היכרות עם פונקצית עורקי שריר חלק Kv7 אשלגן ערוץ באמצעות אלקטרופיזיולוגיה קלאמפ תיקון וMyography לחץ

Summary

מדידות של Kv7 פעילות ערוץ (KCNQ) אשלגן בmyocytes העורק המבודד (באמצעות תיקון לצבוט טכניקות אלקטרו) במקביל למדידות של תגובות הכווץ / מרחיב (באמצעות myography לחץ) יכולות לחשוף פרטים חשובים על התפקידים של Kv7 ערוצים בפיזיולוגיה של שריר חלק של כלי דם ו פרמקולוגיה.

Abstract

התכווצות או הרפיה של תאי שריר חלק בתוך החומות של עורקי התנגדות קובעת את הקוטר העורק ובכך שולטת בזרימת הדם דרך כלי הדם ותורמת ללחץ דם מערכתי. תהליך ההתכווצות מוסדר בעיקר על ידי ריכוז cytosolic סידן ([Ca ^{2 +]} _CYT), שהוא בתורו נשלט על ידי מגוון רחב של מובילי יון וערוצים. תעלות יונים הן חומרי ביניים נפוצים במסלולי העברת אותות המופעלים על ידי הורמוני vasoactive לחולל התכווצות כלי דם או הרחבת כלי דם. ותעלות יונים לעתים קרובות ממוקדות על ידי סוכנים טיפוליים בכוונה (חוסמי תעלות סידן כגון שימוש כדי לגרום התרחבות ולחץ דם נמוך) או שלא בכוונה (למשל כדי לגרום לתופעות לוואי לא רצויות לב וכלי דם).

(KCNQ) ערוצי אשלגן מתח הופעל Kv7 לאחרונה היו מעורבים כטארג פיסיולוגי והטיפולי חשובETS לויסות התכווצות שריר חלק. כדי להבהיר את התפקידים הספציפיים של Kv7 ערוצים הוא בהעברת אותות פיזיולוגית ובפעולות של סוכנים טיפוליים, אנחנו צריכים ללמוד איך הפעילות שלהם היא מווסתת ברמה התאית, כמו גם להעריך את תרומתם בהקשר של העורק ללא פגע.

עורקי mesenteric העכברוש מספקים מערכת מודל שימושית. העורקים יכולים להיות גזורים בקלות, ניקו של רקמת חיבור, ומשמשים להכנת myocytes העורק מבודד לתיקון המהדק electrophysiology, או cannulated ולחץ גבוה למדידות של תגובות vasoconstrictor / vasodilator בתנאים יחסית פיסיולוגיים. כאן אנו מתארים את השיטות המשמשות לשני הסוגים של מדידות ולספק כמה דוגמאות כיצד ניתן לשלב עיצוב הניסיון לספק הבנה ברורה יותר של התפקידים של תעלות יונים אלה בויסות טונוס כלי דם.

Protocol

1. כריתה כירורגית של ארקייד כלי הדם קטן מעי mesenteric

1. הרדם 300-400 חולדה גרמה ספראג-Dawley עם isoflurane (4%) המנוהלת על ידי שאיפה.
2. בצע laparotomy קו אמצע לחשוף לפדר המעי הדק. Exteriorize מעי הדק וגדול דרך החתך בבטן בזהירות רבה כדי להימנע מטראומה למעי ולפדר החשוף. עדינות ללבות לפדר מעל גזת סטרילי.
3. ניתוח בלו מעי הדק וחלק מהמעי הגס, כולל המעי האטום (כלי דם לחתוך בזהירות בשולים ובמקורות מהענפים העיקריים של עורק mesenteric / וריד המעולה).
4. העברת הרקמות נכרתו למבחנה המכילה תמיסה לנתח קרה כקרח (טבלה 1).
5. לאחר הכריתה של המעי, החולדה צריכה להיות מורדמת הומנית תחת הרדמה.

