كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف مع مساعدة من اتش المستمدة من الأنظمة

Summary

نحن هنا وصفا لبروتوكول يستند فقط على إصابة الخلية، مما يحسن من كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف من قبل أكثر من 100 أضعاف بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات في الاستخدام. هذا البروتوكول يعتمد على استخدام اتش 5 رواية القائم على المساعد الذي يحتوي على نسخ نائب رئيس وحدة البارفو (AD-VP).

Abstract

parvoviruses القوارض (PV) مثل جرذ H-1PV وMVM، صغيرة، واحد متعدد السطوح الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الفيروسات،. الجينوم الخاصة بهم تضم اثنين من المروجين P4 و P38 التي تنظم التعبير عن البروتينات غير الهيكلية (NS1 وNS2)، وقفيصة (VP1 وVP2) على التوالي ^1. وهي تجتذب اهتماما كبيرا كعوامل مضادة للسرطان لقدراتهم وoncolytic oncosuppressive في حين يجري غير ممرضة للبشر ^2. NS1 هو المستجيب الرئيسية من ³ السمسة الفيروسية. من أجل تعزيز أنشطتها موانع الأورام الطبيعية، وقد ولدت هذه المشتقات من ناقلات عن طريق استبدال الجين الترميز لالبروتينات قفيصة مع التحوير العلاجية (مثل ببتيد السامة للخلايا، خلوى، chemokine الجينات السرطانية، القامع الخ) ^4. وparvoviruses المؤتلف (recPVs) ناقلات يحتفظ تسلسل NS1 / 2 الترميز والتيلومير الجينوم الكهروضوئية التي تعتبر ضرورية لتضخيم الحمض النووي الفيروسي والتعبئة والتغليف. إنتاجrecPVs لا يحدث إلا في الخلايا المنتجة (HEK293T عموما)، التي شاركت في transfecting الخلايا مع ناقل الثانية (pCMV-VP) معربا عن ترميز الجين للبروتينات نائب الرئيس (الشكل رقم 1) ^4. ناقلات recPV ولدت في هذه الطريقة هي تكرار معيب. على الرغم من أن recPVs ثبت لامتلاك الأنشطة oncotoxic المعززة فيما يتعلق الفيروسات من الوالدين والتي تم إنشاؤها فيها، إنتاجها لا يزال يشكل تحديا كبيرا ويعرقل بشدة استخدام هذه العوامل المضادة للسرطان في التطبيقات السريرية.

وجدنا أن إدخال متجه الإعلان-5 المشتقة التي تحتوي على E2A، E4 (orf6) والحمض النووي الريبي الجينات زارة شؤون المحاربين القدامى (على سبيل المثال pXX6 البلازميد) في HEK293T تحسن الإنتاج من recPVs بأكثر من 10 ضعفا بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات في الاستخدام. استنادا إلى هذه النتيجة، لقد وضعنا رواية AD-VP-المساعد الذي يحتوي على العناصر الجينية الفيروسة الغدانية اللازمة لتعزيز الإنتاج recPVs فضلا عن parvovir فيلنا وحدة الجينات نائب الرئيس ^5. استخدام AD-VP-المساعد، ويسمح إنتاج تفصيل، المحاضر الحرفية باستخدام بروتوكول الذي يعتمد كليا على خطوات عدوى فيروسية (على العكس من ترنسفكأيشن البلازميد)، مما يجعل من الممكن استخدام خطوط الخلايا التي يصعب transfect (على سبيل المثال NB324K) ( الشكل 2). نقدم أسلوب الذي يحسن كثيرا من كمية الفيروس المؤتلف المنتجة، والحد من كل من وقت الإنتاج والتكاليف، دون التأثير على جودة المنتج النهائي ^5. وبالإضافة إلى ذلك، الانتاج على نطاق كبير من recPV (في الخلايا التعليق والمفاعلات الحيوية) هي الآن يمكن تصوره.

Protocol

لاحظ أن هناك حاجة إلى مختبر مع مستوى السلامة الحيوية (2) لإنتاج parvoviruses المؤتلف (recPV).

وينقسم هذا البروتوكول في جزئين رئيسيين. مطلوب الجزء الأول (إنتاج recPV عبر ترنسفكأيشن) لإنتاج كمية ضئيلة من recPVs التي هي بمثابة اللقاح في الجزء الثاني من البروتوكول (إنتاج recPVs عن طريق العدوى). مرة واحدة ويتم إنتاج كمية صغيرة من recPVs، يمكن حذف الجزء الأول من البروتوكول، ويمكن أن تتضخم البارفو المؤتلف فقط عن طريق العدوى وتوفير الترميز الجيني للبروتينات البارفو قفيصة من خلال المساعد اتش (انظر أدناه).

