمان بقاء الخلية والانتعاش. وينبغي أن تستخدم على الأقل 2 مليون خلية لتحقيق أعلى بقاء الخلية بعد nucleofection.

1. إعداد تغذية خلايا وسائل الإعلام مكيفة (CM) من خلال احتضان خروج المغلوب اللجنة التوجيهية الإنسان مصل استبدال (KOSR) وسائل الاعلام مع الخلايا المغذية ليلة وضحاها. CM جمع كل 24 ساعة.

ملاحظة: أي سلالة الماوس المستخدمة لإعداد طبقات المغذية (مثل CF1، وBLK6 MF1) هو مناسبة لاستخدامها FOص صنع CM.

2. في يوم nucleofection، قبل علاج iPSCs الإنسان مع 10 ميكرومتر ROCK المانع لمدة لا تقل 1 ساعة.
3. إعداد 82 ميكرولتر من الخلايا الجذعية البشرية في حل nucleofector العقيمة 1،5 مل أنبوب إيبندورف. إضافة 18 ميكرولتر الملحق 1. تخلط جيدا. احتضان حل في C ° 37 لمدة 5 دقائق.
4. قبل الدافئة تغذية الخلايا مكيفة وسائل الإعلام (CM) و0.25٪ التربسين / EDTA إلى 37 ° C. تحت غطاء محرك السيارة، prelabel 1 عقيمة أنبوب 15 مل المخروطية.
5. إزالة بعناية وسائل الإعلام من ثقافة الإنسان أن اللجنة التوجيهية nucleofected. يغسل بلطف الخلايا مع 2 مل حل الفوسفات مخزنة 1X (PBS) لكل بئر. نضح في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من التربسين 0.25٪ لكل بئر. احتضان خلايا في C ° 37 لمدة 3 دقائق.
6. يسحن بلطف خلايا ماصة الحافة مع 1000 مل. غسل قاع البئر للتأكد من منفصلة تماما عن iPSCs الإنسان. نقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل المخروطية المسمى.

ملاحظة: Trypsinization في ج واحدوينبغي بدقة ells يمكن تجنبها. يجب فقط أن الخلايا فكها إلى كتل صغيرة من الخلايا تتكون من ثلاثة توائم تقريبا من الخلايا. وكتل صغيرة من الخلايا (مثلثات الخلية) يمكن فصلها إلى خلايا واحدة خلال التعامل مع لاحقة من الخلايا.

7. أضف 9 مل وسائل الإعلام MEF لتعطيل التربسين. تدور الخلايا في 800 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. نضح بعناية طاف وترك الخلية بيليه سليمة.
8. إعادة تعليق الخلايا في ميكرولتر 100 من prewarmed الإنسان الجذعية حل الخلية nucleofector من الخطوة 3.3.
9. نقل الخلايا إلى كوفيت nucleofector باستخدام (أ) 1 مل ماصة الحافة.
10. إضافة 4 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في التعليق خلية في كوفيت. مزيج من الخلايا والحمض النووي دوامات لطيف. اضغط على كوفيت مرتين على سطح غطاء محرك السيارة.
11. إدراج كوفيت في ماسك nucleofector. استخدام برامج B-016. Nucleofect الخلايا عن طريق الضغط على زر X.

< و> عندما يتم عرض عملية nucleofection هو الإنشائيةإد (عادة يستغرق سوى 1-5 ثواني). أسفرت استخدام برامج أخرى nucleofection (A-023، A 033-023-U و) أقل من 10٪ من EGFP إيجابية الخلايا من iPSCs الإنسان.

12. استرداد خلايا nucleofected من كوفيت باستخدام ماصة بلاستيكية تقديم باستور. استعادة الخلايا عن طريق resuspending لهم في CM prewarmed ومثبط ROCK في أنبوب إيبندورف العقيمة 1،5 مل. احتضان خلايا في C ° 37 لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا التعافي.
13. نقل الخلايا قطرة من الحكمة على طبقات التغذية باستخدام 1 تلميح ماصة مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
14. رصد لكفاءة ترنسفكأيشن في اليوم التالي. لاستخلاص الحيوانات المستنسخة مستقرة من iPSCs الإنسان المعدلة وراثيا أن التعبير عن ثابت التحوير، تغيير المتوسطة في اليوم التالي مع CM ومثبط ROCK. إضافة اختيار المضادات الحيوية المناسبة بعد 24 - 48 ساعة.

4. ممثل النتائج:

الشكل 1. Photomicrographs من Riv1 iPSCs الإنسان transfected مع EGFP-pCAG. (A) EGFP، معربا عن الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل باستخدام Riv1 GeneJuice على Geltrex 12 ساعة بعد ترنسفكأيشن. مستعمرات Riv1 iPSCs الإنسان مطلي على شكل مغذيات وبعد nucleofection باستخدام B-016 (B) وA-023 (C) البرنامج. (D)، معربا عن EGFP الإنسان ستابلي المستعمرات اللجنة التوجيهية مع التعبير في كل مكان EGFP المستمدة من GeneJuice. (E)-ستابلي الاحتفاظ بالنقل Riv1 iPSCs الإنسان التأسيسي التعبير EGFP خلال التمايز الجسم مضغي الشكل.

