استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

Summary

يمكن قياس Kv7 (KCNQ) البوتاسيوم في النشاط قناة myocytes الشرايين معزولة (باستخدام تقنيات التصحيح المشبك الكهربية) بالتوازي مع قياسات المضيقة / موسع الردود (باستخدام تخطيط العضل الضغط) يكشف عن معلومات مهمة حول دور كل من القنوات في الأوعية الدموية Kv7 علم وظائف الأعضاء والعضلات الملساء علم الصيدلة.

Abstract

انكماش أو التخفيف من خلايا العضلات الملساء في جدران الشرايين المقاومة يحدد قطر الشريان وبالتالي تسيطر على تدفق الدم عبر الأوعية ويساهم في ضغط الدم النظامية. وينظم عملية انكماش في المقام الأول تركيز الكالسيوم عصاري خلوي ([CA ^{2 +]} _CYT)، والذي هو بدوره يسيطر عليها مجموعة متنوعة من نقل أيون والقنوات. القنوات الأيونية هي وسيطة مشتركة في مسارات نقل الإشارة تفعيلها من خلال الهرمونات فعال في الأوعية تضيق الأوعية أو لإحداث توسع الأوعية. وغالبا ما يتم استهداف القنوات الأيونية من العوامل العلاجية عمدا إما (مثل حاصرات قنوات الكالسيوم تستخدم للحث على توسع الأوعية وانخفاض ضغط الدم) أو عن غير قصد (مثل للحث على غير المرغوب فيه الآثار الجانبية القلبية الوعائية).

وقد تم مؤخرا Kv7 (KCNQ) قنوات البوتاسيوم الجهد تنشيط تورط بأنها مهمة targ الفسيولوجية والعلاجيةETS لتنظيم تقلص العضلات الملساء. لتوضيح أدوار محددة من Kv7 القنوات في كل من نقل الإشارة والفسيولوجية في أعمال العوامل العلاجية، ونحن بحاجة لدراسة كيفية نشاطهم هو التضمين على المستوى الخلوي، فضلا عن مساهمتها تقييم في سياق الشريان سليمة.

الشرايين المساريقي الفئران توفير نظام نموذجا مفيدا. ويمكن الشرايين تشريح بسهولة، وتنظيفها من النسيج الضام، وتستخدم لإعداد myocytes الشرايين معزولة عن التصحيح المشبك الكهربية، أو مقنى وضغط لقياسات مضيق للأوعية / عائي الردود في ظل الظروف الفسيولوجية نسبيا. نحن هنا تصف الأساليب المستخدمة لكلا النوعين من القياسات وتقديم بعض الأمثلة للكيفية التي يمكن أن تكون متكاملة في التصميم التجريبي لتوفير فهم أوضح للأدوار هذه القنوات الأيونية في تنظيم نغمة الأوعية الدموية.

Protocol

1. جراحية استئصال الأمعاء الصغيرة مساريقي مركز الألعاب الأوعية الدموية

1. تخدير ل300-400 ز سبراغ داولي الفئران مع isoflurane (4٪) تدار عن طريق الإستنشاق.
2. إجراء البطن خط الوسط لفضح مساريق الصغيرة الأمعاء. Exteriorize الأمعاء الصغيرة والكبيرة من خلال شق في البطن بقدر كبير من العناية لتجنب الصدمة إلى الأمعاء المكشوفة ومساريق. تأجيج بلطف مساريق على مدى شاش معقم.
3. المكوس جراحيا الأمعاء الدقيقة وجزء من الأمعاء الغليظة، بما في ذلك الأعور (الأوعية الدموية قطع بعناية على طول الهوامش وعلى أصول من فروع الرئيسية للالمساريقي العلوي الشريان / الوريد).
4. نقل الأنسجة رفعه إلى دورق يحتوي على الجليد الباردة حل تشريح (الجدول 1).
5. بعد استئصال الأمعاء، ينبغي على الفئران بينما يصرح باستخدامها إنسانية تحت التخدير.

