Optik Yansıtma ve Otofloresans Sinyalleri kullanarak, Fare Koku Ampul Görüntüleme Koku-Uyarılmış Etkinlikler

Özet

Bu makale, fareler koku ampulün yüzeyi harita koku uyarılmış faaliyetleri içsel optik sinyalleri ve flavoproteins otofloresans sinyallerini görüntüleme protokolleri sunar.

Özet

Beyin, duyusal stimülasyon uyaran kodlama katılmak fonksiyonel modülleri arasında nöron popülasyonları dağıtılır harekete geçirir. İşlevsel optik görüntüleme teknikleri bu modüller yüksek uzaysal çözünürlüğü ile duyusal korteks aktivasyonu görselleştirmek için avantajlıdır. Bu bağlamda, neuroenergetics bağlı moleküler mekanizmaları ortaya çıkan endojen optik sinyalleri geniş alanlarda kemirgen beyin üzerinde duyusal uyaranlar mekansal haritalar kaydetmek için kontrast değerli kaynaklarıdır.

Burada, iki endojen optik özellikleri etkinleştirme sırasında beyin dokusunda değişiklikler dayalı teknikler mevcut. Önce içsel optik sinyalleri (IOS), kırmızı ışık yansıtma nedeniyle yerel bir değişiklik tarafından üretilir: (i) emilimini kan oksijenlenme düzeyi ve kan hacmi (ii) foton saçılması değişiklikler. Uzamsal haritalar kaydetmek için, in vivo IOS kullanımı, 1980'lerin ortalarına observati ile başladıgörsel korteks ¹ kedi sıçan ve yönünü sütun bıyık varil optik haritalar üzerinde. IOS koku yanıt kemirgen ana koku alma ampul (OB) yüzey görüntüleme sonra Larry Katz grubu ² ile gösterilmiştir. İkinci yaklaşım, bu mitokondrial metabolik ara redoks değişiklikler nedeniyle flavoprotein otofloresans sinyalleri (FAS) dayanır. Daha doğrusu, tekniği, doku, mavi ışık ile heyecanlı flavoproteins okside devlet nedeniyle yeşil floresan dayanmaktadır. Bu tür sinyallerin muhtemelen Britton Şansı ve arkadaşları ³ öncü çalışmaları ile beyin aktivitesini çalışma için kaydedilen ilk floresan moleküller arasında olmasına rağmen, onlar in vivo beyin aktivasyonu haritalama için kullanılan olduğunu yakın zamana kadar değildi. FAS görüntüleme ilk Katsuei Shibuki grubu ⁴ hindpaw stimülasyon yanıt kemirgenler somatosensoriyel korteks uygulandı.

Ortamda kimyasal maddelerin etkin algılama ve tanımlama (gıda, predatör) verir, çünkü koku alma sistemi, canlı türlerinin büyük bir çoğunluğu hayatta kalmak için merkezi bir öneme sahiptir. OB, beyindeki koku alma, bilgi işlem ilk röle. Bu uçucu odorant molekülleri tespit koku primer duyusal nöron afferent projeksiyonları alır. Her bir duyu nöron, sinir süreçleri ^aynı 100μm 3 ~ iyi tanımlanmış microregions göndermek aynı tip reseptör taşıyan odorant reseptör ve nöronların sadece bir tür ayrık neuropil, koku alma glomerulus (Şekil 1) oluşturduğu ifade eder. IOS görüntüleme son on yılında, en çok çalışılan duyusal yapıların biri haline gelmiştir OB ^{5, 6, 7,} fonksiyonel arama teşvik vardır. FAS görüntüleme ile OB aktivite haritalama henüz yapılmamıştır.

Burada, we fare OB koku uyarılmış faaliyetleri haritası, IOS ve FAS görüntüleme için verimli bir protokol ardışık adımları göstermek.

