رصد النسخ المتماثل البلازميد في خلايا الثدييات يعيش أكثر من أجيال متعددة من مضان المجهري

Summary

يوصف أسلوب للمراقبة الفردية جزيئات الحمض النووي في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع أمريكا اللاتينية والكاريبي لتصميم مواقع الربط DNA في المصالح. ويمكن تكييف هذه الطريقة لمتابعة السلطات الوطنية المعينة المؤتلف كثيرة في الخلايا الحية على مر الزمن.

Abstract

يتم الاحتفاظ بعض البلازميدات طبيعيا في خلايا الثدييات. ومن بين هذه العوامل الوراثية من الهربس غاما، بما في ذلك فيروس ابشتاين بار (EBV) وكابوزي الورم اللحمي المرتبطة هربس (KSHV)، والتي تتسبب الأورام الخبيثة الإنسان متعددة ^1-3. يتم نسخ هذه الجينوم الاثنين بطريقة المرخصة، كل باستخدام بروتين واحد الفيروسية والخلوية آلات النسخ المتماثل، وتم تمريرها إلى الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية على الرغم من القسيم التقليدية التي تفتقر إلى ^4-8.

وقد تم ذلك الكثير من العمل لتوصيف مكررات هذه الجينوم البلازميد باستخدام أساليب مثل النشاف الجنوبية ومضان التهجين في الموقع (FISH). وتقتصر هذه الأساليب، وإن كان. PCR الكمي والبقع جنوب تقديم معلومات عن متوسط ​​عدد البلازميدات في الخلية في عدد السكان من الخلايا. FISH هو فحص وحيدة الخلية التي تكشف كل من متوسط ​​عدد وتوزيع بلازميد ق في خلية في عدد السكان من الخلايا ولكنها ثابتة، مما يتيح أي معلومات عن الوالد أو سلالة الخلية فحصها.

هنا، نحن تصف طريقة لتصور البلازميدات في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع اللاكتوز إلى مواقع متعددة في البلازميد من الفائدة ^9. تم تصميم الحمض النووي التي تهم تشمل يكرر جنبا إلى جنب نحو 250 من المشغل اللاكتوز (LACO) التسلسل. لا بد من البروتين على وجه التحديد LACO وقامع اللاكتوز (اسي)، والتي يمكن أن تنصهر فيها بروتين فلوري. يمكن إما الانصهار البروتين يمكن التعبير عنها من البلازميد هندسيا أو عرضه ناقل فيروسات. وبهذه الطريقة، يتم تمييزها جزيئات DNA fluorescently وبالتالي تصبح مرئية عبر المجهر مضان. يتم حظر البروتين الانصهار من ربط DNA البلازميد من قبل خلايا زراعة في وجود البلازميدات IPTG حتى على استعداد ليتم عرضه. ontent "> ويتيح هذا النظام ليتم رصدها على البلازميدات في الخلايا الحية من خلال عدة أجيال، وكشف عن خصائص التركيب والتقسيم إلى الخلايا الوليدة. خلايا مثالية هي ملتصقة، تقاس بسهولة، ولها نواة كبيرة. وقد استخدم هذه التقنية لتحديد ما وقد تم تجميع 84٪ من EBV المستمدة من البلازميدات كل جيل و 88٪ من قسم البلازميدات تصنيعه حديثا بإخلاص إلى الخلايا الوليدة في خلايا هيلا. شوهدت أزواج من هذه البلازميدات EBV أن المربوطة أو المرتبطة الكروماتيدات الشقيقة بعد التوليف في S- المرحلة كان ينظر إليها حتى لفصل الكروماتيدات الشقيقة كما فصل في طور الصعود ⁽¹⁰⁾ وحاليا تستخدم هذه الطريقة لدراسة الجينوم تكرار KSHV في خلايا هيلا وخلايا SLK. خلايا هيلا وخلد الخلايا الظهارية البشرية، وخلد الخلايا البطانية SLK الإنسان الخلايا. لو كانت مستمدة في الأصل من الخلايا SLK آفة KSHV، لا هيلا ولا SLK خط خلية حرب بشكل طبيعيORS الجينوم KSHV ^11. بالإضافة إلى دراسة تكاثر الفيروس، ويمكن استخدام هذه التقنية التصور للتحقيق في الآثار المترتبة على إضافة وإزالة، أو تحور مختلف عناصر تسلسل الحمض النووي على التوليف، التعريب، وتقسيم للسلطات الوطنية المعينة الأخرى البلازميد المؤتلف.

