التصوير رائحة مستدعى الأنشطة في لمبة الماوس الشم باستخدام الانعكاس الضوئية وإشارات تألق ذاتي

Summary

هذا المقال يعرض بروتوكولات الإشارات الضوئية الذاتية وتألق ذاتي flavoproteins إشارات التصوير لأنشطة رائحة أثارت الخريطة على سطح البصلة الشمية في الفئران.

Abstract

في المخ وينشط الحواس توزيع السكان بين الخلايا العصبية التي تشارك وحدات وظيفية للترميز من التحفيز. تقنيات التصوير الضوئي وظيفية هي مفيدة لتصور تفعيل هذه الوحدات في القشور الحسية مع القرار المكانية العالية. في هذا السياق ، الإشارات الضوئية الذاتية التي تنشأ عن الآليات الجزيئية مرتبطة neuroenergetics هي على النقيض من مصادر قيمة لتسجيل الخرائط المساحية من المحفزات الحسية على حقول واسعة في الدماغ القوارض.

هنا ، نقدم اثنين من التقنيات القائمة على التغيرات في الخصائص البصرية الذاتية للأنسجة المخ أثناء التنشيط. ويتم إنتاج أول الإشارات الضوئية الجوهرية (IOS) عن طريق تغيير المحلية في انعكاس الضوء الأحمر للأسباب التالية : (ط) من خلال استيعاب التغيرات في مستوى الأوكسجين في الدم وحجم الدم (II) الفوتون نثر. بدأ استخدام في الجسم الحي IOS لتسجيل الخرائط المساحية في منتصف عام 1980 مع observatiعلى الخرائط البصرية للبرميل الطولي في الفئران وأعمدة التوجه في القشرة البصرية القط ^1. وقد تجلى لاحقا IOS التصوير من سطح البصلة الشمية القوارض الرئيسي (OB) استجابة لodorants من قبل مجموعة لاري كاتز ^2. النهج الثاني يعتمد على الإشارات بروتين فلافيني تألق ذاتي (FAS) وذلك بسبب التغييرات في حالة الأكسدة هذه سيطة الأيضية الميتوكوندريا. أكثر تحديدا ، وتستند هذه التقنية على مضان أخضر بسبب حالة من flavoproteins عندما تتأكسد هو متحمس النسيج مع ضوء أزرق. على الرغم من أن هذه الإشارات ربما كانت بين جزيئات الفلورسنت سجلت أول لدراسة نشاط الدماغ عن طريق الدراسات رائدا من احتمالات بريتون وزملاؤه ³ ، فإنه لم يكن حتى وقت قريب التي تم استخدامها لرسم خرائط لتنشيط الدماغ في الجسم الحي. وكان أول تطبيق FAS التصوير إلى القشرة الحسية الجسدية في القوارض استجابة لتحريض من قبل مجموعة hindpaw Katsuei Shibuki ^4.

نظام حاسة الشم هي من الأهمية المركزية لبقاء الغالبية العظمى من أنواع الكائنات الحية لأنه يتيح الكشف عن كفاءة وتحديد المواد الكيميائية في البيئة (الغذاء والحيوانات المفترسة). الحريق المكشوف هو التتابع الأولى من معالجة المعلومات الشمية في الدماغ. يتلقى التوقعات وارد من الخلايا العصبية الحسية الشمية الأولية التي تكشف عن جزيئات الرائحة المتطايرة. كل الخلايا العصبية الحسية عن نوع واحد فقط من مستقبلات الرائحة والخلايا العصبية التي تحمل نفس النوع من العمليات ترسل مستقبلات أعصابهم لمتناهية الصغر واضحة المعالم نفسه من ³ 100μm ~ مؤلفة من neuropil منفصلة ، والكبيبة الشمية (الشكل 1). في العقد الماضي ، عزز IOS التصوير استكشاف الفنية للOB ^{5 و 6 و 7} والتي أصبحت واحدة من أكثر هياكل الحسية التي شملتها الدراسة. لم يتم تعيين النشاط OB مع التصوير FAS يؤديها حتى الان.

