Basit Fare İntrakranial Xenograftlarında Çalışmaları Kılavuzu Vida Yöntemi

Özet

Glioma tedavisi için yeni tedavi paradigmalar değerlendirmek için, fizyolojik ilgili modeller gereklidir. Biz stereotaktik yaklaşımlar daha hızlı ve daha güvenli bir intrakranial xenograft modelleri kurulması için implante edilebilir bir kılavuz vida prosedürü kullanır.

Özet

Insan tümör hücreleri bağışıklık farelerin beyin içine aşılama çalışması için, glioblastoma (glioma) ve medulloblastom beyin kanserleri dahil olmak üzere kurulmuş bir yöntemdir. Yaygın olarak kullanılan stereotaktik yaklaşım, sadece tek bir seferde hayvan enjeksiyon için, emek yoğun ve son derece özel ekipman gerektirir. Başlangıçta, Lal ve ^{arkadaşları,} 1 tarafından geliştirilen kılavuz vida yöntemi, hantal stereotaktik prosedürleri ortadan kaldırmak için geliştirilmiştir . Şimdi hızlı ve son derece güvenli, modifiye edilmiş bir kılavuz vida yaklaşım tarif, her ikisi de kritik etik kaygılar. Özellikle, bizim prosedür şimdi tümör hücreleri ile aynı anda enjekte edilmek üzere 10 hayvan sağlayan bir infüzyon pompası içermektedir.

HGF / dağılım faktörü şu anda klinik ^{değerlendirme} 2-5 geçiren bir insan antikor; bu prosedürün yardımcı programı göstermek için, biz sonra AMG102 ile tedavi edilen farelerde intrakranial xenografts olarak insan U87MG glioma hücreleri kurdu . AMG102, Sistemik enjeksiyon intrakranial U87MG xenografts tüm farelerin hayatta kalma önemli ölçüde uzun süreli ve tam kürleri bir dizi sonuçlandı.

Bu çalışmada, kılavuz vida yöntemi intrakranial xenografts kurmak için ucuz, yüksek tekrarlanabilir bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Ayrıca, beyin kanserlerinin tedavisinde yeni tedavi stratejilerinin doğrulamak için ilgili fizyolojik bir model sunar.

Protokol

1. Hücre dizileri

1. U87MG glioma hücrelerinin% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM-F12 ile büyük doku kültürü şişeleri kültür.
2. Hücreler şişeler sıcak Fosfat ile iki kez yıkanarak hasat Tamponlu Salin (PBS) ve 37 ° kuluçka ° C,% 0.25 'lik tripsin ve% 0.05 EDTA içeren 10 ml PBS ile 5 dakika. Bir kez hücreleri içeren bir kültür ortamı ve santrifüj (4 dakika için 300 X g) 10 ml 50 ml tüp yerleştirilir kaldırılır.
3. Yıkama sonrasında, hücrelerin 10 konsantrasyonda yeniden süspanse x 10 ⁶ / ml ul 50.000 hücre / 5 bir aşılama için izin verilen kültür ortamı,.
4. Hücreler intrakranial enjeksiyon kadar buz üzerinde tutulur.

2. Intrakranial Rehberi vida civatalama

Bu prosedür, hücre enjeksiyonu öncesinde birkaç gün yapılabilir. Burada açıklanan tüm prosedürler katı steril koşullar altında yapılmaktadır.