Protocol

1. هندسة الخلايا مع البلازميدات المرئية

1. استخدام معيار الهضم تقييد أو إعادة التركيب مثلي التقنيات لتقديم جزء DNA التي تحتوي على ما يقرب من 250 نسخة من تسلسل المشغل اللاكتوز (LACO) في البلازميد أن تصور. كان لدينا البلازميد BACmid من حوالي 170 KBP والواردة الجينوم بأكمله من الفيروسات الهربس كابوزي الورم اللحمي المرتبطة (KSHV) والمقاومة مرمزة لهيغروميسين ^12.
2. إدخال LACO DNA التي تحتوي على البلازميد إلى خلايا الثدييات من ترنسفكأيشن مع Lipofectamine 2000. تقاس نحن هيلا وSLK الخلايا في 60 ملم الأطباق لمدة 4 ساعة مع 10 ميكروغرام تنقية DNA البلازميد مع 25 ميكرولتر Lipofectamine 2000، 0،5 مل OptiMEM، و 3.5 مل DMEM.
3. تغيير ثقافة المتوسط ​​لDMEM 5 مل مع خلايا الجنين البقري 10٪ مصل واحتضان لمدة 48 ساعة.
4. لوحة الخلايا في كثافة منخفضة في أطباق كبيرة وخلايا الثقافة في المتوسط ​​تحتوي على المضادات الحيوية لاختيار جيش التحرير الشعبى الصينى قدمsmid، ونحن تحديد خلايا في DMEM مع مصل بقري جنيني 10٪ مع 300 ميكروغرام / مل هيغروميسين لمدة 3 أسابيع.
5. استخدام قطعة من الورق عقيمة غارقة في التربسين، فلتر لنقل هيغروميسين مقاومة المستعمرات إلى الأطباق ثقافة جديدة.
6. عندما استنساخ بالنقل نمت لملء الطبق، عزل الحمض النووي لتقييد الهضم وجنوب النشاف للتأكد من أن من البوليمر LACO البلازميد هو متجانسة والحجم المتوقع.
7. إذا لم البلازميد تم تصميمها للتعبير عن مزيج من اسي، تصيب الحيوانات المستنسخة مناسبة مع ترميز الارتجاعي قامع اللاكتوز (اسي) لتنصهر البروتين الفلوري الحمراء، مثل اسي-tdTomato. نستخدم tdTomato بدلا من البروتينات التي يتألق أقرب إلى اللون الأخضر للحد من photoxicity التي يمكن أن تحدث من التعرض لأخطار متعددة على مدى فترات طويلة ^13.
8. لكن متى ما والبروتين الانصهار اسي والثقافة الخلايا في وجود 200 ميكروغرام / مل الآيزوبروبيل-BD-thiogalactoside (IPTG) لمنع البروتينات الانصهار ملزمة منDNA.
9. ثقافة الخلايا لا يقل عن 3 أيام للسماح التعبير من البروتين اسي-tdTomato.
10. استنساخ الشاشة (عن طريق غسل بعيدا IPTG وعرض الخلايا كما هو موضح أدناه) لذوي المستويات المثلى من اسي-tdTomato التي تكشف عن إشارات متميزة مع المستويات الأساسية الدنيا من البروتين الانصهار غير منضم.

2. تطوير نظام التصوير

نظامنا التصوير يتكون من 200M Axiovert زايس مجهزة بمحرك مرحلة وخطة الهدف، Aochromat النفط 63x/1.4. وتقدم مضان ضوء الإثارة من قبل "بيضاء محايدة" LED نظام COLIBRI. تم الكشف عن الانبعاثات من قبل CascadeII: 1024 EMCCD الكاميرا. هذا هو تبريد، وكاميرا خلفية ضعيفة مع تسجيل مكاسب للإشارات تضخيم، والظلام هو 0،061 الحالي الإلكترونات لكل بكسل في الثانية الواحدة، وكفاءة الكم أكبر من 0.90. يتم التحكم في النظام عن طريق برنامج 4،8 Axiovision، بما في ذلك وحدة SmartExperiments. للكشف عن tdTomaلأننا سوف تستخدم مجموعة مرشح 75HE زايس التي 85٪ من الضوء يمكن أن تثير مرت فلور و 95٪ من الضوء المنبعث تمرير تصفية الانبعاثات.

