Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Gentechnik, bleibt Transfektion von humanen embryonalen Stammzellen (hES) ein launischer Prozess. Nach unserem Kenntnisstand haben systematische und effiziente Methoden, um Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) transfizieren nicht berichtet worden. Hier beschreiben wir robuste Protokolle effizient transfizieren und nucleofect menschlichen iPS.

Zusammenfassung

Genetische Veränderung ist weiterhin ein wichtiges Instrument sein, das Studium der Stammzellbiologie und darlegt mögliche klinische Anwendungen von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) ^1. Während Verbesserungen in mehreren Gentransfer Methoden ^2-9 beschrieben haben, bleibt Transfektion ein launischer Verfahren zur hESCs, und noch nicht in der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) berichtet worden. In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig transfiziert und nucleofects menschlichen iPS Verwendung mit einem erweiterten grün fluoreszierendes Protein (eGFP) Reporterplasmid. Menschliche IPSCs angepasst und aufrechterhalten, wie Feeder-freien Kulturen, die Möglichkeit der Zuführung Zelltransfektion beseitigen und um eine effiziente Selektion stabiler transgener iPSC Klone nach der Transfektion ermöglichen. Für Nukleofektion werden menschliche iPS mit ROCK-Inhibitor ^11, in kleine Klumpen von Zellen, nucleofected und Zubringer replattiert in Feederzellschicht klimatisierten trypsiniert vorbehandeltmittel-bis Zellgewinnung verbessern. Transgen-exprimierenden menschlichen iPS kann nach 6 Stunden erreicht werden. Antibiotika-Selektion wird nach 24 Stunden und stabilen transgenen Linien erscheinen innerhalb 1 Woche angewendet. Unser Protokoll ist robust und reproduzierbar für menschliche iPSC Leitungen ohne Änderung Pluripotenz dieser Zellen.

Protokoll

Unser Protokoll beginnt mit einer Methode zur menschlichen iPS zur Feeder-freien Kulturen, durch Protokolle zur Transfektion menschlichen iPS mit GeneJuice (EMD) und Nukleofektion der menschlichen iPS mit einem AMAXA nuclefector nachgeschaltet anzupassen.

Hinweis: Die folgenden Verfahren werden in einem sterilen Laminarströmungshaube durchgeführt. Alle Medien und Lösungen sind äquilibriert bis 37 ° C oder Raumtemperatur bevor, wenn nicht anders angegeben.

Ein. Gründung menschlichen iPS auf Feeder-free-System

Menschliche iPS zuvor auf Feeder-Zellen aufrechterhalten werden aufgeteilt, übertragen auf Geltrex-beschichtete Schale und gepflegt für zwei Durchgängen vor Feeder-freie Transfektion.

1. Auftauen Geltrex Nacht bei 4 ° C. Um Geltrex Beschichtung herzustellen, verdünnen aufgetaute Geltrex 1:50 in kaltem DMEM. Mischen Sie die Lösungen vorsichtig.

Anmerkung: Geltrex wie Matrigel ist eine lösliche Form von Basalmembran matrix gereinigte aus murinen Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Tumorzellen. Alternativ können Matrigel als extrazelluläre Matrix Feeder-freien menschlichen iPS Kulturen zu etablieren verwendet werden.

2. Die gesamte Oberfläche der Vertiefungen mit Geltrex Kultur-Lösung (1 ml für eine 35-mm-Vertiefung). Coat Vertiefungen mit Geltrex bei 37 ° C Inkubator für 1 Stunde.
3. Um den Durchgang menschlichen iPS, 1 ml Accutase pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 1 min, bis die meisten Zellen zu lösen beginnen.

Um den Durchgang menschlichen iPS, 1 ml Accutase pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 1 min, bis die meisten Zellen zu lösen beginnen.