2. נתיחהניקוי ד של עורקים

1. להעביר את המעי שנכרת וארקייד mesenteric לחדר ביתור מקורר (4-5 ° C) המכיל פתרון לנתח. התא מורכב מצלחת 100-מ"מ זכוכית פטרי עם בסיס אלסטומר SYLGARD 184 כדי להתאים סיכות מבתרות; צלחת פטרי מונחת בבסיס מקורר שנשמר ב4-5 מעלות צלזיוס באמבט מים במחזור.
2. בעזרת מספרי כירורגיות לחתוך כ 10-12 סנטימטר קטע מתוך כל המעי. לחתוך בכל קצה של קטע מעי שמירת vasculature המצורף, ולאחר מכן להסיר את המעי שאינו בשימוש מהתא משאיר קטע אחד עם כלי הדם המחוברים אליו (ארקייד mesenteric) בבידוד.
3. להצמיד את הקטע של מעי דק, מתפשט לפדר מעל הצד הקרוב של החדר כזה, שהסניף הראשי של mesenteric המעולה עורק / וריד הוא במרכז ואת הצווים הבאים של להקרין סניפים מהמרכז (איור 1). Pl אס הפינים רק על מגזרי המעיים (לא על כלי הדם).
4. להבדיל מעורקי ורידים לפי צבעם הבהיר יחסית האדום, קירות עבים וענפים אופייניים בצורת V, ולא את הענפים בצורת האות ראו בורידים.
5. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מואר, נקה את רקמת השומן ורקמת חיבור המקיפה את 2 ^nd זהירות - 4 עורקי סדר ^ה קרובה למעי (העיגול מקווקו באיור 1) באמצעות מלקחיים ומספריים מייקרו. מחזיק את הוורידים הסמוכים מאפשר ניקוי רקמת השומן ורקמת חיבור. הימנע ממתיחה מיותרת של העורקים.
6. מקטעי עורקי mesenteric נוקו מרקמת חיבור אז יכולים להיות גזורים החוצה ומשמשים לבידוד תא (למחקרים מהדקים תיקון תא בודד, סעיפי 3-4) או cannulated לmyography לחץ (סעיף 5). לחתוך קטעים בין נקודתי הסתעפות, בדרך כלל עד 1 סנטימטר באורך.

