重组细小病毒与腺病毒派生系统的帮助下高效生产

摘要

在这里，我们描述只对细胞的感染，从而提高重组细小的生产效率超过100倍相比，在使用中的其他协议为基础的协议。此协议依赖于使用一种新型腺病毒含有的细小副总裁转录单位（AD-VP）5，基于辅助。

摘要

如鼠的H-1PV和MVM的啮齿动物细小病毒（PV），是小二十面体，单链DNA病毒。其基因组包含两个启动子P4和P38调节的非结构性（NS1和NS2）和衣壳蛋白（VP1和VP2），分别为^1的表达。他们作为抗癌药物的溶瘤和oncosuppressive能力，而人类²非致病性高利率吸引。 NS1蛋白是该病毒的细胞毒性^3的主要效应。为了进一步提高他们的天然抗癌活动，从这些载体的衍生工具已产生取代衣壳蛋白编码基因与治疗基因（ 如细胞毒性多肽，细胞因子，趋化因子，抑癌基因等^）4。 （recPVs）重组细小病毒载体保留的NS1 / 2编码序列和光伏病毒DNA扩增和包装所必需的基因组端粒。生产recPVs只发生在生产者细胞（一般染HEK293T），合作的第二个表达载体为VP蛋白编码基因（ 图^{1）4（PCMV-VP）}转染细胞。以这种方式产生的recPV载体是复制缺陷。 ，虽然recPVs证明拥有与尊重父母，他们已产生病毒增强oncotoxic活动，其生产仍然是一项重大的挑战和强烈阻碍了这些药物的使用在抗癌的临床应用。

我们发现，引进含有HEK293T细胞，E2A，E4（ORF6）和VA RNA基因（ 如 pXX6，质粒）提高超过10倍相比，在使用中的其他协议的recPVs生产AD-5派生载体。基于这一发现，我们已经构建一种新型的广告副总裁的助手包含腺病毒基因组元素以及必要加强recPVs生产parvovir我们VP基因单位^5。 AD-VP辅助使用，允许生产REC-PVS使用协议，完全依赖于病毒感染步骤（如反对质粒转染），使人们有可能使用难以转染的细胞株（ 如 NB324K）（ 图2）。我们提出了一个方法，大大提高了重组病毒的产生量，降低生产时间和成本，不影响最终产品的质量^5。此外，大规模生产的recPV（悬浮细胞和生物反应器）现在是可以想象的。

研究方案

请注意，与生物安全2级实验室重组细小病毒的（recPV）生产的需要。

该协议是在两个主要部分细分。第一部分通过转）（recPV生产需要作为接种服务的协议的第二部分（通过感染recPVs生产）生产最小recPVs的金额。一旦产生少量的recPVs，该协议的第一部分可以省略，只能通过提供感染细小病毒衣壳蛋白通过腺病毒辅助（见下文）的编码基因扩增和重组细小病毒。

1。生产，通过转染recPVs

1.1病毒DNA转染

它可以使用任何既定的DNA转染的方法，在此节上阳离子脂质或磷酸钙为基础的协议。我们通常使用FugeneĤð转染试剂。为了控制转染效率，我们建议转染与表达质粒增强型绿色荧光蛋白（ 如染pEGFP-N1，Clontech公司）的额外板。染是考虑病毒的生产效率和最佳的结果转染EGFP阳性后24小时内至少50％的细胞群。

1. 1天前转，种子2万HEK293T细胞，在一个10厘米的板，获得50％的细胞转染当天汇合。增长在10毫升杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基），另外10％胎牛血清，2毫米L-谷氨酰胺，100 U，每毫升青霉素和100μg/ mL链霉素的细胞。
2. 准备在1.5毫升管病毒的混合物（摩尔比为1:2:1）：
   1. 3微克recPV载体窝藏感兴趣的转基因（EI PHH-1-GFP ^6）。
   2. 6微克载体pCMV /副总裁⁵窝藏细小病毒衣壳基因 ​​组
   3. 8微克Øf派生腺病毒辅助质粒pXX6 ^7。
3. 用无血清培养基850μL（20 ng /μl的最终浓度）稀释的质粒组合。
4. 加入42.5μLFu​​gene HD（2.5:1μL的Fugene：微克DNA）。加入Fugene到中期时，请勿触摸管侧。
5. 涡，轻轻地为5-10秒。
6. 在室温下孵育30分钟的混合物。
7. 添加下拉明智的细胞转染混合物。轻轻地摇动板均匀地分布整个混合物。