2. تشريح للد تنظيف الشرايين

1. نقل الأمعاء رفعه والممرات المساريقي إلى غرفة تبريد تشريح (4-5 ° C) التي تحتوي على حل تشريح. غرفة تتكون من طبق بتري 100-مم الزجاج مع المطاط الصناعي قاعدة SYLGARD 184 إلى استيعاب دبابيس تشريح؛ يتم وضع طبق بتري في قاعدة تبريد التي يتم الاحتفاظ في C ° 4-5 من حمام الماء المنتشرة.
2. باستخدام مقص جراحي قطع شريحة سم تقريبا 10-12 من الأمعاء كلها. قطع في كل نهاية الجزء المعوية حفظ الأوعية الدموية المرفقة به، ثم قم بإزالة الأمعاء غير المستخدمة من الغرفة وترك الجزء واحد مع الأوعية الدموية المرفقة به (ممر المساريقي) في عزلة.
3. انخفاض الرقم جزء من الأمعاء الدقيقة، ونشر أكثر من مساريق الجانب القريب من الغرفة بحيث فرع الرئيسي للالمساريقي العلوي الشريان / الوريد في وسط وأوامر لاحقة من فروع تشع من المركز (الشكل 1). رر الآس دبابيس فقط على قطاعات الأمعاء (وليس على الأوعية الدموية).
4. تمييز الشرايين من الأوردة من لونها أحمر فاتح نسبيا، جدران سميكة ومميزة فروع على شكل حرف V، وليس على شكل U فروع ينظر في الأوردة.
5. تصور من خلال مجهر تشريح مضيئة، قم بإلغاء بعناية الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة المحيطة ^{الثانية} 2-4 الشرايين أجل ^عشر على مقربة من الأمعاء (دائرة متقطع في الشكل 1) باستخدام ملقط ومقص الصغيرة. عقد الأوردة المجاورة يسهل تطهير الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة. تجنب لا لزوم لها تمتد من الشرايين.
6. ويمكن بعد ذلك شرائح الشريان المساريقي تطهيرها من النسيج الضام أن تشريح من وتستخدم لعزل الخلايا (على دراسات وحيدة الخلية المشبك التصحيح، مقاطع 3-4) أو مقنى لتخطيط العضل الضغط (القسم 5). قطع شرائح بين نقاط فرع، عادة ما يصل إلى 1 سم في الطول.