1. إنتاج recPVs عبر ترنسفكأيشن

1.1 ترنسفكأيشن الحمض النووي الفيروسي

فمن الممكن استخدام أي ترنسفكأيشن الحمض النووي تأسيس أسلوب في هذا القسم من بروتوكول إما على أساس نسبة الدهون الموجبة أو فوسفات الكالسيوم. نستخدم عادة Fugene HD ترنسفكأيشن الكاشف. للسيطرة على كفاءة ترنسفكأيشن، نوصي transfecting لوحة إضافية مع البلازميد البروتين الأخضر معربا عن تعزيز نيون (على سبيل المثال pEGFP-N1، Clontech). ويعتبر ترنسفكأيشن كفاءة والأمثل لإنتاج فيروس عندما لا يقل عن 50٪ من سكان الخلية يؤدي EGFP إيجابية بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن.

1. 1 يوم قبل خلايا ترنسفكأيشن البذور، HEK293T 2 مليون في لوحة 10 سم، للحصول على confluency الخلوية 50٪ في يوم من ترنسفكأيشن. زراعة خلايا في 10 مل من النسر Dulbecco للمتوسط ​​المعدل (DMEM) مع اضافة 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مم L-الجلوتامين، 100 U لكل البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين.
2. يعد فيروس صنع خليط (01:02:01 نسبة الرحى) في أنبوب 1.5 مل:
   1. 3 ميكروغرام من ناقلات recPV إيواء التحوير من مصلحة (EI phH-1-GFP ^6).
   2. 6 ميكروغرام من pCMV ناقلات / نائب الرئيس ⁵ ايواء الجين قفيصة وحدة البارفو
   3. 8 ميكروغرام سو اتش المشتقة المساعد البلازميد pXX6 ^7.
3. يخفف من مزيج البلازميدات مع المصل خالية من متوسط ​​ما يصل الى (تركيز النهائي من نانوغرام / ميكروليتر 20) 850 ميكروليتر.
4. إضافة 42.5 ميكرولتر Fugene HD (2.5:1 Fugene ميكرولتر نسبة: الحمض النووي ميكروغرام). لا تلمس الجانب من أنبوب عند إضافة Fugene إلى المتوسطة.
5. دوامة برفق لمدة 5-10 ثواني.
6. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
7. إضافة مخاليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا انخفاض الحكيم. هزة لوحة بلطف لتوزيع الخليط بالتساوي في جميع أنحاء.

1،2 فيروس الإنتاج

1. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع رطوبة 92٪ و 5٪ CO ₂ لمدة 72 ساعة قبل الحصاد. خلال هذه الفترة تتكون الجسيمات البارفو ذرية من البلازميدات البارفو.

1،3 فيروس الحصاد

1. في نسيج غطاء محرك السيارة والثقافة، وتتخلص من الخلايا داخل المتوسطة بهم، نضح ونقل التعليق من لوحة الى 15 عامامل أنبوب من البلاستيك.
2. منبذة الأنبوب في 250 XG لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. إزالة 95٪ من طاف.
4. دوامة الأنبوب برفق لresuspend لبيليه في طاف المتبقية (حوالي 0.5 مل).
5. تجميد أنبوب في -80 درجة مئوية. فمن الممكن لوقف الإنتاج في هذه المرحلة أو أن يستمر مع البروتوكول.
6. الصقيع تعليق وجعله في درجة حرارة الغرفة.
7. تجميد تعليق في حمام النيتروجين السائل، وذوبان في الماء الدافئ عند 37 درجة مئوية. دوامة الأنابيب بقوة لمدة 15 ثانية وكرر تجميد ذوبان دورة مزيد من مرتين.
8. منبذة الأنابيب في 16000 XG لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
9. جمع وطاف في أنبوب جديد. الأنبوب في هذه المرحلة يحتوي على استخراج النفط الخام فيروس الإعداد.
10. المضي قدما في المعايرة فيروس (انظر أدناه). لrecPV يحمل الجين GFP، وينبغي أن تعطي لإنتاج نموذجي X 10 ⁷ 1-3 الوحدات الفيروسية المعدية الموافق 1 -3 × ¹⁰ 10 الجينوم الفيروسي تحتوي على جزيئات.

1،4 فيروس تخزين

1. على المدى الطويل تخزين تجميد أنبوب يحتوي على مستخلص فيروس الخام عند -80 درجة مئوية. فمن الممكن استخدام مقتطفات الفيروسية الخام كما اللقاح في الجزء الثاني من البروتوكول.