هنا ، ثه تبين الخطوات المتتالية لبروتوكول فعال لIOS والتصوير FAS لرسم خريطة للرائحة أثار الأنشطة في OB الماوس.

Protocol

1. تستعد لتصوير الحيوان (وفقا للتوصيات الأوروبية للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ، والتوجيه 86/609/EEC)

1. 6 إلى 8 أسابيع من العمر C57BL6 الفئران الذكور تخدير مع مزيج من الكيتامين (10mg/kg) وزيلازين (100mg/kg) حقن intraperitonealy. الجراحة عندما يبدأ الفأر لم يعد يستجيب لhindpaw قرصة. خلال التجربة بأكملها يتم وضع الحيوان على وسادة التدفئة. وترصد باستمرار درجة حرارة الجسم والمحافظة عليها في 37 درجة مئوية. يتم الاحتفاظ عمق التخدير طوال الجراحة والتصوير الدورة عن طريق التحقق من عدم وجود طرف الانسحاب. يدار إلا حقنة تحت الجلد من 20 ٪ من كوكتيل مخدر الأولية.
2. استخدام كليبرز ، وإزالة الشعر من فروة الرأس. تنظيف البشرة المكشوفة من الشعر المتبقية باستخدام شاش معقم غارقة مع المالحة.
3. ضع الماوس في إطار التجسيمي. الخطم يجب ان تكون في نفس الطائرة والجزء الخلفي من الرأس ،من أجل تعيين سطح البصلة الشمية إلى أفقي. آمن بقوة الأذن والأنف القضبان من أجل منع الحركات أثناء التصوير.
4. تطبيق مرهم عيني على عيني الحيوان لمنع جفاف والألم.
5. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الايثانول · 70 ومنطقة فروة الرأس مع الاحتلالات المتعاقبة betadine.
6. لإزالة الجلد الذي يغطي الجمجمة ، تبدأ من خلال إجراء شق في الجلد مع مقص في الجزء الخلفي من الرأس بين الأذنين. ثم قص في كلا الجانبين من أجل قاعدة الأذن وفي الاتجاه الأمامي الخلفي نحو جبهته على طول الجفون. الانتهاء من ازالة فروة الرأس عن طريق قطع الجلد في أعلى الخطم على مقربة من الشريط الأنف.
7. مجهر تحت الملاحظة ، واستخدام مسحة القطن المنقوع بمحلول ملحي لفصل السمحاق بلطف على الجزء العلوي من الجمجمة. استخدام زوج من الملقط لإزالة الأنسجة المتبقية وكشط سطح الجمجمة مع مشرط أن يكون لها إعداد نظيفة.
8. الحريق المكشوف هو بنية متماثل تتكون من اثنين من hemibulbs التي تقع بين الجفون. تكون محدودة في منقاري والذيلية في الاتجاه من جانب الجيب الوريدي ، ومفصولة الدرز السهمي. ضع قطعة من الإسفنج امتصاص الجيلاتين المنقوع بالماء المقطر على العظم فوق OB. فمن المهم للحفاظ على هذا المجال العظام رطبة طوال التجربة.