jove_title "> 3. زنزانة انفرادية للدراسات المشبك التصحيح

1. إعداد 0.5 لتر من محلول العزل (الجدول 1) وتقسيمه إلى 2 أجزاء قبل ضبط درجة الحموضة. يجب أن تكون درجة حرارة الجزء الأول (عادة 100 مل) حتى 37 ° C وينبغي تعديل درجة الحموضة إلى 7.2 في 37 ° C (37 ° C الحل عزل). يجب تبريد الجزء الثاني من الحل عزل أسفل إلى 4 ينبغي تعديل ° C ودرجة الحموضة إلى 7.2 في 4 درجات مئوية (الجليد الباردة حل العزل). بعد ضبط الأس الهيدروجيني، يجب على كل من الحلول الأسمولية تعديلها الى 298 الميلي أسمول بإضافة كمية مناسبة من السكر D-H أو O. ₂
2. نقل 2 مل من محلول 37 ° C العزلة إلى قارورة زجاجية واحتضان في C ° 37 للاستخدام في الخطوة 3.4. إضافة 20 ملغم من ألبومين المصل البقري (BSA) إلى 10 مل من محلول 37 ° C عزل، حل، إعادة تسخين إلى 37 ° C وتعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.2. ل2 مل من هذا الحل إضافة 4 ملغ كولاجيناز نوع VIII (سيغما، ولوط 089K8612: 633 شالقمل / ملغ النشاط كولاجيناز، 285 وحدة / ملغ النشاط Caseinase، 1.6 وحدة / ملغ النشاط Clostripain)، 0.64 ملغ إيلاستاز النوع الرابع (سيغما، ولوط 110M7025V 5.9 وحدات سكنية / ملغ؛ اضافة 40 ميكرولتر من مخزون ملغ / مل أعد في 37 16 ° C حلول العزل) و 2 ميكرولتر من 1 DL-M dithiothreitol (DTT سيغما)؛ دافئة قبل هذا الحل أنزيم إلى 37 ° C استعدادا لخطوة 3.5.
3. نقل 2-3 شرائح الشريان المساريقي في طبق نسيج الثقافة التي تحتوي على 35-مم 2 مل من محلول الجليد الباردة وعزل مكان الطبق على الجليد. قطع شرائح الشريان المساريقي إلى قطع طويلة مم 3-4.
4. باستخدام ماصة باستور مع تلميح النار مصقول (لمنع تلف الشرايين) نقل قطاعات الشرياني إلى قارورة زجاج (15 × 45 مم، 1 DRAM) يحتوي على 2 مل قبل تحسنت 37 ° C الحل عزل واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C.
5. بعد 30 دقيقة، نضح بعناية ال 37 ° C عزل الحل باستخدام ماصة باستور، إضافة 2 مل محلول أنزيم الدافئة واحتضان لمدة 35 دقيقةفي 37 ° C.
6. مباشرة بعد دقيقة الحضانة 35 في الحل انزيم، ضع قارورة على الجليد، نضح الحل انزيم وإضافة 2 مل من محلول الجليد الباردة عزل (الطموح تكرار وإضافة جديدة عزل الجليد الباردة حل 4 مرات). ثم، في حجم 1 مل من محلول الجليد عزل الباردة، يسحن بلطف شرائح الشرايين مع مصقول مرات باستور 10-20 ماصة للافراج عن الفردية المساريقي خلايا العضلات الملساء الشريان (MASMCs).
7. تحقق من ظهور دوري myocytes عن طريق وضع قطرة من تعليق الخلية على طبق 35-مم وعرضها تحت المجهر. يجب MASMCs صحية لها مظهر ناعم ممدود. لن يتم الإفراج عن جميع من الخلايا في جدران الشرايين. ينبغي أن تظل الخلية التعليق على الجليد.
8. آخر مؤشرا مفيدا للصحة MASMC هو تسامحها الفسيولوجية تركيزات الكالسيوم ^{+ 2.} ملء غرفة التسجيل (أدوات العلوم البيولوجية، CSC-25L #) مع حمام قolution تحتوي على 2 مم CaCl ₂ (الرقم الهيدروجيني 7،3 في درجة حرارة الغرفة (RT)، لتكوين أنظر الجدول 1) وموقف الجسر أجار (الشعرية مليئة الزجاج عازمة أجار مع 2٪ في بوكل M 2، إدراجها في الإلكترود المرجعي (وارنر الصك، REF -3L)) داخل الغرفة. باستخدام ماصة باستور مصقول، ونقل ما يقرب من 100-200 ميكرولتر تعليق الخلية إلى دائرة التسجيل والسماح للخلايا الالتزام لمدة 15 دقيقة. ينبغي الخلايا غير التالفة لا ينكمش بدرجة كبيرة في مم 2 CaCl _{2-المحتوية} على الحل (الخلايا يجب أن تظهر لتكون مستطيلة أو على شكل قضيب، وليس تقريب يصل الى كرات).
9. وينبغي بعد إضافة قسامة الأول من التعليق الخلية إلى غرفة تسجيل، 0.25 مل من محلول يحتوي على حمام 2 مم تضاف CaCl ₂ إلى حجم ما تبقى من التعليق الخلية. يمكن الحفاظ على هذا التعليق الخلية المتبقية في هذا الحل على الجليد واستخدامها لتسجيل المشبك التصحيح لمدة تصل إلى 6 ساعة.

4.استخدام المشبك التصحيح الجامعة خلية لقياس التيارات Kv7 البوتاسيوم أو غشاء الجهد