1.2生产病毒

1. 在37°C，湿度92％和5％CO _2，收获前72小时的孵育板。在此期间，后代细小颗粒形成细小病毒质粒。

1.3病毒的收获

1. 在组织文化的引擎盖上，刮细胞内的介质，吸和转让暂停从板成15毫升的塑料管。
2. 在250 XG离心管在室温下5分钟。
3. 取出上清的95％。
4. 涡管轻轻将剩余的上清液（约0.5毫升）悬浮颗粒。
5. 冻结管在-80°C。这是可能的，在这个阶段停止生产或继续使用该协议。
6. 除霜暂停，并把它在室温下。
7. 在液氮浴和温水解冻冻结悬挂在37°C。涡管大力为15秒，重复的冻融循环两次。
8. 离心管，在15分钟的16000 XG 4°C。
9. 上清收集到一个新的管。在这个阶段的管包含原油病毒提取的准备。
10. 进行病毒滴定（见下文）。为recPV携带绿色荧光蛋白基因，一个典型的生产应给予1-3×10 ⁷病毒传染性单位约1 -^3×10 10病毒基因组含有颗粒。

1.4病毒的存储

1. 对于长期储存，冻结管含有原油病毒提取物在-80°C。它可以使用在协议的第二部分作为接种病毒粗提取物。

2。生产，通过感染recPVs

通过的感染recPV生产开始之前，生产和纯化腺病毒携带细小病毒基因副总裁（AD-VP帮手，描述^5）根据标准协议^8。它也需要有少量的账面权益的转基因（ 例如 ，如上所述，通过转染生产）recPVs。

下面，我们描述了在175厘米²瓶（T175）格式recPV生产。以这种方式产生的病毒库存的进一步放大，可以进行10多层CellSTACK的文化室（康宁）提出的协议的轻微调整。

2.1感染

1. 1天前感染，板材10万NB324K在T175烧瓶获得60-80％细胞汇合，在一天的感染细胞。准备第二瓶含有相同数量作为控制细胞（非感染的细胞）。每个T175应该有作为最终的体积，辅以5％小牛血清，2毫米L-谷氨酰胺，每毫升含青霉素100U和100μg/ mL链霉素，20毫升的最低基本培养基（MEM）的。
2. 第二天早上，准备在2毫升的塑料管组成的病毒混合：
   1. AD-VP辅助在感染复数（MOI，传染性单位/细胞^）5 = 10（1×10 ⁸传染性单位）;
   2. recPVs在MOI = 0.5（对应5×10 ⁶传染性单位）。完成1.5毫升的MEM。
3. 适用于T175烧瓶整个病毒的混合物。
4. 孵育瓶2小时在37°C，湿度92％，5％CO ₂轻轻晃动，每15分钟。
5. 进一步为20-24小时，在37℃，湿度92％，5％的CO _2。
6. 更换新鲜培养基培养基。

2.2生产病毒

在37°C孵育48小时内92％的湿度和5％的CO ₂瓶。高效的病毒生产的指示，明确迹象的细胞毒性，应观察瓶含有病毒感染的细胞，开始感染后36-48小时。

2.3病毒的收获

1. 在组织文化的吸油烟机，吸转移到50 mL离心管上清液从烧瓶。
2. 1.5毫升PBS洗细胞两次。
3. 1.5毫升0.25％Trysin-EDTA Trypsinize细胞。加入细胞悬液，以移除介质。
4. 在室温下5分钟离心在5000 XG细胞和上清的温升。
5. 弃上清。
6. TE缓冲液加入1毫升（1毫米的Tris-HCl，0.1 mM的EDTA，pH值8.7）的细胞沉淀，轻轻涡管悬浮细胞。
7. 在液氮浴和温水解冻冻结的细胞悬液，在37°C。涡管大力为15秒和冻融循环重复三次。
8. 50 U / ml的Benzonase核酸为30分钟，在37°C间治疗的细胞悬液，以消化细胞基因组和非包装病毒的DNA。
9. 20分钟离心管在5000 XG在4°C。
10. 上清收集到一个新的管。在这个阶段的上清含有原油的病毒提取物制剂。典型的产量的recPV-GFP的生产后，这个协议应该在1-10×10 ^8个病毒感染单位的范围。

2.4病毒的存储

1. 适用于短期存储（最多2个月），商店病毒在4°C
2. 为LON的Ğ长期存储（超过2个月），存储病毒在-80°C。

3。 RecPV纯化

1. 对于从原油裂解recPVs净化，我们建议运行碘克沙醇间断梯度，根据Zolotukhin 等^。9。我们建议至少使用5毫升高效的病毒纯化病毒粗提取物（五T175烧瓶从生产中获得）。

4。重组细小病毒滴定

1. EL-Andaloussi 等执行recPV滴定^5。

5。质量控制

1. 使用EL-Andaloussi 等⁵所述检查不受欢迎复制主管账面指标在NB324K细胞细小斑块检测出的病毒（RCV）的存在的协议。

6。代表结果

一个的recPVs生产的例子ñ通过转染腺病毒基因组元素的存在或没有在图3所示。细胞转染PCMV / VP（执行副总裁细小病毒衣壳蛋白编码基因的质粒），连同PHH-1-GFP（A recPV窝藏绿色荧光蛋白基因）或PHH-1-荧光素酶（A recPV窝藏萤火虫荧光素酶基因） （+ pXX6）或无（pXX6）的pXX6质粒（携带E2A，E4（ORF6）和VA RNA基因的腺病毒）。等量的细胞粗提取物被应用到细胞，绿色荧光蛋白转导或荧光素酶检测NB324K执行在厄尔尼诺-Andaloussi 等报道^。5。一个得到明显增加在recPVs生产中存在的pXX6生产增加0.3绿色荧光蛋白转导单位（TU）的/细胞获得约5 TU /细胞得到我们的方法（ 图3A，B）的常规协议。有显着增加（约24倍）的recPV producti上也有人在PHH-1-荧光素酶（ 图3C）。这些结果表明，在pXX6所载的遗传物质是能提高细小的生产。