2. إنتاج recPVs عن طريق العدوى

قبل البدء في إنتاج recPV عن طريق العدوى، وإنتاج وتنقية اتش 5 تحمل البارفو VP الجين (AD-نائب الرئيس المساعد، وصفت في ⁵⁾ وفقا لمعيار بروتوكول ^8. من الضروري أيضا أن يكون له الحد الادنى من recPVs تحمل التحوير من الفائدة (على سبيل المثال، تنتج عن طريق ترنسفكأيشن على النحو المبين أعلاه).

أدناه، وصفنا إنتاج recPV في 175 قارورة ² سم (T175) تنسيق. ويمكن إجراء مزيد من التضخيم للمخزون فيروس المنتجة بهذه الطريقة في 10 متعدد الطبقات غرف ثقافة CellSTACK (كورنينج)مع تعديلات طفيفة من البروتوكول المقترح.

2.1 العدوى

1. 1 يوم قبل الخلايا العدوى لوحة، NB324K 10 مليون دولار في قارورة T175 للحصول على confluency الخلوية 60-80٪ في اليوم من العدوى. إعداد قارورة ثانية تحتوي على نفس العدد من الخلايا كعنصر تحكم (غير المصابة الخلايا). وينبغي أن يكون كل T175 20 مل من متوسط ​​الأساسية الدنيا (MEM) كوحدة تخزين النهائي، على أن تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، 2 مم L-الجلوتامين، 100U في Penicilin مل و 100 الستربتوميسين ميكروغرام / مل.
2. في صباح اليوم التالي تحضير خليط فيروس في أنبوب بلاستيكي 2 مل يتألف من:
   1. AD-VP-المساعد ⁵ في تعدد العدوى (وزارة الداخلية والوحدات المعدية / خلية) = 10 (الموافق 1 × الوحدات ⁸ 10 المعدية)؛
   2. recPVs في وزارة الداخلية = 0.5 (الموافق 5 × ⁶ 10 وحدة المعدية). إكمال إلى 1.5 مل مع MEM.
3. تطبيق خليط فيروس كامل في واحدة من قارورة T175.
4. احتضانقارورة لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية والرطوبة 92٪، 5٪ CO ₂ يهز بلطف كل 15 دقيقة.
5. احتضان لمزيد من 20-24 ساعة عند 37 درجة مئوية والرطوبة 92٪، 5٪ CO _2.
6. استبدال المتوسطة الثقافية مع المتوسط ​​الطازجة.

2،2 فيروس الإنتاج

احتضان وقوارير على 37 درجة مئوية مع رطوبة 92٪ وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ₂ لمدة 48 ساعة. كما يدل على كفاءة الانتاج الفيروسية، ينبغي لاحظ علامات واضحة على السمسة في القارورة التي تحتوي على الخلايا المصابة الفيروسية، ابتداء من 36-48 ساعة بعد الإصابة.

2،3 فيروس الحصاد

1. في نسيج غطاء محرك السيارة والثقافة، ونضح ونقل طاف المتوسطة من القارورة في أنبوب 50 مل الطرد المركزي.
2. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1.5 مل.
3. يعرض للتريبسين الخلايا مع 1.5 مل من 0.25٪ Trysin-EDTA. إضافة تعليق الخلية إلى إزالة المتوسطة.
4. منبذة الخلايا وطاف في 5000 في XG لمدة 5 دقائق في غرفة المزاجature.
5. تجاهل طاف.
6. إضافة 1 مل من TE العازلة (1 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك، 0.1 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.7) إلى خلية بيليه ودوامة بلطف أنبوب لresuspend الخلايا.
7. تجميد تعليق خلية في حمام النيتروجين السائل، وذوبان في الماء الدافئ عند 37 درجة مئوية. دوامة الأنبوب بقوة لمدة 15 ثانية وتكرار دورة تجميد ذوبان ثلاث مرات.
8. علاج تعليق خلية مع 50 Nuclease Benzonase يو / مل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية من أجل هضم الجينومية الخلية وغير المعبأة السلطات الوطنية المعينة الفيروسية.
9. منبذة الأنبوب في 5000 XG لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
10. جمع وطاف في أنبوب جديد. وطاف في هذه المرحلة يحتوي على استخراج النفط الخام فيروس إعداد. إنتاج المحاصيل التقليدية من recPV-GFP بعد هذا البروتوكول ينبغي أن يكون في حدود 1-10 × 10 ^{8 وحدات} المعدية الفيروسية.