2. إعداد إطار الجمجمة

1. إزالة الاسفنجة الجيلاتين وتبدأ من خلال كشط العظام برفق مع شفرة ن 10 ° مشرط. الحفاظ على زاوية 45 درجة ثابتة من بين النصل والعظام ، ونقل شفرة من الجفون إلى الجانب السهمي للمنطقة بصلة. لا تنطبق الضغط العمودي على العظام أو خدش العظم فوق الجيب الوريدي.
2. أثناء عملية ترقق ، ووقف كل مكان و5min اسفنجة رطبة الجيلاتين على العظم لتهدئة التحضير. المسحة الجمجمة مع الإسفنج لإزالة الغبار العظام.
3. وتبقي كاسحةبدلا من التبريد حتى في تصور ترابيق ، وطبقة العظم الإسفنجي. يجب على الأوعية الدموية الدقيقة للOB تكون مرئية في هذه المرحلة. وقف خدش العظام ، والبدء في استخدام مشرط لترجيح كفة عموديا "لرسم" مساحة مستطيلة إحاطة OB. ويمكن في هذه المرحلة يمكن استخدام رقم 11 شفرة المشرط. إبقاء عملية جراحية في حدود الجيوب الوريدية التي ينبغي أن يكون في مأمن من أي ضربة مشرط.
4. حفر الخندق تدريجيا شكلت مستطيل باستخدام الاقتراحات المتتالية لمشرط. مسح غيض من مشرط دوريا لتنظيفه والحفاظ عليه حاد. المزيد من الحذر من عمق طرف لتجنب لمس السطح الجافية.
5. من أجل الحصول على شعور من سماكة العظام المتبقية ، ودفع برفق مع غيض من زوج من الملقط. إذا طيات رفرف العظم تحت الضغط ، والانتقال الى الخطوة التالية.
6. تحت قطرة من المياه المالحة ، واستخدام غيض من التوجه مشرط أفقيا لرفع رفرف العظام. إزالة الغطاء الذي ينبغي القيام به جarefully لتجنب تمزيق قبالة العظام المتبقية.
7. مرة واحدة يتعرض سطح OB ، والتحقق من عدم وجود أي نزيف الدم أو مفاغرة السفن. وجرح الجافية أو على سطح النسيج تقلل من فرص الحصول على الاشارات الضوئية. مسح المنطقة مع اسفنجة الجيلاتين المنقوع في المياه المالحة من أجل الحفاظ على رطوبة مبة.
8. تنطبق الأسنان الاسمنت polyacrylate لتشكيل جيدا على العظم حول النافذة.
9. ضع قطرة من انخفاض درجة انصهار agarose (1.2 ٪) خلال الجافية ، ووضع غطاء زجاجي معقم في أبعاد النافذة. خلال دورة التصوير ، يمكن إضافة كمية صغيرة من agarose لتعويض الجفاف. سوف Agarose منع OB من التحرك مع التنفس ، وسوف توفر سطح مستو للتصوير الضوئي.

3. التصوير الضوئي الإعداد لرسم خرائط النشاط الشمية

1. يجب تحفيز حاسة الشم محددة بدقة في الوقت وكثافة عن طريق استخدام لolfactometer. نحن نستخدم نسخة معدلة من العرف multivial نضح نظام Valvebank 8II من أتمتة العلمية المرتبطة ضاغط الهواء الأساسية (ستكون مناسبة للتنفس الهواء المضغوط أيضا). هذا النظام يسمح للدقيق وسريع صمام التحكم الخارجية. مخففة حلول الرائحة النقية في الزيوت المعدنية في التركيز المختار. لتنشيط الألدهيدات الظهرية OB مثل hexanal يشيع استخدامها. يتم تحميل وحدة تخزين الدقيق للالرائحة المخفف (20 إلى 50μl) على ورقة الترشيح وضعت في خزان المحاقن. من خلال نظام التروية ، يتم تسليم ضغط الهواء للرقابة على النظام ، وضمان ثبات معدل تدفق الهواء odorized التسليم للأنف الحيوان أثناء فتح الصمام. يتم تسليم الرائحة عن طريق الأنابيب Tygon R - 3603 كهربائية (شركة سان جوبان) تحمل الهواء بمعدل تدفق 1000ml/min ~. تجنب التلوث بين odorants والكميات المتبقية من الرائحة في الأنبوب. إذا كانت متوفرة ، يمكن استنساخ ليكون حافزا الرائحة كنترولlled من خلال استخدام لهب كاشف التأين (microFID Photovac 2020).
2. قيد الإعداد البصرية جرا. وهو يتألف من 12 بت تبريد المتداخلة CCD الكاميرا (ORCA هاماماتسو AG) المرتبطة stereomicroscope مضان (لايكا MZ16) ، وolfactometer الكمبيوتر التي تسيطر عليها الإثارة ومصابيح استقر مع مرشحات مناسبة تدخل ممر الموجة. ويرد وصف خطة الإعداد لدينا في الشكل 2. لتوصيل الإشارات الضوئية الجوهرية التصوير (IOSI) ، ومصباح الهالوجين التنغستن 200W (اوريل QTH) إلى جانب وجود ضوء حلقة الألياف (شوت) حول الهدف المجهر تستخدم لتوفير الإضاءة مستقرة وحتى. تألق ذاتي للبروتين فلافيني اشارات التصوير (الفاسي) ، مصباح معدن هاليد 150W (لايكا) مع دليل الأساسية 5mm الضوء السائل توفر الإثارة حتى مترجم من مضان من خلال منفذ EPI - الإضاءة لstereomicroscope.