4. Fügen 10-15 Glasperlen zu den Zellen und schwenken Sie die Platte. 2 ml KnockOut DMEM / F12 und sanft verreiben. Übertragen Zellsuspension in ein 10 ml Zentrifugenröhrchen.
5. Spin-Zellen bei 800 UpM für 3 min bei Raumtemperatur.
6. Absaugen des Überstandes aus der Röhre, so dass menschliche iPSC Pellet intakt. Gently Flick Rohrdisperse Zellpellet.
7. Entfernen Geltrex aus dem beschichteten gut.
8. Vorsichtig resuspendieren menschlichen iPS Pellet in einem geeigneten Volumen STEMPRO. Verteilen zwischen den Wells von Feedern, abhängig von der Proliferationsrate). Menschliche IPSCs kann in einem Teilungsverhältnis von 1:2 bis 1:6 passagiert werden.
9. Vorsichtig Ort in 5% CO _2-Inkubator, schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.
10. Feed-Zellen täglich bis Zellen sind bereit, wieder aufgeteilt werden (wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen).
11. Durchgang menschlichen IPSCs auf neue Geltrex-beschichtete Vertiefung (Stufe 1.3 bis 1.9) in einem Teilungsverhältnis von 1:2. Kleine Kolonien gebildet und gleichmäßig auf Geltrex-beschichtete Vertiefung vor der Transfektion verteilt.

2. Transfektion von humanen iPS mit GeneJuice

Zellen (Anzucht auf 6-Well-Platten) sollte ca. 40 -50% konfluenten am Tag der Transfektion optimalen Transfektionseffizienz zu erreichen. Es istnicht erforderlich, das Zellmedium bis zum nächsten Tag ändern.

1. Bereiten 100 ul KO-DMEM/F12 in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Fügen Sie 27 ul GeneJuice Transfektionsreagenz. Gut mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
2. Add 4 pg Plasmid-DNA. Das Röhrchen bei Raumtemperatur für 15 min. Die Wahl von Plasmid ist entscheidend für eine optimale Transfektionseffizienz. Wir verwenden ein Plasmid mit einem verbesserten grüne Fluoreszenz-Protein (eGFP) durch CAG-Promotor ⁵ (PCAG-eGFP) angetrieben wird. CAG Promotor ein starker Promotor in humanen transkriptionell aktiven IPSCs und können daher verwendet werden, um die Expression des Transgens in diesen Zellen zu treiben ist. In unseren Händen hat Linearisierung von Plasmid nicht scheinen, um die Transfektionseffizienz beeinflussen.
3. Fügen GeneJuice-DNA-Gemisch zu den Zellen und schwenken Sie die Platte. Spin die Platte bei 1200 UpM für 5 Minuten ('spinoculation "Methode), um den Kontakt der Mischung mit Transfektion menschlicher IPSCs auf dem gut zu erhöhen.
4. Inkubieren der Zellen bei 37 unddeg; C über Nacht.
5. Monitor für Transfektionseffizienz am nächsten Tag.
6. Für die stabile Transfektion, ändern Medium am nächsten Tag mit frischen STEMPRO. Fügen Sie entsprechende Antibiotika-Selektion nach 24 - 48 Stunden.

3. Nucleofection der menschlichen iPS

Menschliche iPS auf Abzweige oder Geltrex angebaut werden für Nukleofektion verwendet werden. Allerdings empfehlen wir Replattierung nucleofected menschlichen iPS auf embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) oder menschliche Vorhaut-Fibroblast (HFF) Zubringer zu hohen Lebensfähigkeit der Zellen und Erholung zu gewährleisten. Mindestens 2 Millionen Zellen sollten verwendet werden, um höhere Zellüberleben nach Nukleofektion erreichen.

1. Bereiten Feeder-Zellen konditionierten Medien (CM) durch Inkubation menschlichen iPS KnockOut Serum Replacement (KOSR) Medien mit Feeder-Zellen über Nacht. Sammle CM alle 24 Stunden.

Anmerkung: Jeder Mausstamm zur Herstellung Feeder-Schichten (wie BLK6, CF1 und MF1) verwendet wird, ist geeignet, um daraus fo werdenr machen CM.