1. بعد myocytes الانضمام إلى قاعدة الزجاج للغرفة تسجيل (25 ملم رقم الغطاء زلة الدور 1، وارنر الصكوك)، والشروع في نضح المستمر من الحل حمام (الجدول 1). لتسجيل Kv7 التيارات بمعزل عن التيارات البوتاسيوم المعدل تأخر من Kv1 وKv2 الأسر، ينبغي أن تستكمل الحل حمام مع 100 ميكرومتر GdCl _3.
2. افتعال ماصة التصحيح من الزجاج البورسليكات (Kimax-51، كيمبل تشيس) باستخدام مجتذب ماصة وmicroforge؛ مقاومته يجب أن تكون 4-5 MΩ عندما مليئة الحل الداخلي (الجدول 1). معطف أيهما أقل. ^_1/3 من ماصة (~ 1-2 ملم فوق تلميح) مع SYLGARD 184
3. لتسجيل التيارات Kv7 في MASMCs، ينبغي استخدام مثقب التصحيح الجهد خلية كاملة تقنية المشبك. استخدام تكوين التصحيح مثقبة يساعد على منع depletioن من فوسفتيدلينوستول غشاء 4،5-bisphosphate (PIP ₂₎ وسريعة لاحقة (خلال 5 دقائق) المتهدمة من التيارات Kv7، الذي يتم الاحتفال عادة باستخدام التكوين التقليدية التصحيح تمزق. تكملة الحل الداخلي (الجدول 1) مع 120 ميكروغرام / مل الامفوتريسين B: إضافة 3 ميكرولتر من الأسهم ملغ / مل 2 من الامفوتريسين B (أعد في DMSO وتجميدها في مأخوذة الصغيرة ومحمية من الضوء) إلى 0.5 مل من محلول الداخلية. ملء غيض من ماصة التصحيح مع حل B خالية الامفوتريسين الداخلية عن طريق غمس طرف ماصة في حل B خالية الامفوتريسين الداخلية ومن ثم تطبيق الشفط على الطرف الآخر باستخدام حقنة 10 مل تعلق عبر قطعة من أنابيب (R-Tygon 3603). إضافة الامفوتريسين حل ماصة تحتوي على B-من أعلى باستخدام تلميح ماصة إيبندورف Microloader حتى ماصة حوالي ملء نصف مع الحل. إزالة أي فقاعات الهواء من خلال استغلال بلطف ماصة. استخدام ماصة على الفور.
4. إدراج ماصة فيلصاحب القطب واستخدام مياداة مجهرية لخفض ماصة إلى السطح من خلية عضلية ممدود (بالقرب من، ولكن ليس على رأس النواة، الشكل 2). عندما المقاومة في ماصة يزيد على 6-10 MΩ، وتطبيق الشفط لتحقيق GIGA-الختم (> 10 GΩ).
5. تعيين إلى 0 عقد الجهد بالسيارات أثناء انتظار ثقب الغشاء. تطبيق MS 100 الخطوات الجهد إلى +10 بالسيارات ومن ثم إلى -10 بالسيارات، واستخدام مكبر للصوت للتعويض سريع العابرين السعة ماصة. وبالتزامن مع ظهور كل العابرين السعة زنزانة صغيرة التيارات إيجابية مستمرة (عادة 2-10 باسكال) تشير إلى وجود قنوات Kv7 الوظيفية.
6. وانثقاب ناجحة مع الامفوتريسين B تقليل المقاومة الوصول إلى 35 MΩ أو أقل. ويمكن بعد ذلك أن يبدأ التسجيل الحالية باستخدام الجهد ثوانى 5 بروتوكول خطوة من الجهد القابضة -4 بالسيارات. نستخدم الجهد بالسيارات -4 عقد لتحقيق أقصى تعطيل بالقرب من الأنواع الأخرى من تأخر تفصيلالتيارات البوتاسيوم tifier (توسط في الغالب من قبل Kv1 وKv2 قنوات) التي من شأنها أن تلوث خلاف ذلك تسجيل التيارات الصغيرة نسبيا Kv7 غير تعطيل. منذ فترة طويلة خطوة الجهد (5 ثانية) البروتوكول هو ضروري لتحقيق حالة استقرار تفعيل قنوات Kv7، والتي تظهر بطيئة الجهد التي تعتمد على تفعيل والتعطيل. التيارات Kv7 لا تعطيل الخطوات خلال الجهد المتواصل.
7. لتسجيل Kv7 الحالية ذات الجهد (IV) العلاقة، تطبيق 5 خطوات لالفولتية الجهد ثانية تتراوح بين -84 بالسيارات، حيث احتمال فتح قنوات للKv7 هو الحد الأدنى، ل+16 بالسيارات التي من احتمال فتح قنوات تصل إلى Kv7 الهضبة، وبعد 5 ثانية في كل اختبار الجهد، خطوة الى الوراء لعقد الجهد (إم -4) لمدة 10 ثانية. سوف يستغرق حوالي 3.5 دقيقة لسلسلة كاملة من البقول اختبار (الشكل 3A). 2-3 تنفيذ مراقبة التسجيلات الرابع للتأكد من أن التيارات سجلت مستقرة على مر الزمن. مؤامرة متوسط ​​نهاية نبض التيارات (متوسطالتيارات المسجلة لثانية 1 السابق) مقابل الجهد لخلق منحنى الرابع (الشكل 3D). ينبغي IV منحنيات السيطرة فرضه تقريبا إذا التيارات مستقرة.
8. قبل تطبيق أي وكلاء الدوائية بدء دوام بروتوكول مصممة لتسجيل مستمر الحالي في بالسيارات -20. ضمان تسجيل مستقرة للتيار لمدة لا تقل 5 دقائق قبل تطبيق الدواء. تطبيق كلاء الدوائية لمدة بين 5-15 دقيقة أو حتى يتم التوصل إلى حالة مستقرة-(الشكل 3C)؛ ثم إنهاء بروتوكول دوام وسجل اثنين من منحنيات IV باستخدام بروتوكول الجهد الخطوة. تبييض المخدرات وبالطبع تسجيل وقت تبييض المخدرات، تليها تسجيل اثنين من منحنيات IV إضافية.
9. في نهاية التجربة تطبيق 10 ميكرومتر أو linopirdine 10 ميكرومتر XE991، مثبطات لا رجعة فيه Kv7 القنوات، وهذه الأدوية يجب أن تمنع تماما التيارات الفولتية السلبية المسجلة في لبالسيارات -20 (الشكل 3D).
10. بعد كل تجربة غسل نظام غرفة ونضح مع المنظفات، والإيثانول والماء الساخن لإزالة أي آثار للأدوية المستخدمة.

