형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

요약

라이브 셀에서 개별 DNA 분자를 관찰하는 방법이 설명되어 있습니다. 기술은 관심의 DNA에 설계 구속력이 사이트에 휘황 태그 LAC 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 이 방법은 시간이 지남에 라이브 세포에서 많은 재조합 DNAs를 수행하도록 구성 할 수 있습니다.

초록

몇 자연스럽게 - 발생 plasmids은 포유류의 세포에 보관됩니다. 이 중 여러 사람이 malignancies ^1-3의 원인 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus (KSHV)를 포함 감마 herpesviruses의 genomes이 있습니다. 이 두 genomes들은 부족 전통 centromeres ^4-8에도 불구하고 라이센스 방식으로, 하나의 바이러스 단백질과 세포의 복제 기계를 사용하여 각 복제하고 있으며, 세포 분열 동안 딸 세포에 전달됩니다.

많은 작품은 그러한 남부 blotting 및 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광과 같은 방법을 사용하여 이러한 플라스미드 genomes의 복제를 특징 완료되었습니다. 이러한 방법은하지만 제한됩니다. 양적 PCR 및 남부 blots은 세포의 인구 세포 당 plasmids의 평균 개수에 대한 정보를 제공합니다. 물고기는 평균 수와 플라스미드의 배포를 모두 보여 단일 셀 분석입니다 하지만 세포 인구의 당 세포 검사 셀의 부모 나 자손에 대한 정보를 허용하지 정적입니다.

여기, 우리는 라이브 셀의 plasmids를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 관심을 ⁹ 플라스미드의 여러 사이트에 휘황 태그 유당 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 관심 DNA는 유당 연산자 (LacO) 시퀀스의 약 250 탠덤 반복을 포함 할 수 있도록 설계되어 있습니다. LacO은 특히 형광 단백질에 융합 할 수있는 유당 억제 단백질 (LacI)에 의해 구속된다. 융합 단백질은 하나 엔지니어링 플라스미드 또는 retroviral 벡터에 의해 도입에서 표현 할 수 있습니다. 이러한 방법으로, DNA 분자는 휘황 태그하므로 형광 현미경을 통해 볼 수가 있습니다. plasmids이 볼 수 할 준비가 될 때까지 융합 단백질은 IPTG의 존재의 배양 세포에 의해 플라스미드 DNA를 바인딩에서 차단됩니다. ontent는 ">이 시스템은 plasmids은 여러 세대에 걸쳐 세포를 생활의 합성의 속성을 드러내고과 딸 세포에 파티션에서 모니터 할 수 있습니다. 이상적인 세포가 자기편 있으며, 쉽게 transfected, 대형 핵을 갖추고 있습니다.이 기술은 결정하는 데 사용 된 것으로 EBV-파생 plasmids의 84 %가 각 세대를 합성하고 새로 합성 plasmids 파티션의 88 %가 충실하게 헬러 셀의 딸 세포에.이 EBV의 plasmids의 페어가에서 자신의 합성 이후에 묶여 또는 자매 chromatids와 관련된 것으로 볼 수 있었다 S- 그들이 Anaphase ¹⁰ 구분 자매 chromatids로 분리 볼 때까지 단계가. 방법은 현재 헬러 셀 및 SLK 세포에서 KSHV의 genomes의 복제를 연구하는 데 사용하고 있습니다. 헬러 세포는 인간의 상피 세포를 불후의하고 있으며, SLK 셀이 남을 아르 내피 인간 세포. SLK 세포가 원래 KSHV의 병변에서 파생 된 있지만, 헬러이나 SLK 셀 라인도 자연스럽게 harbors KSHV의 genomes ^11. 바이러스 복제를 공부하는 것 외에도,이 시각화 기술은 또한, 제거, 또는 합성, 현지화 및 기타 재조합 플라스미드 DNAs의 파티션에 대한 다양한 DNA 시퀀스 요소의 돌연변이의 효과를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 공개 Plasmids있는 세포 공학