2. Am Tag der Nukleofektion, vorzubehandeln menschlichen IPSCs mit 10 pM ROCK Inhibitors für mindestens 1 Stunde.
3. Bereiten Sie 82 ul des menschlichen Stammzellen Nucleofector Lösung in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Hinzufügen 18 ul Beiblatt 1. Gut mischen. Inkubieren bei 37 ° C für 5 Minuten.
4. Vorwärmen Feeder-Zellen konditionierten Medien (CM) und 0,25% Trypsin / EDTA auf 37 ° C. Unter der Haube prelabel ein steriles 15 ml konischen Röhrchen.
5. Entfernen Sie vorsichtig Medien aus menschlichen iPS Kultur nucleofected werden. Vorsichtig waschen der Zellen mit 2 ml 1X Phosphat gepufferten Lösung (PBS) pro Vertiefung. Saugen Sie die PBS. 1 ml 0,25% Trypsin pro Vertiefung. Inkubieren Zellen bei 37 ° C für 3 Minuten.
6. Gently verreiben die Zellen mit 1000 ml Pipettenspitze. Waschen Sie den Boden des Bohrlochs, um sicherzustellen, dass alle menschlichen iPS vollständig abgelöst. Übertragen Zellsuspension an das markierte 15 ml konischen Röhrchen.

Hinweis: Trypsinierung in einzelne cEllen sollte unbedingt vermieden werden. Zellen sollten nur in kleinen Klumpen von Zellen verdrängt werden bestand aus etwa Drillinge von Zellen. Kleinen Klumpen von Zellen (Zelle Tripeln) wird in einzelne Zellen dissoziiert während der nachfolgenden Handhabung der Zellen.

7. 9 ml MEF Medien Trypsin zu inaktivieren. Spin-Zellen bei 800 rpm für 3 Minuten. Vorsichtig den Überstand aspirieren und lassen das Zellpellet intakt.
8. Die Zellen in vorgewärmten 100 ul menschlichen Stammzellen Nucleofector Lösung aus Schritt 3.3.
9. Übertragen Zellen einem Nucleofector Küvette unter Verwendung einer 1 ml Pipettenspitze.
10. Add 4 ug Plasmid-DNA in die Zellsuspension in der Küvette. Mix-Zellen und DNA durch vorsichtiges Schwenken. Tippen Sie auf die Küvette zweimal auf der Haube Oberfläche.
11. Legen Sie die Küvette in den Nucleofector Halter. Programme verwenden, B-016. Nucleofect Zellen durch Drücken der Taste X.

< > Wird angezeigt, wenn die Nukleofektion Prozess ist complet werdened (in der Regel dauert nur 1-5 Sekunden). Die Verwendung anderer Nukleofektion Programmen (A-023, A-033 und U-023) ergab weniger als 10% eGFP-positive Zellen aus menschlichen IPSCs.

12. Abrufen nucleofected Zellen aus der Küvette mit dem mitgelieferten Pasteur Plastikpipette. Recover Zellen durch Resuspendieren sie in vorgewärmte CM und ROCK-Inhibitor in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Inkubieren Zellen bei 37 ° C für 10 Minuten zu lassen Zellen erholen.
13. Transfer-Zellen tropfenweise auf Feeder-Schichten unter Verwendung von 1 ml Pipettenspitze. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C über Nacht.
14. Monitor für Transfektionseffizienz am nächsten Tag. Zur Ableitung stabiler Klone von transgenen menschlichen iPS, dass stabil exprimieren Transgen, ändern Medium am nächsten Tag mit CM und ROCK-Inhibitor. Fügen Sie entsprechende Antibiotika-Selektion nach 24 - 48 Stunden.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. Mikrophotographien Riv1 menschlichen iPS mit PCAG-eGFP transfiziert. (A) eGFP-exprimierenden Zellen transfiziert mit Riv1 GeneJuice auf Geltrex 12 Stunden nach der Transfektion. Kolonien von Riv1 menschlichen IPSCs ausplattiert und gebildet auf Zubringer nach Nukleofektion mit B-016 (B) und A-023 (C)-Programm. (D) Stabil eGFP-exprimierenden humanen iPS Kolonien mit allgegenwärtigen eGFP Expression von GeneJuice abgeleitet. (E) Stabil transfizierte Riv1 menschlichen iPS erhalten konstitutive eGFP Expression während Embryoidkörper Differenzierung.

