برغي دليل بسيط أسلوب للدراسات طعم أجنبي داخل الجمجمة في الفئران

Summary

من أجل تقييم نماذج علاجية جديدة لعلاج دبقي ، والنماذج ذات الصلة الفيزيولوجية ضرورية. نحن الاستعانة بهيئة المسمار دليل زرع الداخلي لإنشاء نماذج طعم أجنبي داخل القحف أن أكثر سرعة وأكثر أمانا من النهج المجسم.

Abstract

لتطعيم الخلايا السرطانية البشرية في دماغ الفئران كبت المناعة وسيلة أنشئت لدراسة سرطان الدماغ بما في ذلك ورم أرومي دبقي (دبقي) ونخاعي. نهج المجسم على نطاق واسع يسمح فقط للحقن حيوان واحد في وقت واحد ، هو العمل المكثف ويتطلب معدات متخصصة للغاية. وقد وضعت المسمار دليل الأسلوب ، وضعت في البداية من قبل لال وآخرون ، من ¹ إلى القضاء على المجسم إجراءات مرهقة. نحن الآن في وصف المسمار دليل تعديل النهج الذي هو سريع وآمنة على نحو استثنائي ؛ وكلاهما الاعتبارات الأخلاقية الحرجة. على وجه الخصوص ، تتضمن إجراء لدينا الآن مضخة التسريب الذي يسمح تصل إلى 10 الحيوانات ليتم حقنه في نفس الوقت مع الخلايا السرطانية.

للتدليل على فائدة هذا الإجراء ، أنشأنا خلايا دبقي U87MG كما xenografts داخل القحف في الفئران التي عولجت بعد ذلك مع AMG102 ؛ وهو جسم الإنسان كاملا الموجهة إلى HGF / عامل مبعثر يخضع حاليا لتقييم السريرية ^2-5. الحقن المنتظم للAMG102 مطولة بشكل كبير في بقاء جميع الفئران مع xenografts U87MG داخل القحف ، وأسفرت عن عدد من العلاجات كاملة.

هذه الدراسة تبين أن المسمار دليل الأسلوب هو غير مكلفة ، والنهج استنساخه للغاية لإنشاء xenografts داخل القحف. وعلاوة على ذلك ، فإنه يوفر نموذجا الفسيولوجية ذات الصلة للتحقق من صحة الرواية الاستراتيجيات العلاجية لعلاج سرطان المخ.

Protocol

1. خطوط خلية

1. يتم استزراع خلايا U87MG دبقي قوارير كبيرة في زراعة الأنسجة مع DMEM - F12 تستكمل مع مصل بقري جنيني من 5 ٪ (FBS).
2. ويتم حصاد الخلايا عن طريق غسل القوارير مرتين مع الفوسفات المالحة الدافئة التخزين المؤقت (PBS) وتفرخ لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع 10 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25 ٪ ، والتربسين EDTA 0.05 ٪. حالما يتم رفع الخلايا ، يتم وضعها في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام والثقافة ، وطرد (300 X ز لمدة 4 دقائق).
3. بعد الغسيل ، ومعلق الخلايا بتركيز 10 × 10 ⁶ / مل في وسائل الإعلام والثقافة ، والتي سمحت لتلقيح خلايا 50000 / 5 ميكرولتر.
4. وتحفظ الخلايا على الثلج حتى الحقن داخل القحف.

2. دليل المسمار داخل القحف انشقاقه

يمكن أن يتم هذا الإجراء إلى عدة أيام قبل حقن الخلايا. وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة هنا تحت ظروف معقمة صارمة.