   تتحقق الحصول على الصور وتزامن الأجهزة بواسطة برامج مخصصة. ق المفتوحةويمكن أيضا ource البرمجيات Micromanager أن تستخدم للسيطرة على الإعداد البصرية والاستحواذ.

4. التصوير الضوئي

1. وضع الإطار التجسيمي تحت stereomicroscope ، نافذة الجمجمة تركزت في مجال الرؤية (انظر الشكل 2A عن التخطيطي من الإعداد البصرية).
2. توليف المجهر التركيز على الشعيرات الدموية. قبل المحاكمات التحفيز (انظر الوصف في 5) يتم أخذ صورة لمبة تحت الضوء (الأخضر) 560nm (حلقة الألياف) التي تنص على النقيض جيدة لتصوير الأوعية الدموية. يتم استخدام هذه الصورة كعنصر تحكم التشريحية للتحقق من حالة إعداد ويكتسب عدة مرات أثناء التجربة.
3. IOS للتصوير ، والتي ترد يتم تسجيل شدة الضوء بواسطة الكاميرا CCD تحت 630 + / -10 نانومتر (الأحمر) الإضاءة. يتم الحصول على الصور في الإطار الكامل (لا binning) في 5 إطارات في الثانية الواحدة والتي تتوافق مع وقت التعرض من حوالي 150ms. يتم ضبط قوة مصدر للضوء لإعادة ACH مستويات الرمادي 3000 ~ على الأقل في منطقة اوبي ، على مقربة من التشبع من الآبار بكسل CCD. القيام بذلك يجعل من الممكن الاستفادة من الديناميات 12bits من CCD لالتقاط التغيرات شدة بالاغماء خلال التنشيط. سعة تصل إلى أقصى IOS ~ 1 ٪.
4. لFAS التصوير الاستشعاع المكتسبة في إطار من الإثارة 480nm + / - 20nm (الأزرق) epiflurorescence الخفيفة. تم تعيين مرشح عالية في تمرير ما يصل الى 515nm التقاط الضوء. يتم الحصول على الصور في 5 إطارات في الثانية مع binning من 4 من 4 إلى تحقيق أقصى قدر من الحساسية. يتم ضبط قوة الإثارة الخفيفة على غرار IOS مع مستويات الرمادي 3000 على منطقة اوبي. سعة تصل إلى أقصى FAS ~ 3 ٪.

   لكل من طرائق التصوير وعمق الميدان في الطائرة تخضع هي نفسها ، وكان في قياس 0.5 ملم لتكبير 4 مرات تقريبا.

5. وينبغي أن تتحول قبالة ضوء التجارب بين التصوير لتجنب التدفئة وphotobleaching من التحضير.