2،4 فيروس تخزين

1. للتخزين على المدى القصير (بحد أقصى 2 أشهر) فيروس مخزن، في 4 درجة مئوية.
2. للونز تخزين الأجل (أكثر من 2 شهر)، فيروس مخزن في -80 درجة مئوية.

3. RecPV تنقية

1. لتنقية recPVs من lysates الخام، ونحن نوصي لتشغيل معامل discontinous Iodixanol وفقا لوآخرون Zolotukhin ^9. نوصي باستخدام ما لا يقل عن 5 مل من استخراج النفط الخام الفيروسية (التي تم الحصول عليها من الانتاج في خمس قوارير T175) لتنقية فيروس فعالة.

4. المؤتلف البارفو المعايرة

1. أداء recPV المعايرة كما هو موضح في وآخرون شرم أندلسي. ⁵

5. ضوابط جودة

1. استخدام بروتوكول وصفها في وآخرون شرم أندلسي. ⁵ للتحقق من وجود فيروسات النسخ غير مرغوب فيه المختصة (RCV) إجراء فحص لوحة البارفو في الخلايا مؤشر NB324K.

6. ممثل النتائج

مثال على الانتاج: recPVsN عبر ترنسفكأيشن في وجود أو عدم وجود العناصر الجينية اتش هو مبين في الشكل (3). وtransfected الخلايا مع pCMV / نائب الرئيس (البلازميد التي تحمل الجين الترميز لبروتينات البارفو قفيصة VP) جنبا إلى جنب مع phH-GFP-1 (1 recPV ايواء الجين GFP) أو phH-1-luciferase المراسل (أ recPV ايواء الجين luciferase المراسل اليراع) ، مع (+ pXX6) أو بدون (-pXX6) وpXX6 البلازميد (تحمل اتش E2A، E4 (orf6) والجينات VA RNA). تم تطبيق حجم متساوية من مقتطفات خلية النفط الخام الى NB324K أجريت الخلايا وتنبيغ GFP أو المقايسات luciferase المراسل كما ورد في وآخرون شرم أندلسي. ^5. تم الحصول على زيادة واضحة في إنتاج recPVs في حضور pXX6 مع زيادة الإنتاج من وحدة GFP 0.3 transductional (TU) / خلية تم الحصول عليها وفقا لبروتوكولات التقليدية إلى ما يقرب من 5 الخلية تو / بعد الحصول على طريقتنا (الشكل 3A، B). زيادة كبيرة (حوالى أضعاف-24) من producti لrecPVولوحظ أيضا في في حالة phH-luciferase المراسل-1 (الشكل 3C). هذه النتائج تشير إلى أن المادة الوراثية الموجودة في pXX6 قادرة على زيادة الإنتاج البارفو.

ويرد مثال ممثل الإنتاج recPVs عن طريق العدوى في الشكل 4. وقد شارك في خلايا NB324K المصابين recPVs مختلفة (كما هو مبين في الشكل) وAD-VP-المساعد (إيواء ترميز الجين للبروتينات PV قفيصة VP). إعلان VP-المساعد الإنتاج recPV زيادة تعزيز ما يصل الى> 70 TU لكل خلية المصنفة (الشكل 4A) دون زيادة وقوع الجزيئات المختصة غير مرغوب فيه تكاثر الفيروس (الشكل 4B).

الشكل 1. ناقلات على أساس parvoviruses الحكم الذاتي. (أ) الأعلى: والتحوير يستبدل جزء من الجينات VP-الترميز ويخضع لسيطرة P38 المروج الفيروسية. يتم إعادة الجينات لNS1 / 2حافظت، ويتم التحكم التعبير عنها من قبل P4 المروج الفيروسية. ويحيط الجينوم متجه من قبل نظام الإسناد الأرضي parvoviral، والتي تحتوي على رابطة الدول المستقلة المفعول عناصر مطلوبة من أجل النسخ والتعبئة والتغليف من الجينوم المؤتلف. أسفل: وبلازميد يحمل VP-الجين تحت مغايرة سواء (على سبيل المثال CMV)، أو ذاتي (على سبيل المثال P38.) مروج (مقصف)، يتم توفيره في العابرة خلال إنتاج البارفو المؤتلف من أجل التعويض عن اختلال الجينات الهيكلية في الجينوم المؤتلف. ITR، مقلوب تكرار محطة. شخصية مقتبسة من ^4. (B) تخطيطيا للبروتوكول التقليدية المستخدمة لإنتاج recPVs. وعابر. HEK293T مع خلايا الحمض النووي الفيروسي (ناقلات والبلازميدات المساعد) وبعد ثلاثة أيام، يتم جمع الخلايا والتي تحصد الفيروسات.