5. استخدام شرائح الشريان سليمة لتخطيط العضل الضغط

1. ويستخدم نظام الضغط مخطاط العضل شراؤها من التكنولوجيا ميو الدنماركية (DMT A / S، الدنمارك، الموديل 110P) لضغط التجربة تخطيط العضل. تحميل الجزء الشريان في قاعة الفولاذ المقاوم للصدأ وذلك بإضافة ثابتة أفقيا قنية الزجاج اليسار إلى نهاية واحدة والمنقولة قنية الزجاج الحق في الطرف الآخر. يتم بناؤها محولات الضغط اثنين (P1 على الحق وP2 على الجانب الأيسر) في رصد الضغط داخل تجويف الشريان. وسيتم استخدام السائل من الزجاج قنية الحق في ضبط الضغط داخل الشريان إلى مستواه الفسيولوجية تقريبية. لتبدأ، قبل ملء مفتوح حقنة مل 10 (بمثابة العمود ضغط الجاذبية تغذية)، مع حل التجويف (الجدول 1). رفع حقنة لدفع سولونشوئها عبر أنابيب البولي ايثيلين في قنية الزجاج الحق، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء في أنابيب أو قنية. وينبغي على اليسار قنية مسبقا مليئة الحل التجويف عن طريق حقنة 1 مل. ملء الغرفة مع الضغط مخطاط العضل 10 مل من محلول حمام السفينة (الجدول 1). تعليق فضفاضة اثنان قبل الصنع خيوط النايلون غرامة على كل جانب بالقرب من القنيات الزجاج.
2. نقل بعناية تشريح الشريان المساريقي قطعة (عادة ما يكون النظام ^ال 3 ^ش أو 4 الجزء، حول 200 حتي 350 ميكرومتر في القطر؛ من الخطوة 2.6) من غرفة تشريح للضغوط غرفة مخطاط العضل من خلال عقد واحد على نهاية الجزء الخاص الصغيرة ملقط.
3. تصور من خلال مجهر تشريح مضيئة، وعقد واحدة من نهاية الجزء الشريان وحرك برفق على يسار قنية الزجاج وتأمين نهاية باستخدام الخيوط الجراحية النايلون. تدفق السائل بلطف من خلال التجويف السفينة التي شنت لإزالة الدم والحطام داخل السفينة.وينبغي بعد ذلك صمام إلى اليسار حقنة تكون مغلقة حتى هذا الجانب يمثل العمود ثابت من السوائل على أساسها يتم ضبط ضغط من الجانب الأيمن.
4. باستخدام مياداة مجهرية، ضع المنقولة قنية الزجاج الحق أقرب إلى الجزء الشريان وسحب الطرف الأيمن للجزء أكثر من ذلك، وتأمين أخيرا مع خيوط النايلون. مقطع من على المواضيع خياطة الزائدة.
5. تركيب وحدة مخطاط العضل الضغط على المسرح خلال الضغط المجهر مخطاط العضل. وضع غطاء على ضغط الدائرة مخطاط العضل. الغطاء عن غرفة تحتوي على مدخل superfusion وأنابيب شفط المرتبطة به. ربط مدخل إلى superfusion متعددة للسماح superfusion من حمام درجة حرارة الغرفة أو 60 ملي بوكل حل في غرفة الضغط مخطاط العضل عن طريق الجاذبية. عموما يتم تطبيق المواد الاختبار، مثل المخدرات أو الهرمونات التي توجد في المشبك التصحيح القياسات أن تؤثر على وظيفة قناة Kv7، مباشرة إلى حل حمام، وليس عن طريق حمام سوبerfusion أو في الحل التجويف. سيتم استخدام superfusion من حل حمام لتغسل الحل بوكل. إرفاق أنابيب الشفط لنظام فراغ لإزالة superfusate الزائدة. إدراج استشعار درجة الحرارة في الحمام الحل من خلال فتح غطاء المقدمة في غرفة مخطاط العضل.