jove_title "בידוד> 3. נייד ללימודי קלאמפ תיקון

1. הכן 0.5 ליטר של פתרון בידוד (טבלה 1) ומחלק אותו ל 2 חלקים לפני כוונון pH. המנה הראשונה (בדרך כלל 100 מ"ל) יש לחמם עד 37 מעלות צלזיוס, ורמת החומציות צריכה להיות מותאמת ל 7.2 על 37 מעלות צלזיוס (37 מעלות צלזיוס פתרון בידוד). החלק השני של פתרון הבידוד צריך להיות התקרר עד 4 צריכים להיות מותאם ° C ו-pH ל -7.2 ב 4 ° C (פתרון בידוד קר כקרח). לאחר התאמת ה-pH, אוסמולריות של שני הפתרונים חייבת להיות מותאמת ל298 mOsm ידי הוספת כמות מתאימה של גלוקוז-D או H ₂ O.
2. להעביר 2 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס פתרון בידוד לבקבוקון זכוכית ולדגור על 37 מעלות צלזיוס לשימוש בשלב 3.4. להוסיף 20 מ"ג של אלבומין בסרום שור (BSA) עד 10 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס פתרון בידוד, להתמוסס, מחדש חם עד 37 מעלות צלזיוס, ולהתקין מחדש את ה-pH ל -7.2. עד 2 מ"ל של פתרון זה להוסיף 4 מ"ג collagenase סוג שמיני (Sigma, לוט 089K8612: 633 units / פעילות collagenase מ"ג, 285 יחידות / פעילות Caseinase מ"ג, 1.6 יחידות / פעילות Clostripain מ"ג), 0.64 מ"ג elastase הסוג IV (Sigma, לוט 110M7025V 5.9 יחידות / מ"ג; להוסיף 40 μl של מניית 16 מ"ג / מ"ל ​​הוכנה בשנת 37 ° פתרון בידוד C) ו 2 μl של 1 ז DL-dithiothreitol (DTT סיגמא); מראש חם פתרון אנזים זה עד 37 מעלות צלזיוס בהכנה לצעד 3.5.
3. להעביר 2-3 מקטעים של עורק mesenteric לתוך צלחת תרבית רקמת 35-מ"מ המכיל 2 מ"ל של פתרון קרח קר ובידוד מקום הצלחת על קרח. לחתוך קטעי עורקים mesenteric לחתיכות מ"מ באורך 3-4.
4. באמצעות פיפטה פסטרה עם קצה מלוטש אש (כדי למנוע פגיעה של עורקים) להעביר את מקטעי עורקים לתוך בקבוקון זכוכית (15 x 45 מ"מ, ה-DRAM 1) המכיל 2 מ"ל מראש התחמם-37 ° C פתרון בידוד ודגירה במשך 30 דקות בשעת 37 ° C.
5. לאחר 30 דקות, לשאוב 37 ° C פתרון הבידוד באמצעות פיפטה פסטר בזהירות, להוסיף פתרון 2 מיליליטר אנזים חם ודגירה במשך 35 דקותב 37 ° C.
6. מייד לאחר דגירת 35 דקות בתמיסת האנזים, הנח את הבקבוקון על קרח, לשאוב את פתרון האנזים ולהוסיף 2 מ"ל של פתרון בידוד קר קרח (אספירציה חוזרות ותוספת של פתרון בידוד קר טרי קרח 4 פעמים). ואז, בנפח של 1 מ"ל של פתרון בידוד קרח קר, עדינות triturate מגזרים עורקים עם 10-20 פעמי פיפטה פסטר המלוטשות לשחרר תאים בודדים mesenteric עורק שריר חלק (MASMCs).
7. מעת לעת לוודא הופעת myocytes ידי הצבת ירידה של השעית התא על צלחת 35-מ"מ וצפייה מתחת למיקרוסקופ. MASMCs הבריא צריכה להיות מראה מוארך חלק. לא כל התאים בדופן העורק ישוחרר. השעית התא יש לשמור על קרח.
8. מדד שימושי נוסף של בריאות MASMC הוא הסובלנות שלהם פיסיולוגיים Ca ^{2 +} ריכוזים. מלא תא הקלטה (כלי Bioscience, # CSC-25L) עם האמבטיה שלolution המכיל 2 מ"מ CaCl ₂ (pH 7.3 בטמפרטורת חדר (RT), להרכב ראה טבלה 1) וגשר אגר עמדה (זכוכית נטויה נימים מלאות אגר 2% ב 2 M KCl, מוכנס לתוך אלקטרודה ההשוואתית (וורנר כלי, REF -3L)) בתוך החדר. באמצעות פיפטה פסטר המלוטשת, להעביר כ 100-200 השעית תא μl לחדר הקלטה ולאפשר לתאים לדבוק במשך 15 דקות. תאים שלא נפגעו לא צריכים להתכווץ באופן משמעותי בפתרון 2 המ"מ CaCl _2-המכיל (תאים צריכים להיראות מוארך או בצורת מוט, ולא מעוגלים כלפי מעלה לכדורים).
9. לאחר הוספת aliquot הראשון של השעית התא לתא ההקלטה, 0.25 מ"ל של תמיסה המכיל אמבטיה 2 מ"מ CaCl ₂ יש להוסיף נפח הנותר של השעית תא. השעית תא שנותר זה יכולה להישמר בפתרון זה על קרח ומשמשת להקלטת מהדק תיקון לתקופה של עד 6 שעות.