لو "> 5. المحاكمات التصوير

1. وشملت الدورة معيار التصوير الأساس من 5 إلى 10S حيث يتم تسليم الهواء فقط ، تليها التحفيز الرائحة لمدة 3 إلى 10S اعتمادا على تركيز الرائحة المختارة ، و 70 الى 82s تسجل مزيدا من تدفق الهواء المستمر لاسترداد خط الأساس (الشكل 2A). في نهاية المحاكمة ، يتم تشغيل ضوء قبالة ويتم تسليم الهواء النقي لمدة المحاكمة الفاصل بين (1-3 دقائق) لتغسل رائحة الجزيئات المتبقية وتجنب التعود الحسية. وكانت المحاكمات معشق مع رائحة المحاكمات فارغة (التسليم الهواء).
2. رائحة أثار تنشيط مناطق هي تصور باعتبارها مناطق كروية تقريبا على الخرائط وتتوافق مع حجم كبيبات الفردية (80 الى 200μm قطرها ^9). وأوضح ومعالجة الصور في الشكل 2B. وتعرض الخرائط الشمية في الشكل 3. على عكس أي نظام الحسية الأخرى ، كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء في OB كافية لحل رائحة أثار ردود في المحاكمات واحد (التين. 3B للIOS والشكل. 3D لFAS).
3. يصرح باستخدامها على الفور الفئران في نهاية الدورة باستخدام أساليب التصوير وفقا للتوصيات الأوروبية للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

6. نتائج ممثل (انظر خرائط شمية في الشكل 3) :

الشكل 1 التنظيم الهيكلي لمبة والشمية الرئيسية في القوارض. العصبونات الحسية الشمية ، والخلايا الحسية الابتدائية الواقعة في الظهارة الشمية الرئيسية لل، تعبر عن مستقبلات الرائحة نفسها ، وتتلاقى في كبيبات على نفسه في الحريق المكشوف. وتقع كبيبات الشم ، وneuropils مستديرة الشكل (دوائر متقطع) ، على سطح OB. علما أن وجود شبكة كثيفة جدا ومعقدة الأوعية الدموية موجودة على مستوى الكبيبي. المختصرات (أعلى / أسفل) : y. قل : العصب الشمي طبقة ؛ GL : طبقة الكبيبي ، EPL : طبقة ضفيري الخارجية ؛ MCL :المترالي طبقة الخلية ؛ GCL : الخلية الحبيبية طبقة.

الشكل 2 الانعكاس وإشارات مضان تسجيل في الجسم الحي. ألف واسعة المجال الإعداد التصوير الضوئي. يتعرض الدماغ لتخدير الماوس إما حمراء (IOS) أو أزرق (FAS) الضوء إما من خلال حلقة من حلقات الألياف الحلقي المرفقة العدسة البصرية أو منفذ البرنامج الموسع للتمنيع ، إضاءة المجهر. يتم تحميل الروائح في قوارير مختومة ويتم تسليم odorized الهواء إلى الأنف الحيوانية (ضوء أخضر : فتح صمام). باء تسجيل البروتوكول ومعالجة البيانات. وتسجل IOS وفاس وسلسلة من التجارب الفردية (90s المدة). الرسم البياني يوضح الجدول الزمني للمحاكمة واحدة : الأساس تختلف من 5 إلى 10S ، والتحفيز في الفترة من 3 إلى 10S ، والعودة إلى الأساس من 70 إلى 82s. معالجة الصور يتطلب بكسل حسب بكسل الطرح القيم كثافة خلال خط الأساس لقيم الكثافة خلال فترات من التحفيز (للFAS) سص التحفيز بالإضافة إلى العودة إلى الأساس (لIOS). ثم يتم تقسيم هذه الفرق من القيم الأساسية للحصول على التباين في المائة (انظر الصور الناتجة في الشكل 3).