1. تجميع نظام التصوير مع مجهر مقلوب وكاميرا EMCCD للكشف عن الإشارات الحساسة، مصدر ضوء LED لإثارة محددة واغلاق سريع، مرحلة الآلية والذراع التركيز، والتحكم الآلي البرمجيات لعمليات استحواذ من الصور على فترات طويلة مع متعددة Z-المداخن. ينبغي للنظام الجلوس على طاولة الهواء ليتم عزل من الاهتزاز.
2. تجميع الحاضنة مرحلة أعلى للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5-10٪ ₂ CO في غرفة مرطب. إتاحة الوقت الكافي للنظام من أجل التوصل إلى درجة حرارة مستقرة للتقليل من حركة القطع الأثرية أثناء التجربة.
3. استخدام طوق ساخنة لهدف لمنع الهدف من شفط الحرارة من العينة.

3. تصور DNA إعتبر

1. لوحة الخلايا في 35 ملمالزجاج أسفل الطبق في كثافة التقاء أقل من 10٪، الأمر الذي سيتيح أزواج من الخلايا إلى تقسيمها إلى مستعمرات الخلايا دون تداخل 8-16. القيام بذلك ساعة على الأقل قبل التصوير 24-48 بحيث خلايا قابلة للحياة لديهم الوقت للقسمة.
2. ساعة واحدة إلى ثلاث قبل بدء التصوير، وشطف لوحة 3 مرات مع ثقافة المتوسط ​​الذي يفتقر الى كل من المخدرات وانتقائية IPTG. هذا الإجراء يغسل بعيدا خلايا غير قابلة للحياة ويسمح اسي البروتينات الانصهار لربط مواقع LACO في البلازميدات.
3. استبدال ثقافة المتوسط ​​مع DMEM مل 2 مع مصل بقري جنيني 10٪ وHEPES 25 مم.
4. امتدت استبدال الجزء العلوي من طبق الثقافة مع CultFoil في حلقة متصاعدة لطبق 35 مم. وهذا الغطاء تمنع تبخر ثقافة المتوسط، الذي من شأنه أن يزيد تركيز الملح مع مرور الوقت وقتل الخلايا.
5. استخدام الفرق تدخل النقيض (DIC) التصوير لعرض الخلايا وتحديد المستوى البؤري من أعلى وأسفل من الخلايا في حقول متعددة للعرض.في كل حقل، الانتقال إلى المستوى البؤري حوالي 1/3 من الطريق نزولا من أعلى الخلية. حفظ X، Y، Z تنسق في قائمة مواقع المرحلة المحفوظة.
   ملاحظة: إشارات البلازميد قد لا تكون مرئية من خلال العدسات عندما تضاء المصابيح من الخلايا عن طريق الطول الموجي المناسب للانصهار بروتين اسي. قد تكون إشارات ضعيفة فقط مرئية باستخدام الكاميرا EMCCD، والذي يسمح للإشارة التكامل مع مرور الوقت، وبالتالي يزيد من فعالية الإشارات الضعيفة.
6. في برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر، تعريف Z-كومة من الصور التي يتعين القيام بها في كل مرحلة موقف المحفوظة. اختيار من الألف إلى الياء حجم 0،35-0،50 خطوة من ميكرون، والتي سوف تسمح لك لأخذ العينات نايكست التقريبي في البعد Z ^14. وتشمل "إضافية" شرائح فوق وتحت الطائرات التي تقع في والخلايا، وهذه الشرائح تسمح كشف الخلية بعد الحركات خلال دورة الخلية، وتستخدم أيضا في مرحلة ما بعد اكتساب تجهيز (deconvolution) من مداخن الصورة. وسيساعد هذا التضمينيؤدي إلى كومة من 40-60 الصور، اعتمادا على سمك الخلايا.
7. في برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر، وتحديد تجربة سلسلة زمنية لجمع صورة مشرقة للمجال Z-المداخن على فترات دقيقة 30 (لتتبع الانقسامات الخلوية والهجرات على أوقات طويلة) والصور مضان على فترات دقيقة 10-60 (لتصور البلازميدات داخل الخلايا). لا تستخدم التصوير DIC أثناء التجربة، لأنه يتطلب مزيدا من الضوء من مستوى التصوير مجال الساطع، الذي يمكن أن يعرض الخلايا دون داع لالضيائية على مدار التجارب الطويلة.
8. بدء تجربة البرمجيات التي تسيطر عليها. ضمان ألا تؤثر على النظام (صدم، ويتعرضون لضوء الغرفة الزائدة، الخ) أثناء التجربة.
9. إذا لزم الأمر، تجديد المياه في نظام الترطيب أثناء التجربة.