4.שימוש בקלאמפ תיקון התא השלם למדוד Kv7 זרמים או מתח ממברנה אשלגן

1. לאחר myocytes לדבוק בבסיס הזכוכית של חדר ההקלטה (עגול תלוש 25-מ"מ מס '1 כיסוי, וורנר מכשירים), ליזום זלוף המתמשך של פתרון האמבטיה (טבלה 1). להקלטה של Kv7 זרמים בבידוד מזרמי אשלגן rectifier מתעכבים של Kv1 וKv2 משפחות, פתרון האמבטיה יש להשלים עם 100 מיקרומטר ₃ GdCl.
2. לפברק פיפטה תיקון מורוסיליקט זכוכית (Kimax-51, קימבל צ'ייס) באמצעות פיפטה חולץ וmicroforge; ההתנגדות שלה צריכה להיות 4-5 MΩ כאשר התמלא פתרון פנימי (טבלה 1). מעייל נמוך ^_1/3 מפיפטה (~ 1-2 מ"מ מעל הקצה) עם SYLGARD 184.
3. להקלטה של ​​Kv7 זרמים בMASMCs, הטכניקה המחוררת תיקון כל תא מתח המהדק אמורה לשמש. שימוש בתצורת תיקון מחוררת מסייע במניעת depletion של הקרום phosphatidylinositol-bisphosphate 4,5 (PIP ₂₎ ולאחר מכן במהירות (תוך 5 דקות) סקירה מהירה של Kv7 זרמים, אשר נצפו בדרך כלל תוך שימוש בתצורת תיקון הקרע הקונבנציונלית. תוספת הפתרון הפנימי (טבלה 1) עם 120 מיקרוגרם / המ"ל Amphotericin B: להוסיף 3 μl של מניית 2 מ"ג / מ"ל של Amphotericin B (שהוכן בDMSO ושמר קפואים בaliquots הקטן ומוגן מפני אור) ל 0.5 מ"ל של הפתרון הפנימי. מלא את קצה פיפטה התיקון עם הפתרון הפנימי ב 'ללא Amphotericin על ידי טבילת קצה פיפטה בפתרון הפנימי ב' ללא Amphotericin ולאחר מכן החלת יניקה בצד השני באמצעות מזרק 10 מ"ל מצורף באמצעות חתיכת הצינור (-R Tygon 3603). הוסף פתרון פיפטה B המכיל Amphotericin מלמעלה בעזרת טיפ פיפטה Microloader אפנדורף עד פיפטה היא כ מלאה למחצה בפתרון. הסר את כל בועות אוויר על ידי קשה על פיפטה בעדינות. השתמש פיפטה באופן מיידי.
4. הכנס בפיפטהלמחזיק האלקטרודה ולהשתמש micromanipulator להנמיך את הפיפטה אל פני השטח של myocyte מוארך (קרוב ל, אך לא על גבי הגרעין, האיור 2). כאשר ההתנגדות בפיפטה עולה ל 6-10 MΩ, תחול יניקה להשיג גיגה חותם (> 10 GΩ).
5. הגדר מחזיק מתח עד 0 mV בזמן המתנה לניקוב קרום. החל 100 צעדי ms מתח 10 mV ואז ל-10 mV, ולהשתמש במגבר כדי לפצות ארעי קיבול פיפטה מהירה. במקביל להופעה של הארעיים תא שלמים קיבול, זרמים חיוביים מתמשכים קטנים (בדרך כלל 2-10 הרשות פלסטינית) יהיה להעיד על הנוכחות של Kv7 ערוצים פונקציונליים.
6. ניקוב מוצלח עם Amphotericin B יפחית התנגדות גישה ל 35 MΩ או פחות. הקלטה נוכחית ואז יכולה להיות יזם באמצעות פרוטוקול צעד מתח שניות 5 ממתח החזקת mV -4. אנו משתמשים במתח מחזיק mV -4 כדי להשיג קרבת האיון מקסימאלי של סוגים אחרים של rec מתעכבזרמי tifier האשלגן (מתווך בעיקר על ידי Kv1 וKv2 ערוצים), שאחרת היה לזהם את ההקלטה של ​​Kv7 הזרמים הקטנים יחסית שאינם inactivating-. (5 שניות) פרוטוקול צעד המתח הרב הוא הכרחי כדי להשיג הפעלה יציבה של Kv7 ערוצים, אשר מפגינים הפעלת מתח תלוי איטית ושחרור משרות. את Kv7 הזרמים לא להשבית במהלך שלבי המתח המתמשכים.
7. כדי להקליט Kv7 היחסים נוכחי המתח (IV), תחול 5 שלבי מתח שניות למתחים הנעים בין -84 mV, שבהסתברות הפתוחה של Kv7 ערוצים היא מזערית, ל16 mV שבהסתברות הפתוחה של Kv7 ערוצים מגיעה רמה; לאחר 5 שניות בכל מתח בדיקה, חזר למתח מחזיק (mV -4) למשך 10 שניות. זה ייקח כ 3.5 דקות לסדרה המלאה של פולסים בדיקה (איור 3 א). בצע 2-3 קלטות בקרת IV על מנת להבטיח שהזרמים שנרשמו הם יציבים לאורך זמן. עלילה ממוצעת סוף דופק זרמים (ממוצעזרמים שנרשמו ל1 השניות אחרונות) לעומת מתח כדי ליצור עקומת IV (האיור 3D). עקומות בקרת IV צריכות להיות על גבי כ אם הזרמים הם יציבים.
8. לפני החלת סוכנים תרופתיים ליזום פרוטוקול כמובן זמן נועד ברציפות להקליט הנוכחי ב -20 mV. ודא הקלטה יציבה הנוכחי לפחות 5 דקות לפני יישום התרופה. החל את הסוכנים התרופתיים ל5-15 דקות או עד למצב יציב-מושג (האיור 3C), ולאחר מכן לסיים את הפרוטוקול ולהקליט שתי עקומות IV באמצעות פרוטוקול מתח הצעד כמובן הזמן. סחף הסמים ולהקליט כמובן זמן שטיפת סמים, ואחרי ההקלטה של ​​שתי עקומות IV נוספות.
9. בסוף הניסוי יחול linopirdine מיקרומטר 10 או 10 מיקרומטר XE991, מעכבים בלתי הפיכים של Kv7 ערוצים; תרופות אלה צריכות לעכב באופן מלא את הזרמים שנרשמו במתח שלילי ל-20 mV (האיור 3D).
10. לאחר כל ניסוי לשטוף את המערכת הקאמרית וזלוף עם חומר ניקוי, אתנול ומים חמים כדי להסיר כל עקבות של התרופות המשמשות.