1. 시각화 할 플라스미드에 유당 운영자 순서 (LacO)의 약 250 사본을 포함하는 DNA 조각을 소개 표준 제한 소화 또는 동종 재조합 기술을 사용합니다. 우리 플라스미드는 약 170 kbp의 BACmid이고 Kaposi 육종 - 관련 헤르페스 바이러스의 전체 게놈 (KSHV)와 hygromycin ¹² 인코딩 저항이 포함되어 있습니다.
2. 소개 LacO을 포함 Lipofectamine 2000 transfection하여 포유류의 세포에 플라스미드 DNA합니다. 우리는 25 μl Lipofectamine 2000, 0.5 ML OptiMEM, 및 3.5 ML DMEM으로 플라스미드 DNA를 정제 10 μg을 4 시간에 60mm 요리 헬러와 SLK 세포를 transfected.
3. 48 시간 10 % 태아 소 혈청 및 배양 세포 5 개 ML DMEM으로 문화 매체를 변경합니다.
4. 소개 찮아에 대한 항생제 선택을 포함하는 중간에 대형 요리와 문화 세포에서 낮은 밀도의 플레이트 세포smid, 우리는 300 μg / 3 주 ML의 hygromycin과 10% 태아 소 혈청과 DMEM에서 셀을 선택했습니다.
5. 새로운 문화 요리에 hygromycin 방지 식민지를 전송하는 살균, 트립신 - 젖은 거름 종이 조각을 사용합니다.
6. transfected 클론은 접시를 채우기 위해 성장했을 때, 제한 소화를 위해 DNA를 분리하고 남부는 플라스미드 LacO의 폴리머는 동질이며, 예상 크기 있도록 blotting.
7. 플라스미드는 LacI의 융합을 표현하기 위해 설계되지 않은 경우, 해당 LacI-tdTomato 같은 붉은 색 형광 단백질에 융합 유당 억제 (LacI)를 인코딩 레트로 바이러스와 적절한 클론을 감염. 우리는 tdTomato보다 긴 시간 ¹⁴ 여러 노출에서 발생하는 것 photoxicity을 최소화 할 녹색에 가까운 형광 단백질을 사용합니다.
8. 일단 LacI 융합 단백질은 문화 바인딩에서 융합 단백질을 차단하는 200 μg / ML 이소 프로필-BD-thiogalactoside (IPTG)의 존재에서, 세포 소개합니다DNA.
9. 문화 적어도 3 일 동안의 전지 LacI-tdTomato 단백질의 표현을 허용합니다.
10. 언 바운드 융합 단백질의 최소한의 배경 수준 별개의 신호를 보여 LacI - tdTomato의 최적 수준있는 사람을위한 화면 클론 (IPTG을 멀리 세척하고 아래에 설명 된대로 세포를 확인하여).

2. 이미징 시스템의 개발

우리의 이미징 시스템은 동력 무대와 계획 - Aochromat 63x/1.4 오일 목적 갖춘 Zeiss Axiovert의 200M으로 구성되어 있습니다. 형광 여기 광은 Colibri 시스템의 LED "중립적 인 화이트"에 의해 제공됩니다. 방출은 CascadeII에 의해 감지 : 1024 EMCCD 카메라를. 이 증폭기 신호의 게인 레지스터와 냉각, 백 얇게 카메라, 어두운 현재는 초당 픽셀 당 0.061 전자이며, 양자 효율은 0.90보다 큽니다. 시스템은 SmartExperiments 모듈을 포함 Axiovision 4.8 소프트웨어에 의해 제어됩니다. tdToma의 검출을위한우리가하는 통과 빛의 85 %는 형석 및 방출 빛의 95 %을 자극 할 수있는 Zeiss 필터 세트 75HE를 사용하면 방출 필터를 통과합니다.