6. توصيل الوحدة مخطاط العضل الضغط على نظام ميو واجهة، والأجهزة التي تمكن الاتصالات من وحدة مخطاط العضل إلى برنامج myoview (DMT).
7. فتح برنامج myoview في الكمبيوتر. في إطار معلمة، تعيين درجة حرارة الهدف ك C ° 35 التسامح مع درجة الحرارة من 1 ° C، الهدف ضغط تدفق و80 مم زئبق وضغط تدفق الهدف إلى 80 مم زئبق. تحميل ملف معايرة ومعايرة قطر السفينة الخارجي بحيث يتم تسجيل التغييرات في قطر الشريان بدقة في ميكرون. ضبط التباين حسب الضرورة لتمكين عرض جيد للجزء شنت ضد الخلفية. وصف مفصل لكيفية استخدام البرنامجوتقدم في دليل المستخدم من DMT.
8. رفع المحقنة تدريجيا مل 10 (بمثابة العمود ضغط الجاذبية تغذية) على مدى فترة من 15 دقيقة حتى محول الضغط P1 يقرأ 80 مم زئبق. بينما رفع ضغط العمود، تحقق من وجود أي تسرب في السفينة. إذا كان هناك أي تسرب، تجاهل الجزء وجبل مقطع آخر الشريان (كرر الخطوات من 5.2). ضبط المسافة بين القنيات عند الضرورة. ينبغي تعديل المسافة في مثل هذه الطريقة أن الجزء الشريان الضغط مستقيم تقريبا (ولكن امتدت لا) ويشكل الكتف مثل النمط حيث تتخذ العلاقات (الشكل 4A).
9. بدوره على تسخين الضغط من خلال غرفة مخطاط العضل عناصر التحكم في نظام واجهة ميو. يسمح الحل لتدفئة الحمام تدريجيا حتى تصل 36-37 ° C.
10. استخدام التعديلات XYZ هدف في المجهر DMT عند الضرورة للحفاظ على السفينة في التركيز وتسهيل تتبع دقيق للCHanges في قطر السفينة الخارجي.
11. التحقق من صلاحية السفينة التي مارستها superfusion عابرة (~ 30 ثانية) مع بوكل 60 ملم. سفينة قابلة للحياة يضيق بسرعة على إضافة بوكل ويتوسع فور تبييض ملي بوكل من 60 (superfuse حوالي 60 مل من محلول لغسل الحمام خارج بوكل). بعد هذا الاختبار، إعادة ضبط حجم المحلول إلى حمام بالضبط 10 مل. يتم تقليل درجة حرارة الحمام أثناء الاختبار بوكل وتبييض لأن هذه الحلول هي في درجة حرارة الغرفة، ولكن سخان الغرفة ستقوم استعادة درجة الحرارة إلى 36-37 درجة مئوية في غضون بضع دقائق.
12. تسمح الشريان لتتوازن للا يقل عن 30 دقيقة (القطر يجب أن تكون مستقرة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة الأخيرة من هذه الفترة). إضافة مادة الاختبار المركزة في حل حمام مباشرة وماصة بلطف ذهابا وإيابا بالقرب من حواف الدائرة لخلط مادة الاختبار في حل حمام، مما أسفر عن تركيز المناسبة النهائي في المجلد 10 غرفة مل. تشانيمكن رصدها في الآتي GES بالإضافة سفينة القطر من مادة الاختبار (ق) في الصورة ورسمت لقطات فيديو حية أيضا في الصورة إطار التحليل في حين أن التجربة قيد التقدم.
13. بعد الانتهاء من التجربة، يمكن فتح البيانات المخزنة (*. ميو) الملف كملف جدول بيانات لمزيد من التحليل.