الشكل 3 - رائحة أثار خرائط النشاط في التوليد والتصوير باستخدام IOS فاس. تصور ألف الأوعية الدموية للOB الظهرية تحت الضوء الاخضر. ق. IOS المصورة (محاكمة واحدة مقابل ثلاث محاكمات في المتوسط ​​على التوالي) لعرض تقديمي 10S hexanal من 20 ٪. سهام بيضاء تشير إلى المناطق ذات الاهتمام الكروي تفعيلها من خلال هذه الرائحة. وقد تم الحصول على هذه الخرائط باستخدام إطارات التنشيط المتوسط ​​خلال الثانية الأولى بعد انتهاء التحفيز رائحة (بحد أقصى ٪ -0.63 انعكاس التباين في و-0،52 ٪ في باء). علما المناطق السوداء من حيث تفعيل الامتصاصية رائحة حدث. مؤتمر نزع السلاح. اكتسبت FAS بالتسلسل في الماوس نفسه لنفس الرائحة (محاكمة واحدة مقابل ثلاث محاكمات في المتوسط ​​لكل منهالاي). وقد تم الحصول على هذه الخرائط باستخدام إطارات التنشيط المتوسط ​​خلال الثانية الأولى بعد بداية التحفيز رائحة (الحد الأقصى من مضان +0.72 ٪ الاختلاف في التطوير و+0.66 ٪ في E). علما أن المناطق البيضاء من الانبعاثات تألق ذاتي المشار إليها السهام السوداء تقابل المناطق السوداء في IOS. الجانب محبب ينظر في خريطة فاس ويرجع ذلك إلى 4 من 4 binning اللازمة لتحسين الحساسية. ولم يتم تصحيح الصور FAS من تألق ذاتي التبييض. الأبعاد الفعلية لتكون الصور : 0.7 مم X 1.2 مم.

Discussion

في هذه المقالة نقدم IOS وفاس لتقنيات التصوير في تسجيلات فيفو الأنشطة ذات رائحة أثار في OB الماوس. لتحقيق هذا الهدف بسيط نسبيا وبأسعار معقولة على نطاق ومجال التصوير الضوئي الإعداد أمر ضروري. الحصول على البيانات والتصوير ويتطلب التدريب لتنفيذ الإجراءات الجراحية الدقيقة ، وتجنب أي ضرر يلحق الجافية أو أنسجة المخ. على وجه الخصوص ، سوف تمتص فوتونات نزيف الرئيسية المسجلة في التصوير وحتى نهاية التجربة.

واحد يستفيد من IOS والتصوير FAS هو تجنب حقن استشفاف الفلورسنت التي يمكن أن تؤدي سمية الخلوية أو آثار جانبية غير مرغوب فيها. أنها تجعل من الممكن لمعالجة القضايا المتعلقة خرائط الشمية الترميز المكاني وبالتالي من المحفزات الحسية. خلافا ل2 - DeoxyGlucose التصوير ، لأنها توفر إمكانية الروائح الصور عدة في حيوان واحد. ومع ذلك ، منذ يقتصر الاختراق الفوتون في الأنسجة ، ويتم تقييد IOS وفاس على الجزء الظهري من OBولا يمكن تسجيلها من مناطق البطني.

التصوير الضوئي الذاتية إشارة القرار المكانية عروض ممتازة للتصوير في الجسم الحي. التحسينات التقنية الحسابات القلق كمية من المكونات الأوعية الدموية في إشارات الانعكاس ^8،9 فضلا عن ديناميات الأوكسجين في الدم وحجم أثناء التنشيط الحسي ^10. يتم تطويرها حاليا التصوير Multiwavelength النهج التصوير IOS في مختبرنا لقياس تركيز الهيموجلوبين بشكل كامل مجموع والأوكسجين في التوليد أثناء التنشيط الحسي. وهذه القياسات الطيفية الضوئية إضافة إلى التصوير FAS إعطاء فرصة للرد على العلاقة بين الديناميات التي لم تحل بين الخلايا والأوعية الدموية أثناء التنشيط الحسي ^11،12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الوصي	شركة	فهرس العدد
Imalgene	Merial
Rompun	باير
Agarose ، النوع الثالث - A	سيغما الدريخ	A9793 - 50G
Hexanal 98 ٪	الدريتش	115606 - 100ML