1. 여러 긴 시간 간격으로 이미지의 자동화 인수에 민감한 신호의 감지, 특정 여기 빠르게 shuttering, 동력 무대와 초점 팔의 LED 광원 및 소프트웨어 제어를위한 역 현미경과 EMCCD 카메라와 이미징 시스템을 조립 Z-스택. 이 시스템은 진동으로부터 격리 할 공기 테이블에 앉아해야합니다.
2. 37 ° C, humidified 챔버에 5~10%의 CO ₂ 세포를 유지하기 위해 무대 위로 배양기를 조립. 실험이 진행되는 동안 이동 유물을 최소화하기 위해 안정적인 온도에 와서 할 수있는 시스템에 대한 충분한 시간을 허용합니다.
3. 샘플에서 열을 빼돌 렸에서 목적을 방지 할 수있는 목적을위한 온수 칼라를 사용하십시오.

3. 레이블 DNA의 시각화

1. 35mm의 플레이트 세포셀의 쌍 중복없이 8-16 세포의 식민지로 분할 할 수 있습니다 미만 10 % 합류의 밀도에 유리 바닥 요리. 가능한 세포가 분열 할 시간이 너무 이미징 전에 최소한 24-48 시간을 수행합니다.
2. 영상의 시작 전에 1 ~ 3 시간은 선택 마약과 IPTG를 모두 부족 문화 매체로 판에게 3 번 씻어. 이 절차는 거리에 비 가능한 세포를 씻어하고 LacI 융합 단백질은 plasmids의 LacO 사이트를 바인딩 할 수 있습니다.
3. 10% 태아 소 혈청과 25 밀리미터 HEPES 2 개 ML DMEM으로 문화 매체를 교체하십시오.
4. CultFoil있는 배양 접시의 상단을 바꾸기 35mm 요리에 장착 링에되었다. 이 커버는 시간이 지남에 따라 소금 농도를 증가하고 세포를 죽일 문화 매체의 증발을 억제합니다.
5. 세포를보고보기의 여러 분야에서 상단 및 세포 하단의 초점 비행기를 결정하는 차동 간섭 대비 (DIC) 이미지를 사용합니다.각 분야에서 세포의 정상에서 초점 평면에 방식의 약 1 / 3 아래로 이동합니다. , y를 x를 저장, z는 저장 단계 위치 목록에서 조정합니다.
   참고 : 플라스미드 신호는 세포가 LacI 융합 단백질에 적합한 파장의 LED가에 의해 조명하는 접안 렌즈를 통해 표시되지 않을 수 있습니다. 약 신호는 시간이 지남에 따라 신호의 통합을 허용하기 때문에 효율적으로 약한 신호를 증폭 EMCCD 카메라의 사용과 표시 될 수 있습니다.
6. 현미경 제어 소프트웨어에서 각 저장 단계 위치에 수행 할 이미지의 Z-스택을 정의합니다. Z 치수 ¹⁴ 대략 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링로 수 0.35-0.50 μm의 AZ 단계 크기를 선택합니다. 셀이있는 위하고 비행기 아래의 "추가"조각을 포함,이 조각은 세포주기 동안 세포 움직임에 따라 검색을 할 수 있으며, 또한 이미지 스택의 후 수집 처리 (deconvolution)에 사용됩니다. 이 포함 거예요셀의 두께에 따라 40-60 이미지의 스택에 발생.
7. 현미경 제어 소프트웨어 (plasmids를 시각화를위한 10-60 분 간격으로 30 분 간격 (긴 시간 동안 세포 분열 및 마이그레이션을 추적하기위한)와 형광 이미지에서 Z-스택의 시야 이미지를 수집하기 위해 시계열 실험을 정의 세포 내에서). 이 긴 실험의 과정을 통해 광독성에 불필요한 셀을 표시 할 수 있습니다 표준 시야 영상,보다 더 많은 빛을 필요로 실험이 진행되는 동안 DIC 이미지를 사용하지 마십시오.
8. 소프트웨어 제어 실험을 시작합니다. 시스템이 실험이 진행되는 동안 (초과 객실 조명 등에 노출 친) 방해하지 않습니다 있는지 확인하십시오.
9. 필요한 경우, 실험이 진행되는 동안 가습 시스템에서 물을 보충.