Protokol

1. (Avrupa laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için öneriler doğrultusunda, 86/609/EEC direktifi) görüntüleme için hayvan hazırlanması

1. 6 ila 8 hafta eski C57BL6 erkek farelere enjekte intraperitoneal ketamin (10mg/kg) ve xylazine (100mg/kg) bir kokteyl ile anestezi. Cerrahi, fare artık tutam hindpaw yanıt başlar. Tüm deney sırasında hayvanın bir ısıtma yastığı yerleştirilir. Vücut ısısı sürekli olarak izlenmekte ve 37 muhafaza ° C Anestezi derinliği ekstremite yokluğunda geri kontrol ederek cerrahi ve görüntüleme oturumu boyunca devam eder. Aksi halde ilk anestezik kokteyl% 20 bir subkutan enjeksiyon uygulanır.
2. Kullanarak, kafa derisi, saç kesme makineleri çıkarın. Serum fizyolojik ile ıslatılmış steril gazlı bez kullanarak maruz kalan saç cildi temizleyin.
3. Stereotaksik çerçeve içinde fare yerleştirin. Burun, başın arkasında aynı düzlemde olması gerekirkoku ampulün yüzeyi yatay olarak ayarlamak için. Görüntüleme sırasında hareketleri önlemek için kulak ve burun çubukları sıkıca sabitleyin.
4. Kurutma ve ağrıyı önlemek için hayvanın gözlerinin oftalmik merhem uygulayın.
5. 70 ° betadin ardışık tarama ile etanol ve saçlı deri alanı ile bütün cerrahi aletler dezenfekte edin.
6. Kafatası kapsayan cilt kaldırmak için, kulağı arasında başın arka kısmında makas ile deride bir kesi yaparak başlayın. Sonra her iki tarafı kesilmiş, kulak baz doğru ve göz kapaklarının boyunca alnına doğru anteroposterior yönde. Kafa derisi, burun çubuğu yakın burnu üstüne cilt keserek kaldırarak bitirin.
7. Binoküler gözlem altında, kafatasının üstündeki periost hafifçe ayırmak için serum fizyolojik ile ıslatılmış pamuklu bir bez kullanın. Kalan doku kaldırmak ve temiz bir hazırlık var, bir neşter ile kafatası yüzey kazımak için forseps bir çift kullanın.
8. OB, göz kapaklarının arasında yer alan iki hemibulbs oluşan simetrik bir yapıdır. Bunlar venöz sinüs tarafından rostral ve kaudal yönde sınırlı ve sagital dikiş tarafından ayrılmış. OB üzerinde kemik distile su ile ıslatılmış emilebilir jelatin sünger bir parça yerleştirin. Deney boyunca bu kemik alanı nemli tutmak için önemlidir.

2. Kranial pencere hazırlanması

1. Jelatin sünger kaldırın ve yavaşça n ° 10 neşter bıçak kemiğe kazıma başlayın. Bıçak ve kemik arasındaki 45 ° 'lik sabit bir açıda tutun ve göz kapaklarının ampul alanının sagital tarafına bıçak taşımak. Kemik dikey baskı uygulamak ya da venöz sinüs üzerindeki kemik çizmeyin.
2. Inceltme işlemi sırasında, her 5min durdurmak ve hazırlık soğumasını kemik sulu bir jelatin sünger yerleştirin. Swab kafatası kemik tozu temizlemek için bir sünger ile.
3. Süpürme tutun vetrabeküller, süngerimsi kemik tabakası görselleştirme kadar alternatif soğutma. OB ince damarsal bu aşamada görünür olmalıdır. Kemik çizilmeye durdurun ve OB çevreleyen dikdörtgen bir alan "çizmek" dik bisturi ucu kullanmaya başlayabilirsiniz. Bu aşamada, n ° 11 neşter bıçak kullanılabilir. Sınırları içinde herhangi bir neşter inme güvenli olmalıdır venöz sinüs cerrahisi tutun.
4. Neşter ardışık hareketleri ile yavaş yavaş oluşan dikdörtgen bir siper kazmak. Temiz ve keskin tutmak için periyodik olarak neşter ucu silin. Dura yüzeye dokunmaktan kaçının ucu derinliği dikkatli olun.
5. Kalan kemik kalınlığı bir anlamda almak için, forseps bir çift ucu ile hafifçe itin. Basınç altında kemik flep çekilirse, bir sonraki adıma geçmek.
6. Bir damla tuzlu su altında, kemik flep kaldırmak için yatay, neşter odaklı ucu kullanın. Flap kaldırma c yapılmalıdırarefully kalan kemik yırtılmasını önlemek.
7. OB yüzey ortaya çıktığında, herhangi bir kanama ya da kan damarları anastomoz olmaması için kontrol edin. Dura veya doku yüzeyinin yaralandı optik sinyalleri alma şansını azaltacaktır. Alan ampul nemli tutmak için serum fizyolojik ile ıslatılmış bir jelatin sünger ile silin.
8. Poliakrilat diş çimento, iyi bir pencere etrafındaki kemik oluşturmak için uygulayın.
9. Dura üzerinde düşük erime noktası agaroz (% 1.2) bir damla koyun ve pencerenin boyutlarını steril bir cam kapak koymak. Görüntüleme oturumu sırasında, agaroz küçük bir miktar kuruma telafi etmek amacıyla eklenebilir. Agaroz solunum ile hareket OB önlemek ve optik görüntüleme için düz bir yüzey sağlayacaktır.