1. الفئران (BALB / ج نو / نو الإناث ؛ 5-6 أسابيع ؛ 18G تقريبا) يتم ترقيم لأغراض تحديد الهوية ، وزنه anesthetised مع حقنة (IP) داخل الصفاق من مزيج من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (5 ملغ / كلغ).
2. ومسحت أسفل الجلد بمحلول اليود ، ويتم إجراء شق صغير (2-3 ملم) على طول الجهة اليمنى من خط الوسط الأمامي وحتى خط interaural. الكشف عن خيوط هذه الاكليلية والسهمي من الجمجمة. يتم وضع bregma عند تقاطع هذه الغرز اثنين.
3. ثم يتم وضع علامة على إدخال المسمار دليل نقطة عند نقطة 2.5 مم و 1 مم الوحشي الأمامي للbregma. وتقع هذه النقطة مباشرة فوق نواة المذنب ^1.
4. ومن حفر حفرة ل1 × 1 مم عميقة مع يد معقمة عقد حفر تويست من خلال الجمجمة إلى الجافية.
5. وانسحب بعد ذلك المسمار دليل المعقمة التي ستمتد 1.6 مم تحت السطح الجماجم في الجافية في الحفرة مع سائق المسمار حتى الاحمرار مع الجمجمة (الشكل 1A).
6. بعد ذلك يتم وضع مرود معقمة أو دمية المسمار في حفرة بوسط المسمار دليل لإغلاق الفتحة (الشكل 1B).
7. تعطى إغلاق الجرح مع لاصق الأنسجة Vetbond (ن بوتيل cyanoacrylate) والفئران داخل الصفاق حقنة من reversine (الحيوانات الصغيرة) (0.1 مل / كغ) وكاربروفين (5 mg/kg/100 ميكرولتر) للوعي. ثم يتم السماح الفئران لاسترداد على حصيرة الاحترار (36 درجة مئوية) والذي يمكن أن يستغرق 20 دقيقة. كثيرا ما يتم رصد الفئران والتي لوحظت خلال هذا الوقت حتى يتم استرداد كامل وعيه.

3. engraftment الخلوية داخل القحف

1. ويتم إعداد محقنة معقمة هاميلتون مكبلة من خلال تطبيق حلقة صغيرة من البلاستيك لطرف الإبرة يسمح سوى 2 ملم من إبرة لتوسيع مخرج المسمار دون دليل (1B الشكل). النقطة الأخيرة هي التلقيح لذا 3.5 ملم تحت سطح الجمجمة.
2. أربعة أيام بعد جراحة دليل المسمار ، ومرة ​​أخرى تخدير الفئران هي على النحو الوارد أعلاه (2.1) ويتم إجراء شق صغير فوق المسمار دليل لإزالة مرود.
3. ثم يتم ملء الحقنة هاميلتون معقودة مع 5 ميكرولتر من الخلايا تمتزج جيدا مع الحذر بعدم إنشاء أو وضع أي فقاعات هواء.
4. يتم تأمين مضخة محقنة لنضح ويتم إدخال الإبرة في دليل المسمار (الشكل 1C). هي التي غرست ثم الخلايا بمعدل 30 ميكرولتر للساعة الواحدة.
5. سمح الجهاز الآلي (1D الشكل) لنا لحقن الحيوانات يصل إلى 10 في وقت واحد في معدل تدفق ثابت. ويمكن أيضا أن حقن الخلايا يدويا باستخدام محقنة هاميلتون مكبلة أو بدلا من الحقنة يمكن مقيد اليدين ، في تلميح 200 ميكرولتر ماصة التي تم قلصت بنسبة 3 ملم لتسمح للطرف إبرة لتتجاوز المسمار دليل بمقدار 2 مم. ثم يجب أن يقوم على حقن بوتيرة مطردة ثابتة.
6. عند اكتمال التسريب ، تتم إزالة بعناية المحاقن ويتم استبدال مرود المسمار في الدليل. وأغلقت لاصق الجروح وتعطى الفئران أدوية الانتعاش كما كان من قبل (2.7) ، وسمح لاسترداد على حصيرة الاحتباس الحراري.

4. التحدي العلاجية

1. بعد أربعة أيام من التلقيح U87MG الخلية ، يتم وزن الفئران وقسمت عشوائيا إلى سيطرة الجماعات والعلاج.
2. ونظرا للسيطرة على المجموعة داخل الصفاق (IP) حقن برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر) ، في حين يتم إعطاء مجموعة العلاج من حقنة IP AMG102 (100 ميكروغرام في 100 ميكرولتر من PBS).
3. يتم تكرار الحقن كل يوم الثاني على التوالي لمدة 14 يوما ، أي ما مجموعه 6 حقن (الشكل 2).
4. بعد حقن النهائي ، ويتم رصد الفئران اليومية وزنه كل يوم الثاني على التوالي.
5. وعندما بدأت الفئران لعرض اختلالات عصبية كبيرة (اضطراب التوازن ، والشلل) ، والجفاف ، أو أكثر من 10 ٪ فقدان الوزن أو المحتضرة ، euthanised أنها إنسانية. ثم سجلت هذه نقطة النهاية إنسانية يوما على المنحنى بقاء كابلان ماير.