6. ممثل النتائج

النتائج مبين في الشكل 3 توضيح تسجيلات نموذجية من التيارات Kv7 من myocytes الشريان المساريقي باستخدام بروتوكول خطوة الجهد قبل (الشكل 3A، B آثار الأسود) وأثناء العلاج مع قناة بيريثيون الزنك Kv7 المنشط (ZnPyr، 100 نانومتر؛ 3A الشكل، B آثار أحمر). وبلغ متوسط ​​مماثلة البيانات الخطوة الجهد من 3 خلايا لإعداد الحالية ذات الجهد (IV) هو مبين في المخططات 3D الشكل. دورة الوقت ممثل تعزيز السعة الحالية (التي تقاس المشبك الجهد المستمر في بالسيارات -20) الزيتوويرد ز العلاج مع الزنك بيريثيون 100 نانومتر في الشكل 3C الشكل 4B يوضح مسار الوقت للتأثير على قطر ZnPyr الشريان المساريقي الخارجي قياسها باستخدام تخطيط العضل الضغط؛ السفينة كانت مقيدة قبل مع 100 فاسوبريسين أرجينين مساء (AVP) قبل إضافة ZnPyr 100 نانومتر. وتظهر متوسط ​​الجرعة والاستجابة للبيانات التي يسببها تمدد ZnPyr الشريان المساريقي في الشكل 4C.

الشكل 1. صورة لممر المساريقي في غرفة تشريح.

الشكل 2. صورة لخلية عضلية مع ماصة التصحيح على سطحه.

الشكل 3. آثار الأصل من تيارات Kv7، ملعب الوقت من المخدرات تطبيق، والمنحنيات IV. A. العائلة من آثار متتابعة الحالي (اللوحة السفلى) سجلت ردا على الخطوات الجهد (اللوحة العلوية) قبل العلاج (السيطرة، أسود) وتحقيق الاستقرار التالية في وجود ZnPyr نانومتر 100 (الحمراء) في MASMC واحد. B. آثار الممثل الحالي من A (كما يتبين من رؤوس الأسهم) للسيطرة (السوداء) وZnPyr نانومتر 100 (الحمراء). خطوط رمادية تشير إلى الفاصل الزمني حيث تم قياس متوسط ​​سعة الحالية للمؤامرات (IV) الجاري الجهد. يشار إلى الفولتية خطوة على رؤوس سهام الحق. C. بالطبع وقت Kv7 تعزيز ZnPyr الحالي بنسبة 100 نانومتر قياس الجهد المستمر مع المشبك في -20 بالسيارات (بار). D. متوسط ​​IV منحنيات (ن = 3) المستمدة من Kv7 الكثافة الحالية سجلت قبل (التحكم، والدوائر شغل)، خلال فترة العلاج مع ZnPyr نانومتر 100 (الدوائر المفتوحة)، وخلال فترة العلاج مع 10 ميكرومتر XE991 (مثلثات شغل). تم طرح التيارات تسرب غير محددة كما وصفها آخرون باسمور ^1.