5. שימוש בעורק מגזרים שלמים לMyography לחץ

1. מערכת myograph לחץ נרכשה ממיו טכנולוגיה דנית (DMT / S, דנמרק, דגם 110P) משמשת לניסוי myography לחץ. הר קטע העורק בתא הנירוסטה על ידי החדרת צינורית הזכוכית השמאלית הקבועה אופקי לתוך קצה אחד וצינורית זכוכית זכות מטלטלין לקצה השני. שני מתמרי לחץ (P1 על ימין ועל P2 בצד השמאל) בנויים בניטור הלחץ בתוך החלל העורק. נוזל מצינורית זכוכית הזכות ישמש כדי להתאים את הלחץ בתוך העורקים לרמה הפיזיולוגית המשוערת שלו. כדי להתחיל, מילוי מראש של מזרק 10 מ"ל פתוח (המשמש כעמודת לחץ הזנת כוח משיכה), עם פתרון לומן (טבלה 1). הרם את המזרק כדי לדחוף solution דרך צינורות פוליאתילן לתוך צינורית הזכוכית הנכונה, טיפול כדי למנוע בועות אוויר בצינורות או קנולה. הצינורית השמאלית צריכה להיות מראש מלאה פתרון לום באמצעות מזרק 1 מ"ל. למלא את תא לחץ myograph עם 10 מ"ל של פתרון אמבטית הכלי (טבלה 1). רופף להשעות 2 תפרי ניילון עדינים מראש שנעשה בכל צד סמוך לcannulae הזכוכית.
2. בזהירות להעביר את קטע עורק mesenteric הגזור (קטע ³ באו ⁴ בצו, בדרך כלל סביב 200 - 350 מיקרומטר בקוטר; מצעד 2.6) מהתא לתא לנתח myograph לחץ, נאחז בקצה אחד של המגזר באמצעות מייקרו מלקחיים.
3. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מואר, החזק קצה אחד של קטע העורק והחלק בעדינות אותו מעל צינורית הזכוכית השמאלית ולהבטיח את סוף השימוש בתפרי הניילון. לשטוף בעדינות את נוזל הלום באמצעות כלי רכוב להסיר דם ופסולת בתוך הכלי.השסתום למזרק שמאלה ואז צריך להיות סגור, כך שהצד הזה מציג עמודה סטטית של נוזל נגד שהלחץ מותאם מהצד הימני.
4. שימוש micromanipulator, עמדת זכוכית צינורית זכות מטלטלין קרובים יותר למגזר העורק ומושך את הקצה הימני של הקטע על זה, סוף הסוף לקבע אותו בעזרת תפרי הניילון. קליפ מחוטי התפרים העודפים.
5. הר יחידת myograph לחץ על הבמה מעל מיקרוסקופ myograph לחץ. הנח את הכיסוי על תא myograph לחץ. הכיסוי לתא מכיל את מפרצון superfusion וצינור היניקה המצורפת אליו. חבר את כניסת superfusion לסעפת לאפשר superfusion של פתרון KCl mM 60 לתוך תא myograph לחץ על ידי כוח הכביד אמבטית טמפרטורת חדר או. חומרי בדיקה, כגון תרופות או הורמונים שנמצאו במדידות המהדקות לתיקון להשפיע על תפקוד הערוץ Kv7, מיושמים בדרך כלל ישירות לפתרון האמבטיה, לא דרך אמבטית superfusion או בפתרון הלום. Superfusion של פתרון אמבטיה ישמש כדי לשטוף את פתרון KCl. צרף צינור היניקה למערכת ואקום כדי להסיר superfusate העודף. הכנס את חיישן הטמפרטורה לפתרון האמבטיה דרך הפתח האמור בכיסוי תא myograph.