Diskussion

Unsere Protokolle führen einfache, robuste und hoch reproduzierbare Techniken, um Transgene in menschlichen iPS einzuführen, ohne prominente toxische Wirkung und Zelltod. Menschliche IPSCs sollte in kleinere Klumpen von Zellen (5-10 Zellen) passagiert und plattiert auf Geltrex bei hoher Dichte (1:2), um eine optimale Effizienz der Transfektion in zahlreichen kleinen Kolonien gewährleisten. Für menschliche iPSC Linien, die anfälliger für Differenzierung und Zelltod sind, sollten höhere Zahl menschlicher IPSCs (bis 4 x 10 ⁶ Zellen) für eine einzelne Nukleofektion Experiment verwendet werden. Transienten Transfektions-Assay erzeugt eine große Anzahl von Transgen-exprimierenden humanen IPSCs innerhalb von 1 Tag. Stabil transfizierte iPSC Klone treten in der Regel innerhalb von 7 Tagen, und diese transgenen Kolonien sollten bereit sein, innerhalb von drei Wochen abgeholt werden. Die Verwendung von CAG-Promotor hier beschriebenen sorgt ubiquitäre Expression von eGFP Reporter. Unter solchen Verbesserungen können unsere Protokolle in anderen Anwendungen zugeführt werden, einschließlich Überexpression, conditional Induktion Ableitung linienspezifischen Reporter Linien, shRNA oder siRNA knockdown, Gen-Targeting und homologe Rekombination.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Namen Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
0,25% Trypsin mit EDTA	Invitrogen	25200056
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
3 mm Glaskugeln	Fisher Scientific	11-312A	Glaskügelchen sollte mit Salzsäure (HCl) über Nacht, abgerundet mit Natriumhydroxid (NaOH) und destilliertem Wasser gespült werden und sterilisiert durch Autoklav vor der Verwendung.
Accutase Zelldissoziationslösung Reagenz	Invitrogen	A11105-01
Basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF)	Invitrogen	PHG0263
DMEM (high glucose)	Lonza	12-741 F
Fötales Kälberserum	Invitrogen	16000044
Geltrex	Invitrogen	12760013	Growth Faktor reduziert
GeneJuice Transfektionsreagenz	EMD Biosciences	70967
Glutamax-I (100X)	Invitrogen	35050061	L-Glutamin (Invitrogen, 25.030.081) kann auch stattdessen verwendet werden.
Menschliche iPS KOSR Medien			500 ml Medium menschlichen ES besteht aus 390 ml KnockOut DMEM / F12, 100 ml Serum KnockOut Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 ul 2-Mercaptoethanol (55mm) und mit 10 ng / ml bFGF .
KnockOut DMEM/F12	Invitrogen	12660-012
KnockOut Serum Replacement (KOSR)	Invitrogen	10828-028
Maus embryonale Fibroblasten Medien			MEF Medien besteht aus 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I und 1X Natriumpyruvat in DMEM (hoher Glucose)
Nicht essentielle Aminosäure, NEAA? (100X)	Invitrogen	11140050
Menschliche Stammzellen Nucleofector Lösung 1 mit Zuschlag	Lonza	VAPH-5012
Phosphate Buffered ohne Ca 2 Saline + und Mg 2 +	Invitrogen	10010023
Natriumpyruvat (100X)	Invitrogen	11360070
STEMPRO Medium Kit	Invitrogen	A1000701	500 ml STEMPRO media besteht aus 454 ml KlopfOut DMEM / F12, 10 ml STEMPRO serumfreies Wachstum Supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine Serum Albumin, 25%), 909 ul 2-Mercaptoethanol (55mm ) und versetzt mit 10 ng / ml bFGF.