1. Fare (nu BALB / c / nu kadın, 5-6 hafta yaklaşık 18g), tanıtım amaçlı numaralı tartılır ve ketamin (100 mg / kg) ve ksilizin (5 mg karışımı intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile anesthetised / kg).
2. Cilt iyot çözeltisi ile silinir ve küçük bir kesi (2-3 mm), orta hat ve interaural çizgi anterior sağ tarafı boyunca yapılır. Bu kafatasının koronal ve sagital sütür ortaya koyar. Bregma, bu iki sütür kavşakta konumlandırılmış.
3. 2,5 mm lateral ve bregma anterior 1 mm bir noktadan sonra kılavuz vida giriş noktası işaretlenir. Bu nokta, doğrudan kaudat ^nükleus 1 yukarıda yer almaktadır .
4. 1 x 1 mm derin delik dura kafatası yoluyla twist drill düzenlenen steril bir eli ile delinmiş.
5. Dura içine kafatasları yüzeyinin altında 1.6 mm uzatacaktır sterilize kılavuz vida sonra bir tornavida ile delik içine cıvatalı kafatası (Şekil 1A) ile aynı hizada kadar.
6. Steril bir stile veya vida kukla sonra açılması (Şekil 1B) kapatmak için kılavuz vida merkezi deliğe yerleştirilir.
7. Yara Vetbond Doku Yapıştırıcı (n-butil siyanoakrilat) ve fareler ile kapatılır reversine bir intraperitoneal enjeksiyon (küçük hayvanlar) (0.1 ml / kg) ve analjezi carprofen (5 mg/kg/100 ul) verilmiştir. Fare sonra 20 dakika kadar sürebilir bir ısınma mat (36 ° C) kurtarmak için izin verilir. Tamamen bilinçli kadar Fare sık sık izlenir ve bu kurtarma süre içinde gözlenir.

3. İntrakranial hücresel engraftman

1. Steril kelepçeli Hamilton şırınga, iğne ucu kılavuz vida çıkışı (Şekil 1B) altında genişletmek için sadece 2 mm iğne sağlayan küçük plastik bir halka uygulanarak hazırlanmıştır. Bu nedenle, son aşılama noktası kafatası yüzeyinden 3.5 mm altında.
2. Dört gün kılavuz vida cerrahisi sonrası, farelerin yukarıdaki gibi tekrar anestezi (2.1) ve stile kaldırmak için kılavuz vida üzerinde küçük bir kesi yapılır.
3. Kelepçeli Hamilton şırınga sonra 5 ul herhangi bir hava kabarcığı oluşturabilir veya yukarı çekmek için önlem alarak iyice karıştırılır hücrelerinin ile doludur.
4. Şırınga perfüzyon pompa güvenli ve iğne kılavuz vidasını (Şekil 1C) eklenir. Hücreler daha sonra saatte 30 ul hızında infüze.
5. Otomatik cihazları (Şekil 1D), sabit bir akış hızında bir kerede bize 10 hayvanlara enjekte etmek için izin verdi. Hücreler aynı zamanda kelepçeli hamilton şırınga kullanılarak elle enjekte edilebilir ya da alternatif şırınga, iğne ucu 2 mm kılavuz vida ötesine izin 3 mm koparılmış 200 ul pipet ucu tarafından kelepçeli olabilir. Enjeksiyonu sonra sürekli bir sabit hızda yapılmalıdır.
6. Infüzyon tamamlandığında, şırınga dikkatlice çıkarılır ve stile kılavuz vida değiştirilir. Yara kapalı yapıştırılmış ve fareler (2.7) daha önce olduğu gibi kurtarma ilaçlar verilir ve bir ısınma mat kurtarmak için izin verilir.

4. Terapötik meydan okuma

1. Dört gün U87MG hücre aşılama sonra, fare tartılır ve rastgele kontrol ve tedavi grupları ayrılmıştır.
2. Tedavi grubunda AMG102 (PBS 100 ul 100 mikrogram) bir IP enjeksiyonu ise kontrol grubu, PBS (100 ul) bir-periton içi (IP) enjeksiyonu.
3. Enjeksiyonlar, 14 gün boyunca her iki günde toplam 6 enjeksiyonları (Şekil 2) bir tekrarlanır.
4. Son enjeksiyondan sonra, farelerin günlük olarak izlenmekte ve her ikinci gün tartılır.
5. Farelerde ciddi nörolojik işlev bozuklukları (denge bozukluğu, felç), dehidratasyon, ya da% 10'dan fazla kilo kaybı ya da can çekişen gösterilecek başladığında, onlar insanca ötenazi uygulandı. Bu insani bir uç nokta gün sonra, Kaplan-Meier sağkalım eğrisi kaydedildi.