6. חבר את יחידת לחץ myograph למערכת מיו הממשק, החומרה המאפשרת תקשורת של יחידת myograph לתוכנת myoview (DMT).
7. פתח את תוכנת myoview במחשב. בחלון הפרמטר, לקבוע את טמפרטורת היעד כמו 35 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של סובלנות 1 ° C, לחץ זרימת היעד כמו 80 מ"מ כספי ולחץ יצוא היעד כמו 80 מ"מ כספי. טען את קובץ הכיול ולכייל את הקוטר החיצוני הכלי כך שהשינויים בקוטר עורק נרשמים במדויק במיקרון. כוון את הניגודיות כנדרשת כדי לאפשר תצפית טובה על הקטע רכוב על הרקע. תיאור מפורט לאופן שימוש בתוכנהמסופק במדריך למשתמש מDMT.
8. בהדרגה להעלות את מזרק 10 מ"ל (המשמש כעמודת לחץ הזנה הכבידה) על פני תקופה של 15 דקות עד למתמר לחץ P1 קורא 80 מ"מ כספי. תוך העלאת עמודת לחץ, לבדוק את כל הדלפות בכלי השיט. אם יש הדלפות כלשהן, השלך את הקטע ולעלות קטע עורק אחר (חזור על שלבים מ5.2). התאם את המרחק בין cannulae בעת צורך. המרחק צריך להיות מותאם באופן כזה שקטע עורק הלחץ הוא כ ישר (אבל לא מתוח) ויוצר כתף כמו בדפוס שבו הקשרים מורכבים (איור 4 א).
9. הפעל את החימום של חדר myograph לחץ באמצעות הפקדים במערכת מיו הממשק. אפשר פתרון האמבטיה כדי לחמם בהדרגה עד שהוא מגיע 36-37 מעלות צלזיוס
10. השתמש בהתאמות XYZ של אובייקטיבי במיקרוסקופ DMT בעת צורך כדי לשמור על הכלי בפוקוס ולהקל על מעקב מדויק של הפרקAnges בקוטר כלי חיצוני.
11. בדוק את הכדאיות של הכלי רכוב על ידי superfusion החולף (~ 30 שניות) עם KCl 60 מ"מ. כלי קיימא מכווץ מהירות בתוספת של KCl ומרחיב מייד עם סחף של 60 המ"מ KCl (superfuse כ 60 מ"ל של פתרון אמבטיה לשטוף את KCl). לאחר בדיקה זו, להתאים מחדש את עוצמת הקול של הפתרון לאמבטיה בדיוק 10 מ"ל. הטמפרטורה של האמבטיה מצטמצמת במהלך הבדיקה ושטיפת KCl כי פתרונות אלה הם בטמפרטורת חדר, אבל הדוד הקאמרי יחזיר את הטמפרטורה ל 36-37 מעלות תוך מספר דקות.
12. אפשר העורק כדי לאזן לפחות 30 דקות (הקוטר צריך להיות יציב במשך לפחות 10 הדקות האחרונות של תקופה זו). הוסף חומר הבדיקה המרוכז לפתרון האמבטיה ישירות ופיפטה קדימה ואחורה בעדינות ליד הקצוות של החדר לערבב את חומר הבדיקה בפתרון האמבטיה, מניב הריכוז הסופי המתאים בנפח 10 המ"ל הקאמרי. צ'אןGES בתוספת הבאה קוטר הכלי של בדיקת חומר (הים) יכול להיות במעקב בתמונת הווידאו החייה וגם מופה בחלון ניתוח התמונה בזמן הניסוי הוא בביצוע.
13. לאחר השלים הניסוי, נתונים המאוחסן קובץ (*. מיו) ניתן לפתוח כקובץ גיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.