图4显示了一个典型的例子是通过感染recPVs生产。 NB324K细胞共感染各种recPVs（如下图所示）和Ad-VP辅助（窝藏光伏副总裁衣壳蛋白编码基因）。进一步加强广告的副总裁助手recPV产量可达70叶锡恩每种子细胞（ 图4A）在不增加发生不良复制主管病毒颗粒（ 图4B）。

图1。基于自主细小病毒的载体。 （A）上方 ：转基因替换副总裁编码基因的一部分，是根据病毒启动子P38的控制。 NS1蛋白/ 2的基因重新tained和他们的表达是由病毒启动子P4的控制。载体基因两侧的细小病毒的国际电信规则“，其中含有重组基因的复制和包装所需的顺式作用元素。底部：下一个异种（ 如巨细胞病毒），或自体（ 如 P38的）子（PX）的VP基因质粒携带，提供重组细小病毒生产过程中的反以弥补结构基因的破坏重组基因组中。艾提科信，倒末端重复。适应从图^4（二）用于生产recPVs古典协议示意图。 HEK293T细胞瞬时转染病毒DNA（载体和辅助质粒），三天后，收集细胞和病毒收获。

图2。生产与recPVs的帮助广告副总裁。 （一）原理图recPV和AD-VP基因组。在recPV含有外源基因取代的VP地区的一部分。 AD-VP怀有副总裁细小病毒基因。（二）在本手稿中描述的协议的示意图。 NB324K细胞与recPV和AD-VP病毒共同感染。三天后细胞收获和recPV颗粒从细胞裂解液中回收。

图3。刺激recPV生产由基于腺病毒载体pXX6。 PCMV / VP PHH-1-GFP（A和B）或PHH-1-荧光素酶（三）转染HEK293T细胞，接种在10厘米的菜，生产recPVs结合。同时，细胞共转染与派生的腺病毒辅助质粒pXX6或不表示。三天后转染，细胞收获和裂解三个冻融循环。等量的CRUDé病毒提取物应用于NBK指标细胞，进行了转导实验。（一）（二）代表显微镜显示GFP阳性细胞内融合NB324K单层。每种子细胞在转导单位（TU）表示量化的GFP转导检测（C）荧光素酶活性的定量表达的相对荧光素酶单位（RLU）。荧光素酶检测执行在厄尔尼诺-Andaloussi 等描述^。5。列代表从三个平均值与标准差酒吧复制。人数顶部+ pXX6列，（B和C），表示在recPV病毒滴度倍，在存在的pXX6获得与无。

图4。通过重组Ad-VP辅助病毒recPV生产的刺激。 （一）NB324K感染细胞，泰德与纯化的AD-10内政部副总裁辅助病毒（AD-X的单位/细胞，腺-X的快速滴度套件滴定），然后与重组细小病毒智HH-1-EGFP的^11（0.1以下任superinfected恩/单元）或H-1-GFP（0.5叶锡恩/细胞^）5。感染后一天被改变，中，两天后，收集细胞，并通过三个冷冻和冻融裂解。细胞粗提取物被用来确定传导检测病毒滴度，根据EL-Andaloussi 等人^。5。杜叶锡恩，转导单位（B）在AD-VP存在的情况下产生的病毒分批进行了分析其复制能力的病毒颗粒（垃圾车）NB324K指标细胞斑块检测的内容。

讨论

我们已经表明，recPV生产，可以增强腺病毒基因组元素的存在。我们已增加超过10倍（从0.3到5 TU /细胞），通过转染腺病毒基因组元素提供超过100倍的合作感染与recPV结合的细胞与AD-VP辅助recPV产量比较传统的协议。这里所描述的协议可以进一步优化，确定交付的腺病毒基因组元素和被感染的AD-VP帮手的最佳浓度为最适当的时机。

较大的转基因（超过1600个碱基）RecPVs是生产效率?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
DMEM培养液	西格玛	D5796
的MEM	西格玛	M4655
胎儿牛血清	临时机场管理局	A15-101
L-谷氨酰胺	Gibco公司	25030-024
fugene	罗氏公司	047097050001
胰蛋白酶EDTA	Invitrogen公司	25300062
benzonase核酸	西格玛	E8263
腺病毒-X的快速滴度套件	Clontech公司	632250