3. Koku alma etkinlik haritalama için Optik görüntüleme kurulumu

1. Koku alma uyarımı tam bir olfactometer kullanımı süresi ve yoğunluğu tanımlanmış olmalıdır. Biz temel bir hava kompresörü (basınçlı solunabilir hava gibi uygun olacaktır) ile ilişkili otomatikleştirin Bilimsel multivial perfüzyon sistemi Valvebank 8II özel bir değiştirilmiş bir sürümü kullanın. Bu sistem doğru ve hızlı harici valf kontrolü sağlar. Mineral yağ, saf odorant Çözümleri seçilen konsantrasyonda seyreltilir. Hexanal olarak dorsal OB aldehitler etkinleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Seyreltilmiş odorant tam bir hacim (20 50μl) bir filtre kağıdı üzerinde yüklü olan ve bir şırınga rezervuar yerleştirilir. Perfüzyon sistemi sayesinde, basınç kontrollü hava valf açılması sırasında hayvanın burun odorized hava akı teslim sabit bir oranın sağlanması, sistem teslim edilir. Odorant ~ 1000ml/min bir akış hızında hava taşıyan bir Tygon R-3603 Vakum Boru (Saint-Gobain Corporation) ile teslim edilir. Tüp koku ve odorant kalıntı miktarları arasında kirletil. Varsa, odorant uyaran tekrarlanabilirlik contro olabiliralev iyonizasyon dedektörü (microFID 2020 Photovac) aracılığıyla lled.
2. Optik kurulum açıktır. Oluşur geçmeli soğutmalı bir 12 bit bir floresan stereomikroskopta (Leica MZ16), bilgisayar kontrollü bir olfactometer ve uygun bandpass girişim filtreleri ile stabilize uyarma lambaları ile ilişkili CCD kamera (ORCA AG Hamamatsu). Bizim kurulum açıklayan bir şema Şekil 2'de verilmiştir. İçsel Optik Sinyalleri için bir fiber halka ışık (Schott) ile birleştiğinde bir 200W tungsten halojen lamba (Oriel QTH) Görüntüleme (IOSI), istikrarlı ve hatta aydınlatma sağlamak için kullanılan mikroskop amaç etrafında takılı. Flavoprotein Otofloresans Sinyalleri Görüntüleme (fasi), 5mm çekirdek sıvı ışık kılavuzu ile 150W metal halide lamba (Leica) stereomikroskopta epi-aydınlatma bağlantı noktası üzerinden floresan bile lokalize uyarma sağlar.

   Resim toplama ve donanım senkronizasyonu özel yazılım tarafından gerçekleştirilmektedir. Açık source yazılımı micromanager optik kurulum ve satın alma kontrol etmek için kullanılabilir.