الشكل 2. إنتاج recPVs معمساعدة من VP-الإعلان. (أ) خرائط تخطيطي من الجينوم recPV والإعلان VP-. وrecPV يحتوي على التحوير غيروي الذي يحل محل جزء من منطقة نائب الرئيس. في AD-VP تؤوي الجين VP البارفو. (B) تخطيطيا للبروتوكول وصفها في هذه المخطوطة. هي خلايا NB324K شارك في المصابين recPV والفيروسات AD-نائب الرئيس. بعد ثلاثة أيام ويتم حصاد الخلايا والجزيئات recPV تعافى من المحللة الخلية.

الشكل 3. تحفيز الإنتاج recPV بواسطة اتش القائم على البلازميدات pXX6. وtransfected الخلايا HEK293T المصنفة في أطباق 10 سم، مع pCMV / نائب الرئيس في تركيبة مع phH-GFP-1 (A و B) أو phH-1-luciferase المراسل (C) لإنتاج recPVs. في وقت واحد، وقد شارك في خلايا transfected مع البلازميدات المساعد اتش المشتقة pXX6 أم لا، كما هو مبين. ثلاثة أيام بعد ترنسفكأيشن، كانت تحصد الخلايا والتي هي lysed دورات التجميد والذوبان الثلاثة. على قدم المساواة وحدات التخزين من الخامتم تطبيق مقتطفات فيروس ه إلى NBK الخلايا مؤشر، وأجريت فحوصات تنبيغ خارج. (A) الميكروسكوب الممثل تظهر الخلايا GFP إيجابي داخل monolayers NB324K متموجة. (B) القياس الكمي لفحوصات تنبيغ GFP التي أعرب عنها في وحدة تنبيغ (TU) في خلية المصنفة (ج) القياس الكمي لluciferase النشاط وأعرب وحدات luciferase المراسل النسبي (RLU). تم إجراء فحص luciferase المراسل كما هو موضح في وآخرون شرم أندلسي. ^5. أعمدة تمثل القيم متوسط ​​من ثلاث مكررات بقضبان الانحراف المعياري. رقم في أعلى العمود pXX6 +، في (B و C)، يشير إلى زيادة أضعاف في عيار فيروس recPV، التي تم الحصول عليها في ظل وجود pXX6 دون مقابل.

الشكل 4. تحفيز الإنتاج recPV بواسطة المؤتلف فيروس المساعد AD-نائب الرئيس. (A) خلايا NB324K، كانت العدوىتيد مع فيروس المنقى المساعد AD-نائب الرئيس في وزارة الداخلية من 10 (AD-X وحدة / الخلية، مع معاير الغدة X كيت العيار الحجمي السريع)، ثم superinfected مع أي من البارفو في المؤتلف التالية تشي سمو-1-EGFP ¹¹ (0.1 TU / الخلية) أو H-1-GFP (0.5 TU / خلية) ^5. يوم واحد في مرحلة ما بعد الإصابة، تم تغيير المتوسطة وبعد ذلك بيومين، تم جمع الخلايا وهي lysed عبر دورات التجميد والذوبان-3. واستخدمت مقتطفات خلية النفط الخام لتحديد عيار الفيروس عن طريق فحص تنبيغ وفقا لوآخرون شرم أندلسي. ^5. TU، وحدة تنبيغ. (B) وقد تم تحليل دفعات الفيروسية التي تنتج في وجود عدم وجود الإعلان، نائب الرئيس عن محتواها من الجسيمات تكاثر الفيروس المختصة (RCV) بواسطة فحص لوحة على الخلايا مؤشر NB324K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لقد أظهرنا أنه يمكن تعزيز recPV الإنتاج من خلال وجود عناصر الجينومية الفيروسة الغدانية. لقد قمنا بزيادة الغلة recPV بأكثر من 10 ضعفا (0،3-5 خلية / TU) من خلال تقديم اتش العنصر الجيني عبر ترنسفكأيشن وأكثر من 100 أضعاف الخلايا المشارك اصابة مع AD-VP-المساعد في تركيبة مع recPV في بالمقار...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
DMEM	سيغما	D5796
MEM	سيغما	M4655
الجنين المصل البقري	PAA	A15-101
L-الجلوتامين	Gibco	25030-024
Fugene	روش	047097050001
التربسين-EDTA	إينفيتروجن	25300062
Benzonase Nuclease	سيغما	E8263
الغدة-X السريع العيار الحجمي كيت	Clontech	632250