Discussion

لدينا بروتوكولات نتيجة في تقنيات بسيطة وقوية للغاية وقابلة للتكرار لإدخال جينات منقولة في iPSCs الإنسان دون تأثير سام بارزة وموت الخلايا. وينبغي passaged iPSCs الإنسان إلى أصغر كتل من الخلايا (خلايا 5-10) ومطلي على Geltrex في كثافة عالية (1:2) لضمان كفاءة ترنسفكأيشن الأمثل في مستعمرات صغيرة عديدة. اللجنة التوجيهية لخطوط الإنسان التي هي أكثر عرضة للموت الخلية التمايز و، ينبغي استخدام عدد أكبر من iPSCs الإنسان (تصل إلى 4 X 10 ⁶ خلايا) لتجربة nucleofection واحد. مقايسة عابرة ترنسفكأيشن يولد أعداد كبيرة من iPSCs التحوير، معربا عن الإنسان داخل 1 يوم. استنساخ اللجنة التوجيهية ستابلي تظهر عادة في غضون 7 أيام، وهذه المستعمرات المعدلة وراثيا يجب أن تكون جاهزة ويمكن الحصول عليها في غضون ثلاثة أسابيع. وصف استخدام المروج CAG هنا يضمن التعبير في كل مكان من مراسل EGFP. تحت هذه التحسينات، يمكن تناول بروتوكولات لدينا في التطبيقات الأخرى، بما في ذلك overexpression، جonditional التعريفي، والاشتقاق من خطوط سلالته مراسل محددة، أو ضربة قاضية سيرنا shRNA، إعادة التركيب الجيني الاستهداف ومثلي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
0،25٪ التربسين EDTA مع	إينفيتروجن	25200056
2-المركابتويثانول	إينفيتروجن	21985-023
3 حبات الزجاج مم	فيشر العلمية	11-312A	وينبغي غسل الخرز الزجاجي مع حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) بين عشية وضحاها، تشطف قبالة مع هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) والماء المقطر، وتعقيم الأوتوكلاف من قبل الاستخدام.
Accutase كاشف خلية التفكك	إينفيتروجن	A11105-01
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)	إينفيتروجن	PHG0263
DMEM (ارتفاع نسبة الجلوكوز)	Lonza	12-741 F
الجنين مصل العجل	إينفيتروجن	16000044
Geltrex	إينفيتروجن	12760013	تخفيض عامل النمو
GeneJuice ترنسفكأيشن كاشف	EMD العلوم البيولوجية	70967
Glutamax-I (100X)	إينفيتروجن	35050061	ويمكن أيضا الجلوتامين L-(إينفيتروجن، 25030081) يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك.
اللجنة التوجيهية KOSR الإنسان وسائل الإعلام			ES 500 مل الإنسان يتكون من وسائل الإعلام خروج المغلوب مل 390 DMEM / F12، و 100 مل مصل حال محل خروج المغلوب، 5ml Glutamax-I (100X)، NEAA 5ml (100X)، 500 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (55MM) وتستكمل مع 10 نانوغرام / مل bFGF .
خروج المغلوب DMEM/F12	إينفيتروجن	12660-012
استبدال خروج المغلوب المصل (KOSR)	إينفيتروجن	10828-028
وسائل الإعلام الماوس الجنينية الخلايا الليفية			MEF سائل الإعلام يتكون من 90٪ FBS، NEAA 1X، 1X Glutamax I-1X والبيروفات الصوديوم في DMEM (ارتفاع نسبة الجلوكوز)
غير الأحماض الأمينية الأساسية، NEAA؟ (100X)	إينفيتروجن	11140050
الحل الجذعية البشرية nucleofector الخلية 1 مع الملحق	Lonza	VAPH-5012
التخزين المؤقت المالحة الفوسفات الكالسيوم دون 2 + 2 + والمغنيسيوم	إينفيتروجن	10010023
البيروفات الصوديوم (100X)	إينفيتروجن	11360070
STEMPRO المتوسطة طقم	إينفيتروجن	A1000701	500 مل سائل الإعلام STEMPRO يتكون من 454 مل قرع البابمن DMEM / F12، 10 مل STEMPRO الملحق المصل خالية من النمو (50X)، 5ml Glutamax-I (100X)، 5ml NEAA (100X)، 36 مل BSA (ألبومين المصل البقري، 25٪)، و 909 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (55MM ) وتستكمل مع 10 نانوغرام / مل bFGF.