4. 이미지의 후 수집 처리

1. 각 Z-스택 및 시간 포인트에 대한 이미지를 검토합니다. 불필요한 지역을 자르기다음 단계에서 컴퓨터 처리 시간을 줄일 수있는 이미지.
2. 각 Z-스택 ¹⁵ 원산지의 픽셀에 신호 강도를 다시 할당 할 deconvolution 알고리즘을 사용합니다. 이 deconvolution가 이미징 시스템을위한 이론적 점 확산 함수 (point spread function)를 기반으로 할 수 있지만, 영상 형광 마이크로하여 특정 시스템의 점 확산 함수 (point spread function)를 측정하고, deconvolution 알고리즘에서이 측정을 사용하는 것이 바람직합니다. 우리는 우리의 이미징 시스템의 점 확산 함수 (point spread function)을 측정하고 적용 AxioVision 소프트웨어 (AxioVision 소프트웨어 설명, Zeiss)의 최대 가능성 알고리즘을 반복 제약.
3. 강도의 변화와 움직임 plasmids의 세포주기 동안과 딸 세포에 plasmids의 파티션을 추적 할 이미지를 검사합니다.

결과

대표 실험에서 얻은 Z-스택의 최대 강도 계획은 그림 3에 표시됩니다. 일반적인 플라스미드 신호들은 단일 또는 plasmids의 클러스터 대표 여부에 따라 Z-스택의 3-8 조각,에 존재한다. 셀 유사 분열에 도달 할 때까지 EBV 및 KSHV 파생 plasmids의 경우, 신호가 세포 내에서 천천히 이동합니다. 세포 자체가 실험의 과정을 통해 마이그레이션. 또한 구형이되고 유사 분열 동안 음식에서 분리....

토론

여기에 설명 된 방법은 여러 세대에 걸쳐 시간이 지남에 따라 실시간으로 포유류의 세포에 plasmids를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 여기 빛에 노출을 제한함으로써, 우리는 최소 72 시간, 3 셀 부문을 대표하는 16-32 세포의 콜로니를 통해 새로 분할 쌍의 세포를 수행하는 이러한 기술을 사용했습니다. 이 실험은 정량 PCR, blotting 남부 및 어류와 같은 정적 assays에서 얻을 수없는 정보를 제공합니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
DMEM	GIBCO	11,965
OptiMEM	GIBCO	31,985
태아 소 혈청	Hyclone	SH30910.03
페니실린	시그마	P3032
스트렙토 마이신 황산	시그마	S9137
Hygromycin	Calbiochem	400050	SLK 400 μg / ML, 300 μg / 헬러에 ML
이소 프로필 - BD-thiogalactoside (IPTG)	로슈	10 724 815 001	최종 농도 200 μg / ML
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
HEPES	GIBCO	15,630
유리 바닥 요리	MatTek	P35G - 1.5-10-C
CultFoil	Pecon	000000-1116-08
Axiovert 200M	Zeiss
Colibri	Zeiss	423052-9500-000
중립 백색 LED	Zeiss	423052-9120-000
필터 큐브 75 HE	Zeiss	489075-0000-000
계획 - 고차 색지움의 63x/1.4 목표	Zeiss	440762-9904-000
CascadeII : 1024 EMCCD 카메라	Photometrics	B10C892007
Tempcontrol 미니	Zeiss / Pecon	000000-1116-070
Tempcontrol 37-2 디지털	Zeiss / Pecon	000000-1052-320
CTI 컨트롤러 3700 디지털	Zeiss / Pecon	411856-9903
목표 히터	Zeiss / Pecon	440760-0000-000
무대 난방 삽입 P	Zeiss / Pecon	411861-9901-000
무대 위로 보육 S	Zeiss / Pecon	411860-9902-000
가습기 시스템	Zeiss / Pecon	000000-1116-065