5. تقييم الكفاءة العلاجية

1. تم إنشاء منحنى بقاء كابلان ماير باستخدام GraphPad بريزم 4.03 ل Windows ؛ GraphPad برامج ، سان دييغو ، كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية ، www.graphpad.com ^3. وتميزت الوفيات أو euthanizations ونقطة النهاية وسجل الأحداث ك 1. سجلت الحيوانات التي بقيت على قيد الحياة في نهاية التجربة وغير الأحداث وسجل ك 0.

6. ممثل النتائج :

بدأت السيطرة على الحيوانات تظهر علامات الاضطراب العصبي وفقدان الوزن 23 يوما بعد التلقيح الأولي من الخلايا. تأخرت كثيرا في هذه المجموعة AMG102 المعالجة لمدة 35 يوما. في الواقع بعد يوم 35 ، 77 ٪ (ن = 7 / 9) كان الموت الرحيم من السيطرة على المجموعة. منحنى البقاء كابلان ماير يدل بوضوح على زيادة كبيرة في البقاء على قيد الحياة في استجابة لAMG102 العلاج (الشكل 3). بعد يوم 70 ، كان 88 ٪ من الفئران التي تم السيطرة الموت الرحيم (ن = 8 / 9) مقارنة ب 37 ٪ (ن = 3 / 8) من AMG102 المجموعة المعالجة. التحليل النسيجي للأدمغة أكد أن جميع الحيوانات 9 في السيطرة على المجموعة الأورام المتقدمة مقارنة ب 3 من 8 AMG102 الفئران المعالجة (الشكل 4).

الشكل 1 : صورة (أ) يظهر داخل القحف المسمار دليل المتمركزة في منطقة تقع مباشرة فوق نواة المذنب. ثم يتم وضع الحقنة مكبلة هاميلتون (محملة مسبقا مع الخلايا) داخل المسمار دليل حتى 2 ملم إبرة يمتد إلى أبعد من توجيه ويتم حقن الخلايا 3.5 ملم داخل نواة المذنب. تتم إزالة في وقت لاحق المحاقن واستبداله مرود (B). يمكن للجهاز ضخ التلقائي (C) لضخ ما يصل الى 10 حيوانات في وقت واحد. يظهر هنا خمس حقن في وقت واحد (D).

الشكل 2 : رسم تخطيطي للبروتوكول الدراسة. تم حقن الخلايا في يوم 0 مع العلاج التي تبدأ يوم 4. تلقى حقنة مراقبة الحيوانات من برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر) الملكية الفكرية في حين أن مجموعة العلاج تلقى حقنة من AMG102 (100 μg/100 ميكرولتر) IP. اعطيت هذه الحقن كل يوم الثاني على التوالي لمدة 10 يوما. وقدمت ما مجموعه 6 الحقن. ثم تم رصد الحيوانات لمدة 70 يوما بحثا عن علامات على الاضطرابات العصبية والجسدية.

الشكل 3 : منحنى كابلان ماير بقاء السيطرة وبمقارنة AMG102 الفئران التي عولجت. تم الحصول على البقاء على قيد الحياة كبيرة بعد العلاج مع AMG102 (ع = 0.005).

الشكل 4 : Microphotographs أقسام الدماغ الاكليلية يتظاهرون تطوير ورم في الحيوانات السيطرة (A) وعدم نمو المخ السرطانية في الحيوانات المعالجة AMG102 (B). شريط المقياس هو 1 ملم.

Discussion

المسمار داخل القحف دليل الأسلوب المعروضة هنا يمكن إنشاء السريع واستنساخه من داخل الجمجمة وxenografts في أيدي أحد الفنيين المدربين الحيوانية ، وبسهولة جدا تنفيذ هذا الإجراء من دون الحاجة لجهاز المجسم. لدينا أسلوب يجمع بين استخدام المسمار دليل ، لتحديد دقيق لمنطقة الدماغ الأكثر ملاءمة لتطوير ورم في الجسم الحي ، ومضخة حقن الآلي التي تسمح للتلقيح في وقت واحد تصل إلى 10 حيوانات في وقت واحد. والتعزيز الداخلي المسمار دليل تستغرق أقل من 5 دقائق لأداء. ضخ الآلي من الخلايا في 30 ميكرولتر / ساعة يستغرق سوى 10 دقيقة لحجم 5 ميكرولتر. هذا يضمن جرعات دقيقة بمعدل ثابت ، ويقلل من خطر الطرد من الخلية إلى منطقة خارج الجمجمة بسبب زيادة الضغط داخل الجمجمة. لقد قمنا أيضا هذا الإجراء مع 10 مجلدات ميكرولتر ولم يلاحظ أي نمو الورم خارج الجمجمة بسبب ارتداد الخلوية. كما مضخة التسريب الآلي كما يسمح بالحصول على تلقيح الحيوانات عدة في وقت واحد يمكننا ضخ ما يصل الى 60 ساعة في الحيوانات مقارنة المجسم الداخلي الذي يقتصر على الحيوانات ما يقرب من 15 ساعة.

الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو موقع دليل المسمار في الجمجمة حيث يحدد موقفه النهائي من الموقع الجزء الأكبر الورم. إذا كان الدليل هو المسمار المركزي للغاية ، وسوف يتم حقن الخلايا في المنطقة بين نصفي الدماغ two حين إذا تم وضع دليل للقدما بعيدا ، لن يتم حقن الخلايا في الدماغ على الإطلاق. ولهذا من الضروري أن تكون دقيقة قدر الإمكان في تحديد مكان وجود دليل 2.5 مم و 1 مم الوحشي الأمامي للbregma ^1. في هذه الدراسة استخدمت لدينا دليل المسمار الصلب ، وعلى الرغم من مسامير دليل البلاستيك وتتوفر أيضا لتلك التي تتطلب دراسات تصوير الدماغ مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو PET ^6. حتى لو كلف مضخة التسريب الآلي باهظة بالنسبة لبعض الجماعات ، لا يزال يتم حقن الخلايا يدويا بسرعة أكبر من النهج المجسم. عموما ، يمكن استخدام هذه السريع ، وطريقة دقيقة وقابلة للتكرار لدراسة دبقي ، نخاعي وأورام جذع الدماغ ^7. وقد تم تنفيذ هذا الإجراء على أكثر من 500 فئران المختبرات بين بلدينا مع الوفيات الناجمة عن ردود الفعل غير متوقعة مخدر (<1 ٪). وكانت الفئران التي انسحب مع المسمار دليل وغرست في وقت لاحق مع خلايا لم يموتوا أو تعاني من أي مضاعفات عصبية نتيجة لهذا الإجراء. وقد نجا الحيوانات الماضي 100 يوما من دون أي مضاعفات. وعلى الرغم من أننا يفضل استخدام ماوس أصلع ، ماوس المناعية للخطر مع الشعر مثل SCID تكون مجرد مناسبة شريطة أن إزالة الشعر الجمجمة قبل الجراحة للحفاظ على موقع نظيفة ومنع التداخل مع الشعر المسمار الدليل.

هناك العديد من العلاجات الجديدة التي يجري تطويرها حاليا لعلاج دبقي ^8-10. وأظهرت مؤخرا أننا يمكن تحت الجلد U87MG xenografts دبقي تثبطها المعاملة مع AMG102 ³ ؛ الأجسام المضادة الموجهة إلى أنسنة HGF يخضع حاليا لتقييم سريري في دبقي ^5. استخدمنا أسلوب تصف هنا لإنشاء الأورام داخل الجمجمة U87MG في أدمغة الفئران عارية. دراستنا تبين بوضوح مدى فائدة الطريقة ويوضح أن كثيرا من AMG102 يثبط نمو xenografts U87MG مثلي. وسوف نواصل استخدام هذا النموذج لتحديد ما يمكن أن تستخدم العلاجات الأخرى في تركيبة مع AMG102 الحصول على تثبيط أكثر فعالية لنمو الورم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات (اختياري)
DMEM/F12	Invitrogen	12634010
FCS	Bovogen	SFBS
التربسين	Invitrogen	15050065
EDTA	سيغما	E6758
BALB / ج نو / نو الفئران	ARC بيرث
المسمار هولدر	البلاستيك واحد	SD - 1
حفر هولدر	البلاستيك واحد	DH - 1
قطعة من قماش الدريل القطني	البلاستيك واحد	D # 60
المسمار دليل (معدن)	البلاستيك واحد	C212SG
الدمية المسمار (القلم)	البلاستيك واحد	C212SD
الحقنة هاميلتون (10 ميكرولتر إبرة عزز 26g)	نعمة شعبة العلوم ديسكفري	80075
مضخة التسريب الدكتوراه 22/2000	جهاز هارفارد	70-2003	اختياري
Vetbond	3M	1469SB
لوحة الحرارية	جهاز هارفارد	340390