الأنف والحنجرة ">
الشكل 4. ZnPyr الناجم عن استرخاء في الشريان المساريقي قبل ضيق مع AVP PM 100. شنت الصورة A. من الشريان المساريقي في مخطاط العضل الضغط انشاء. B. بالطبع وقت التغييرات في القطر الخارجي للسفينة ردا على تطبيق AVP PM 100 (بار مفتوح) ثم طلب من ZnPyr نانومتر 100 (بار شغل). C. بار الرسم البياني يلخص النتائج من 100 vasodilaion ZnPyr التي يسببها نانومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الأساليب والنهج التجريبي الموصوفة هنا هي قوية جدا ويمكن أن تسفر عن نتائج واضحة وقابلة للتكرار عندما يطبق مع الاهتمام بالتفاصيل الدقيقة. التسجيلات الكهربية جيدة وانقباض / تمدد الشرايين قطاعات تعتمد على صحة الخلايا وشرائح الشريان، على التوالي. يمكن الاستعدادات الخلي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
كلوريد الصوديوم	سيجما	S5886	تشريح الحل: 145 الحل نوم للالكهربية *: 140 الداخلية الكهربية حل ل: 10 الحل العزلة عن myocytes *: 140 الحل لتخطيط العضل حمام الضغط: 145 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 145
البوتاسيوم كلوريد	سيجما	P5405	تشريح الحل: 4.7 الحل نوم للالكهربية *: 5،36 الداخلية الكهربية حل ل: 135 الحل العزلة عن myocytes *: 5،36 الحل لتخطيط العضل حمام الضغط: 4.7 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 4.7
البوتاسيوم EGTA	سيجما	E4378	الداخلية حل لالكهربية: 0.05
HEPES	سيجما	H9136	الحل نوم للالكهربية *: 10 الداخلية الكهربية حل ل: 10 الحل العزلة عن myocytes *: 10
الصوديوم الهيدروجين الفوسفات	سيجما	S5136	الحل العزلة عن myocytes *: 0.34
البوتاسيوم الهيدروجين الفوسفات	سيجما	P5655	الحل العزلة عن myocytes *: 0.44
المغنيسيوم كلوريد	سيجما	M2393	الحل نوم للالكهربية *: 1.2 الداخلية حل لالكهربية: 1 الحل العزلة عن myocytes *: 1.2
كلوريد الكالسيوم	سيجما	الحل نوم للالكهربية *: 2 الحل العزلة عن myocytes *: 0.05
فوسفات الصوديوم	فيشر العلمية	BP331-1	تشريح الحل: 1.2 الحل لتخطيط العضل حمام الضغط: 1.2 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 1.2
كبريتات المغنيسيوم	سيجما	M2643	تشريح الحل: 1.17 الحل لتخطيط العضل حمام الضغط: 1.17 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 1.17
اجتماعات الأطراف	فيشر العلمية	BP308	تشريح الحل: 3 الحل لتخطيط العضل الضغط حمام: 3 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 3
حمض البيروفيك	سيجما	P4562	تشريح الحل: 2 الحل نوم للتخطيط العضل الضغط: 2 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 2
EDTA ثنائي الماء	البحث العضوية	9572E	تشريح الحل: 0.02 الحل لتخطيط العضل حمام الضغط: 0.02 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 0.02
D-غلوكوز	سيجما	G7021	تشريح الحل: 5 الحل نوم للالكهربية *: 10 الداخلية الكهربية حل ل: 20 الحل العزلة عن myocytes *: 10 الحل لتخطيط العضل الضغط حمام: 5 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 5
الأبقار مصل الزلال	سيجما	A3912	تشريح الحل: 1٪ التجويف حل لتخطيط العضل الضغط: 1٪
درجة الحموضة			تشريح محلولن: 7.4 الحل نوم للالكهربية *: 7.3 الداخلية حل لالكهربية: 7.2 الحل العزلة عن myocytes *: 7.2 الحل لتخطيط العضل حمام الضغط: 7.4 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 7.4
الأسمولية			تشريح الحل: 300 الحل نوم للالكهربية *: 298 الداخلية الكهربية حل ل: 298 الحل العزلة عن myocytes *: 298 الحل لتخطيط العضل حمام الضغط: 300 الحل لتخطيط العضل ضغط التجويف: 300
			* 11
			الجدول 1. مكونات الحلول المستخدمة في التجربة.