4. Optik görüntüleme

1. Stereomikroskopta, görüş alanı (Şekil optik kurulum şematik bir bakın. 2A) merkezli kafatası pencere altında stereotaksik çerçeve yerleştirin.
2. Odaklanmak için kılcal damarları mikroskop ayarlayın. (5 açıklamasına bakın) ampul bir görüntü stimülasyon yöntemi öncesinde kan damarlarının görüntülenmesi için iyi bir kontrast sağlar 560nm (yeşil) ışık (elyaf ring) altına alınır. Bu resim, hazırlık durumunu kontrol etmek için anatomik bir kontrol olarak kullanılan ve deney sırasında birkaç kez elde edilir.
3. IOS görüntüleme için, ışık yoğunluğu altında 630 + / -10 nm (kırmızı) aydınlatma CCD kamera tarafından kaydedilen yansıtıyordu. Görüntüler tam 150 ms yaklaşık bir pozlama süresi karşılık, saniyede 5 kare kare (hayır binning) elde edilir. Işık kaynağı Güç yeniden ayarlanır. CCD piksel kuyuların doygunluğunu yakın OB alan, en az ~ 3000 ach gri seviyeleri. Bunu yapmak etkinleştirme sırasında soluk yoğunluğu değişiklikleri yakalamak için CCD 12bits dinamikleri yararlanmak mümkün kılar. Maksimum IOS amplitüdleri ulaşmak ~% 1.
4. FAS görüntüleme floresans için 480nm eksitasyon + /-20nm (mavi) epiflurorescence ışık altında elde edilir. 515nm A high-pass filtre ışığı yakalamak için kurulur. Görüntüler hassasiyeti en üst düzeye çıkarmak için 4 ile 4 binning ile saniyede 5 kare elde edilir. Tahrik olma ışık gücü OB alan üzerine 3000 gri seviyeleri ile IOS benzer şekilde ayarlanır. Maksimum FAS amplitüdleri ~% 3 ​​ulaşır.

   Hem görüntüleme yöntemleri için, söz konusu düzlemde alan derinliği aynıdır ve yaklaşık 4 kat büyütme için 0,5 mm ölçüldü.

5. Işık, ısıtma ve hazırlık photobleaching önlemek için görüntüleme denemeler arasında kapalı olmalıdır.

le "> 5 Görüntüleme çalışmalarda

1. Standart görüntüleme oturumun sadece hava teslim 10s 5 temel, 3 için daha başlangıç ​​kurtarma için sürekli bir hava akımı (Şekil kaydedilen bağlı olarak seçilen koku konsantrasyonu ve 70 82s 10s koku uyarımı takip 2A). Deneme sonunda, ışık kapalı ve temiz hava, artık koku moleküllerini yıkayın ve duyusal alışkanlık önlemek için (1 ila 3 dakika) arası deneme aralığı süresi için teslim edilir. Koku çalışmalarda boş bir çalışma (hava teslimat) ile interleaved.
2. Koku ile uyarılan aktif bölgeleri harita üzerinde kabaca küresel alanlar olarak görüntülenebilmekte ve bireysel glomerül (çapı ⁹ 80 200μm) boyutuna karşılık. Görüntü işleme Şekil 2B açıklanmıştır. Olfaktör haritaları Şekil 3'te sunulmuştur. OB başka herhangi bir duyusal sisteme aksine, sinyal-gürültü oranı (tek çalışmalarda koku uyarılmış yanıtlar çözmek için yeterliŞekil IOS ve Şekil 3B. 3D) FAS için.
3. Fare, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Avrupa tavsiyelerine uygun yöntemler kullanarak görüntüleme oturumun sonunda hemen ötenazi.

6. Temsilcisi Sonuçlar (bkz. şekil 3 koku alma haritalar):

Şekil 1 yapısal organizasyonu kemirgenler ana koku ampul. Olfaktör duyusal nöronlar, ana olfaktör epitel bulunan primer duyu hücreleri, aynı odorant reseptör ifade etme ve aynı glomerül üzerine OB yakınsama. Olfaktör glomerül, yuvarlak şekilli neuropils (kesikli çevreler), OB yüzey bulunmaktadır. Glomerüler düzeyde çok yoğun ve karmaşık bir damar ağı mevcut olduğunu unutmayın. Kısaltmalar (üst / aşağı): onl: olfaktor sinir tabakası; GL: glomerüler katman, EPL: Dış pleksiform katman; MCL:mitral hücre katmanı; GCL: granül hücre katmanı.

Şekil 2 Yansıtma ve in vivo olarak kayıt floresan sinyalleri. A. Wide-field optik görüntüleme kurulumu. Optik lens ve mikroskop bir epi-aydınlatma portu bağlı ya dairesel lif halka aracılığıyla kırmızı (IOS) veya mavi (FAS) hafif bir anestezi fare beyin maruz kalmaktadır. Kokular kapalı şişeleri yüklenir ve odorized hava hayvan burnu (yeşil ışık: açık kapak) teslim edilir. B. Kayıt protokolü ve veri işleme. IOS ve FAS bireysel çalışmaların serisi (süre 90'ların) olarak kaydedilir. Diyagramı tek bir deneme zaman çizelgesi gösteriyor: Başlangıçta 5, 10s, 10s 3 ila stimülasyon, ve 70 82s başlangıca dönüş değişir. Görüntü işleme stimülasyon dönemlerinde yoğunluk değerleri temel sırasında yoğunluk değerleri pixel-by-pixel çıkarma (FAS) or stimülasyon artı başlangıca dönüş (IOS). Bu fark, daha sonra (Şekil görüntülerini 3)% bir varyasyon elde etmek için başlangıç ​​değerleri ile ayrılmıştır .