5. Tedavi verimliliğinin değerlendirilmesi

1. GraphPad Yazılım, Windows için GraphPad Prism 4.03 San Diego Kaliforniya ABD, Kaplan-Meier sağkalım eğrisi kullanılarak oluşturulan www.graphpad.com ^3. Ölümler veya euthanizations son nokta olayları olarak işaretlenir ve 1 olarak puanlandı. Deneyin sonunda kurtuldum Hayvanlar olmayan olaylar olarak kaydedilir ve 0 olarak skorlandı.

6. Temsilcisi sonuçları:

Kontrol hayvanların hücrelerinin ilk aşılama sonrası nörolojik bozukluğu ve kilo kaybı 23 gün belirtileri göstermeye başladı. Bu önemli ölçüde, 35 gün AMG102 tedavi grubunda ertelendi. Gerçekten de 35 günde,% 77 (n = 7 / 9), kontrol grubunda ötenazi olmuştu. Kaplan-Meier sağkalım eğrisi açıkça AMG102 tedavi (Şekil 3) yanıt sağkalım önemli bir artış göstermektedir. 70 gün, kontrol farelerin% 88,% 37 ile karşılaştırıldığında (n = 8 / 9) ötenazi olmuştu AMG102 tedavi edilen grupta (n = 3 / 8). Beyinleri histolojik analiz, kontrol grubunda ise tüm 9 hayvanlar gelişmiş tümörler sadece 3 8 AMG102 tedavi edilen farelerde (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında doğruladı.

Şekil 1: Görüntü (A) doğrudan kaudat nükleus üstünde yer alan bir alanda konumlandırılmış intrakranial kılavuz vida gösterir. 2 mm iğne kılavuzu ötesine uzatır ve böylece hücreler kaudat nükleus içinde 3,5 mm enjekte edilir kelepçeli hamilton şırınga (hücreleri ile önceden yüklenmiş) sonra kılavuz vida içine yerleştirilir. Şırınga sonra bir stile (B) tarafından kaldırılır ve değiştirilir. Otomatik infüzyon cihazı (C) bir defada 10 hayvanlara enjekte edebilir. Simültane beş enjeksiyonları (D) burada gösterilir.

Şekil 2: Şematik Çalışma protokolü. Hücreler, tedavi günde 4 başlamadan gün 0 enjekte edildi. Kontrol hayvanlar PBS (100 ul) IP enjeksiyon tedavi grubunda AMG102 (100 μg/100 ul) IP enjeksiyon alırken aldı. Bu enjeksiyonlar, 10 gün boyunca her ikinci gün verildi. Toplam 6 enjeksiyonları verildi. Hayvanlar daha sonra nörolojik ve fiziksel bozuklukları belirtileri açısından 70 gün süreyle takip edildi.

Şekil 3: Kaplan-Meier sağkalım eğrisi kontrolü ve AMG102 tedavi edilen farelerde karşılaştırarak. Anlamlı sağkalım AMG102 (p = 0.005) tedavi sonrasında elde edildi.

Şekil 4: koronal beyin bölümlerinin kontrol hayvanlarda tümör gelişimi (A) ve AMG102 tedavi hayvanlarda hiçbir beyin tümörü geliştirme (B) gösteren Microphotographs. Ölçek çubuğu 1 mm.

Tartışmalar

Burada sunulan intrakranial kılavuz vida yöntemi intrakranial xenografts hızlı ve tekrarlanabilir kurulmasını sağlar ve eğitimli bir hayvan teknisyen elinde, bu işlem çok kolay bir stereotaktik cihaz için gerek kalmadan yapılır. Bizim yöntemi doğru in vivo tümör gelişimi için en uygun beyin bölgesi ve bir seferde 10 hayvanların aynı anda aşılama sağlayan otomatik bir infüzyon pompası bulmak için bir kılavuz vida kullanımı birleştiriyor. Kılavuz vida büyütme yordamı gerçekleştirmek için en az 5 dakika sürer. 30 ul / saat hücre otomatik infüzyon 5 ul hacmi için sadece 10 dakika sürer. Bu sabit bir oranda doğru dozaj sağlar ve artmış intrakranial basınç nedeniyle ekstra kranial alana hücre çıkarılma riskini azaltır. Ayrıca 10 ul hacimli bu yordamı var ve hücresel reflü nedeniyle herhangi bir ekstra kranial tümör büyüme görülmez. Otomatik infüzyon pompası aynı zamanda çeşitli hayvanların, saatte yaklaşık 15 hayvan sınırlı bir stereotaktik prosedüre göre saatte 60 hayvanlara enjekte edebilir aynı anda inoküle olması elverdiğince.