6. נציג תוצאות

התוצאות מוצגות באיור 3 ממחישות הקלטות טיפוסיות של Kv7 זרמים מmyocytes העורקים mesenteric באמצעות פרוטוקול צעד מתח לפני (איור 3 א, עקבות B השחורים) ותקופת הטיפול בKv7 ערוץ activator Zn pyrithione (ZnPyr, 100 ננומטר; 3A איור, B עקבות אדומות). נתוני צעד דומה ממתח 3 תאים היו ממוצעים להכין את החלקות נוכחי המתח (IV) המוצגות באיור 3D. כמובן נציג זמן של שיפור של משרעת הנוכחית (שנמדד על ידי מהדק מתח מתמשך ב -20 mV) דוריןהטיפול גרם עם nM Zn pyrithione 100 מוצג באיור 3C האיור 4B ממחיש כמובן הזמן של השפעת ZnPyr בקוטר חיצוני עורק mesenteric נמדד באמצעות myography לחץ;. הספינה הייתה מראש מוגבלת עם 100 PM ארגינין וזופרסין (AVP) לפני תוספת של ZnPyr nM 100. נתוני מנת תגובת ממוצע להתרחבות העורק mesenteric ZnPyr מושרה מוצגים באיור 4C.

איור 1. תמונה של ארקייד mesenteric בחדר הניתוח של גוויות.

איור 2. תמונה של myocyte עם פיפטה תיקון על פני השטח שלו.

איור 3. עקבות מקוריות של Kv7 זרמים, קורס זמן של תרופות יישום, עקומות IV. משפחת א 'של עקבות נוכחיות עוקבות (פנל תחתון) שנרשמו בתגובה לצעדי מתח (פנל עליון) לפני הטיפול (שליטה, שחור) והייצוב הבא בנוכחות של 100 ננומטר ZnPyr (אדום) בMASMC אחת. עקבות נוכחיות נציג B. מ( כפי שמצוין על ידי ראשי חץ) לבקרה (שחור) ועבור 100 ננומטר ZnPyr (אדום). פסים אפורים מצביעים על מרווח זמן שבו אמפליטודות נוכחית ממוצע נמדדה לחלקות נוכחיות מתח (IV). מתחי צעד מצוינים בצד ימין על ידי ראשי חץ. כמובן זמן ג השיפור הנוכחי Kv7 ידי ZnPyr nM 100 נמדדו עם מהדק מתח מתמשך ב -20 mV (בר). ד הממוצעים העקומות הרביעיות (n = 3) נגזרות מKv7 צפיפות נוכחית נרשמו לפני (שליטה, עיגולים מלאים), במהלך טיפול עם nM ZnPyr 100 (עיגולים פתוחים), ובמהלך הטיפול עם 10 מיקרומטר XE991 (משולשים מלאים). זרמי דליפה לא ספציפיים נגרעו כפי שתואר על ידי פסמור et al. ^1.