Şekil 3 Koku uyarılmış IOS ve FAS görüntüleme kullanarak OB faaliyet haritaları. Dorsal OB A. damarları yeşil ışık altında görüntülendi. MÖ. % 20 hexanal bir 10s tanıtımı için IOS görüntülü (sırasıyla ortalama üç çalışmalarda karşı tek deneme). Beyaz oklar bu koku ile aktive faiz küresel bölgelerde gösterir. Bu aktivasyon haritalar kare (B A ve -0.52% maksimum yansıma değişimi% -0,63), koku stimülasyon bitiminden sonra birinci, ikinci sırasında ortalama kullanılarak elde edilmiştir. Koku aktivasyon oluştu absorbans siyah bölgeler unutmayın. CD. FAS (üç ortalama çalışmalarda ilgili karşı tek bir dava, aynı odorant sırayla aynı fare satın aldııy). Bu aktivasyon haritalar kare (floresan değişimi, D ve E 0,72% 0,66% maksimum) koku stimülasyon başladıktan sonra birinci, ikinci sırasında ortalama kullanılarak elde edilmiştir. Siyah oklarla gösterilen otofloresans emisyon beyaz bölgeler siyah IOS bölgelerine uygun unutmayın. FAS haritada görülen grenli yönü duyarlılık geliştirilmesi için gerekli olan 4 binning ile 4 kaynaklanmaktadır. FAS görüntüleri otofloresans beyazlatma düzeltilmiş değildi. Görüntülerin gerçek boyutları BE: 0.7 mm genişliğinde x 1.2 mm uzunluğunda.

Tartışmalar

Bu yazıda, in vivo fare OB koku uyarılmış faaliyetleri kayıtları için IOS ve FAS görüntüleme teknikleri mevcut. Bu hedefe ulaşmak için nispeten basit ve uygun fiyatlı geniş alan optik görüntüleme kurulumu gereklidir. Görüntüleme verileri satın alma, ince cerrahi işlemler gerçekleştirmek ve dura veya beyin dokusu herhangi bir yaralanmayı önlemek için eğitim gerektirir. Özellikle, majör kanama görüntüleme için kaydedilmiş fotonları absorbe ve deneme sonunda.

IOS ve FAS görüntüleme bir yararı floresan izleyiciler enjeksiyonu önlemek için hücresel toksisite veya istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Onlar mümkün koku alma haritalar uyarımlar dolayısıyla uzamsal kodlama ile ilgili sorunları çözmek için. 2-deoksiglukoz görüntüleme aksine, tek bir hayvan görüntü birkaç kokulara imkanı da sağlar. Ancak, foton doku penetrasyonu sınırlı olduğundan, IOS ve FAS OB dorsal kısmı ile sınırlı.ve ventral bölgelerde kaydedilen olamaz.

Endojen optik sinyal görüntüleme in vivo görüntüleme için mükemmel bir uzaysal çözünürlüğü sunuyor. Yansıma vasküler bileşenler Teknik gelişmeler endişe nicel hesaplamaları, duyusal ^aktivasyon 10 ^sırasında 8,9 yanı sıra kan oksijenlenme ve hacim dinamikleri sinyalleri . IOS görüntüleme yaklaşımlar Multiwavelength görüntüleme Laboratuvarımızda şu anda tam olarak duyusal aktivasyon sırasında OB toplam hemoglobin konsantrasyonu ve oksijen ölçmek için geliştirilmiştir. FAS görüntüleme eklenen bu optik spektroskopik ölçümler sırasında vasküler ve hücre içi dinamikler arasındaki çözülmemiş bir ilişki duyusal ^aktivasyon 11,12 cevaplamak için fırsat verecektir .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Regent Adı	Şirket	Katalog numarası
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer
Agaroz, tip III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Hexanal 98%	Aldrich	115.606-100ML