Konumunu tümör toplu nihai konumunu belirleyen en önemli adım olarak, bu yordamı kafatası kılavuz vida konumudur. Kılavuz vida çok merkezi ise, hücreler kılavuzu ileriye doğru yerleştirilir ise iki beyin hemisfer arasında bir bölgeye enjekte edilecektir, tüm hücrelerin beyin içine enjekte edilir olmaz. Bu kılavuz yanal 2.5 mm ve 1 mm bregma ¹ anterior bulmak mümkün olduğunca doğru olması çok önemlidir. Plastik bir kılavuz vida gibi MR veya PET ⁶ gibi beyin görüntüleme gerektiren çalışmalar için de kullanılabilir olmasına rağmen, bu çalışmada biz, bir çelik kılavuz vida kullanılır. Otomatik infüzyon pompası, bazı gruplar için engelleyici maliyet olsa bile, hücreler hâlâ elle daha hızlı stereotaktik yaklaşımlar daha enjekte edilebilir. Genel olarak, bu hızlı, doğru ve tekrarlanabilir bir yöntem glioma, medulloblastom ve beyin sapı ^tümörleri 7 incelemek için kullanılabilir . Bu prosedür iki laboratuarlar arasında beklenmedik anestezi reaksiyonları (<% 1) bağlı ölümlerin 500 fareler üzerinde yapılmıştır. Fare kılavuz vida ile sabitledim ve hücreler, herhangi bir nörolojik komplikasyonlara prosedürün bir sonucu olarak ölmek ya da zarar vermedi ile sonradan infüze edildi. Hayvanlar herhangi bir komplikasyon olmadan 100 gün geçmişte kalmıştır. SCID gibi saçlı tüysüz bir fare, immün yetmezlikli fare kullanmayı tercih rağmen uygun kafatası saç sitesi temiz tutmak ve kılavuz vida ile müdahale saç önlemek için ameliyat öncesi kaldırıldı gibi olurdu.

Glioma ^8-10 tedavisi için geliştirilmiş olan birçok romanı terapötikler vardır. Yakın zamanda subkutan U87MG glioma xenografts AMG102 ³ ile tedavisi ile inhibe edilebilir olduğunu gösterdi; humanize antikor glioma ⁵ klinik değerlendirme yapılan HGF yönetti. Biz çıplak farelerin beyinlerinde, intrakranial U87MG tümörlerin kurmak yöntemi tanımlamak için kullanılan. Bizim çalışmamız açıkça yöntemin yararını gösterir ve AMG102 ortotopik U87MG xenografts büyüme önemli ölçüde inhibe ettiğini göstermektedir. Biz daha etkili tümör büyüme inhibisyonu elde etmek için diğer terapötikler AMG102 ile birlikte kullanıldığında ne belirlemek için bu modeli kullanmaya devam edecektir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
DMEM/F12	Invitrogen	12634010
FCS	Bovogen	SFB'ler
Tripsin	Invitrogen	15050065
EDTA	Sigma	E6758
Balb / c nu / nu fareler	ARC Perth
Vidalı Tutucu	Plastik Bir	SD-1
Matkap Tutucu	Plastik Bir	DH-1
Matkap ucu	Plastik Bir	D # 60
Vida kılavuzu (metal)	Plastik Bir	C212SG
Vida Dummy (stylus)	Plastik Bir	C212SD
Hamilton Şırınga (10 ul 26g çimentolu iğne)	Grace Bölümü Discovery Science	80075
PHD 22/2000 infüzyon pompası	Harvard Apparatus	70-2003	Isteğe bağlı
Vetbond	3M	1469SB
Thermo pedi	Harvard Apparatus	340390