אף אוזן גרון ">
איור 4. הרפית ZnPyr המושרית של עורק מראש מכווץ-100 עם AVP PM mesenteric. תמונת א 'של עורק mesenteric רכובה בmyograph לחץ הגדרה. כמובן ב 'זמן של שינויים בקוטר חיצוני של כלי השיט בתגובה לבקשה של 100 PM AVP (בר פתוח) ואחרי היישום של 100 ננומטר ZnPyr (בר מלא). גרף בר ג סיכום תוצאות vasodilaion 100 ננומטר ZnPyr המושרה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השיטות והגישות ניסיוניות שתוארו כאן הן די חזקות ויכולות להניב תוצאות ברורות ולשעתק כאשר מיושמות עם תשומת לב קפדנית לכל פרט. הקלטות אלקטרו טובות והצרה / רחבה של מגזרים עורקים תלויות בבריאותם של התאים ומגזרים עורקים, בהתאמה. הכנות סלולריות יכולות להשתנות מיום ליום, גם ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
כלוריד הנתרן	סיגמא	S5886	פתרון ביתור: 145 פתרון אמבטיה לאלקטרופיזיולוגיה *: 140 פתרון פנימי לelectrophysiology: 10 פתרון בידוד לmyocytes *: 140 פתרון לאמבטיה myography לחץ: 145 פתרון ללום myography לחץ: 145
אשלגן כלורי	סיגמא	P5405	פתרון ביתור: 4.7 פתרון אמבטיה לאלקטרופיזיולוגיה *: 5.36 פתרון פנימי לelectrophysiology: 135 פתרון בידוד לmyocytes *: 5.36 פתרון לאמבטיה myography לחץ: 4.7 פתרון ללום myography לחץ: 4.7
EGTA אשלגן	סיגמא	E4378	פתרון פנימי לelectrophysiology: 0.05
HEPES	סיגמא	H9136	פתרון אמבטיה לאלקטרופיזיולוגיה *: 10 פתרון פנימי לelectrophysiology: 10 פתרון בידוד לmyocytes *: 10
פוספט המימן disodium	סיגמא	S5136	פתרון בידוד לmyocytes *: 0.34
פוספט מימן אשלגן	סיגמא	P5655	פתרון בידוד לmyocytes *: 0.44
מגנזיום כלוריד	סיגמא	M2393	פתרון אמבטיה לאלקטרופיזיולוגיה *: 1.2 פתרון פנימי לelectrophysiology: 1 פתרון בידוד לmyocytes *: 1.2
כלוריד סידן	סיגמא	פתרון אמבטיה לאלקטרופיזיולוגיה *: 2 פתרון בידוד לmyocytes *: 0.05
פוספט נתרן	הפישר סיינטיפיק	BP331-1	פתרון ביתור: 1.2 פתרון לאמבטיה myography לחץ: 1.2 פתרון ללום myography לחץ: 1.2
מגנזיום סולפט	סיגמא	M2643	פתרון ביתור: 1.17 פתרון לאמבטיה myography לחץ: 1.17 פתרון ללום myography לחץ: 1.17
מגבים	הפישר סיינטיפיק	BP308	פתרון ביתור: 3 פתרון לאמבטיה myography לחץ: 3 פתרון ללום myography לחץ: 3
חומצת Pyruvic	סיגמא	P4562	פתרון ביתור: 2 פתרון לאמבטיהmyography לחץ: 2 פתרון ללום myography לחץ: 2
dihydrate EDTA	Organics מחקר	9572E	פתרון ביתור: 0.02 פתרון לאמבטיה myography לחץ: 0.02 פתרון ללום myography לחץ: 0.02
D-גלוקוז	סיגמא	G7021	פתרון ביתור: 5 פתרון אמבטיה לאלקטרופיזיולוגיה *: 10 פתרון פנימי לelectrophysiology: 20 פתרון בידוד לmyocytes *: 10 פתרון לאמבטיה myography לחץ: 5 פתרון ללום myography לחץ: 5
שור אלבומין	סיגמא	A3912	פתרון ביתור: 1% פתרון ללום myography לחץ: 1%
pH			ביתור solution: 7.4 פתרון אמבטיה לאלקטרופיזיולוגיה *: 7.3 פתרון פנימי לelectrophysiology: 7.2 פתרון בידוד לmyocytes *: 7.2 פתרון לאמבטיה myography לחץ: 7.4 פתרון ללום myography לחץ: 7.4
אוסמולריות			פתרון ביתור: 300 פתרון אמבטיה לאלקטרופיזיולוגיה *: 298 פתרון פנימי לelectrophysiology: 298 פתרון בידוד לmyocytes *: 298 פתרון לאמבטיה myography לחץ: 300 פתרון ללום myography לחץ: 300
			* 11
			טבלת 1. רכיבים של פתרונות המשמשים בניסוי.