4. بعد الحيازة معالجة الصور

1. استعراض الصور لكل نقطة Z-مكدس والوقت. اقتصاص من أي من المناطق غير الضرورية منالصور للحد من زمن الكمبيوتر في الخطوة التالية.
2. استخدام خوارزمية deconvolution لإعادة تعيين كثافة إشارة إلى بكسل المنشأ في كل ¹⁵ Z-المكدس. في حين يمكن أن تستند هذه deconvolution على وظيفة نقطة انتشار النظري لنظام التصوير الخاص بك، فمن الأفضل لقياس وظيفة انتشار نقطة نظام التشغيل الخاصة بك عن طريق التصوير الفلورسنت المجهرية، واستخدام هذا القياس في الخوارزمية deconvolution. قمنا بقياس وظيفة انتشار نقطة نظام التصوير لدينا وتطبيق. متكررة مقيدة أقصى خوارزمية احتمال في برنامج AxioVision (AxioVision وصف البرامج وزايس)
3. دراسة الصور لتعقب التغييرات والحركات كثافة من البلازميدات خلال دورة الخلية وتقسيم البلازميدات إلى الخلايا الوليدة.

النتائج

وتظهر التوقعات الحد الأقصى لكثافة Z-مداخن المكتسبة في تجربة تمثيلية في الشكل 3. إشارات البلازميد نموذجية موجودة في 3-8 شرائح من Z-المكدس، اعتمادا على ما إذا كانت تمثل واحدة أو مجموعة من البلازميدات. في حالة EBV والبلازميدات KSHV المشتقة، وإشارات تتحرك ببطء داخ?...

Discussion

ويمكن استخدام الطريقة الموضحة هنا لمتابعة البلازميدات في خلايا الثدييات الحية على مر الزمن والتي تمتد أجيال متعددة. عن طريق الحد من التعرض للضوء الإثارة، وقد استخدمنا هذه التقنيات لمتابعة الخلايا من أزواج حديثا من خلال تقسيم المستعمرات من 16-32 الخلايا، التي تمثل ما ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
DMEM	GIBCO	11965
OptiMEM	GIBCO	31985
المصل البقري الجنين	Hyclone	SH30910.03
بنسلين	سيجما	P3032
الستربتوميسين كبريتات	سيجما	S9137
هيغروميسين	Calbiochem	400050	400 ميكروغرام / مل لSLK؛ 300 ميكروغرام / مل لهيلا
الآيزوبروبيل-BD-thiogalactoside (IPTG)	روش	10 724 815 001	تركيز النهائي 200 ميكروغرام / مل
Lipofectamine 2000	إينفيتروجن	11668-027
HEPES	GIBCO	15630
الزجاج القاع الأطباق	ماتيك	P35G-1.5-10-C
CultFoil	Pecon	000000-1116-08
Axiovert 200M	زايس
COLIBRI	زايس	423052-9500-000
محايد أبيض LED	زايس	423052-9120-000
تصفية 75 م مكعب	زايس	489075-0000-000
خطة لامزيغ-63x/1.4 الهدف	زايس	440762-9904-000
CascadeII: 1024 EMCCD الكاميرا	Photometrics	B10C892007
Tempcontrol صغيرة	زايس / Pecon	000000-1116-070
Tempcontrol 37-2 الرقمية	زايس / Pecon	000000-1052-320
المراقب CTI 3700 الرقمية	زايس / Pecon	411856-9903
الهدف سخان	زايس / Pecon	440760-0000-000
مرحلة التسخين إدراج P	زايس / Pecon	411861-9901-000
مرحلة أعلى حاضنة S	زايس / Pecon	411860-9902-000
المرطب النظام	زايس / Pecon	000000-1116-065