قياس نفاذية كبيبي الجزيئات نيون باستخدام المجهر 2 فوتون في ميونيخ فئران ويستار

Summary

وهناك تقنية عالية الدقة باستخدام المجهر intavital 2 الفوتون لتصور مباشرة وتحديد الترشيح gloemrular في الكبيبات السطح. هذا الأسلوب يسمح للتقرير مباشرة من خصائص نفاذية الجزيئات في الدول على حد سواء طبيعية والمريضة.

Abstract

أمراض الكلى التي تنطوي على فقدان البول من الجزيئات الأساسية الكبيرة، مثل ألبومين المصل، منذ فترة طويلة يعتقد أن سببها تغييرات في حاجز نفاذية تتألف من podocytes، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، والغشاء القاعدي تعمل في انسجام تام. وكشفت بيانات من مختبرنا باستخدام المجهر حيوي داخلي 2 الفوتون أكثر نفاذية كبيبي حاجز الترشيح (GFB) مما كان يعتقد سابقا في ظل ظروف الفسيولوجية، مع استرجاع تصفيتها الزلال التي تحدث في وقت مبكر فرعية من الخلايا تسمى الخلايا نبيب الداني (PTC) ^{1،2، 3.}

التقنيات السابقة تستخدم لدراسة الترشيح الكلوي وإنشاء سمة من حاجز الترشيح تشارك بزل مجهري من تجويف أنبوبي هذه القطاعات في وقت مبكر مع عينة من المحتوى وتحليل السائل ^4. تحدد هذه الدراسات تركيز الألبومين في السائل اللمعية أن تكون شبه معدومة؛ المقابلة عن كثبلماذا يتم الكشف عادة في البول. ومع ذلك، وتوصيف البوليمرات ديكستران مع الأحجام التي تحددها هذه التقنية كشفت تلك ذات حجم مماثل لألبومين المصل لديهم مستويات أعلى في التجويف الأنبوبي والبول؛ مما يوحي زيادة نفاذية ^5.

وهنا هو مخطط تفصيلي للتقنية المستخدمة لتصور مباشرة وقياس نفاذية كبيبي الألبومين الفلورسنت في الجسم الحي. هذا الأسلوب يسمح للكشف عن ألبومين تصفيتها عبر حاجز الترشيح في الفضاء بومان (الغرفة الأولي من الترشيح البولية)، وأيضا يسمح الكمي لاستيعاب الزلال بواسطة الأنابيب القريبة والتخيل من transcytosis الزلال اللاحقة ^6. غياب الفلورسنت الألبومين في وقت لاحق على طول قطاعات أنبوبي في طريقها إلى المثانة يسلط الضوء على كفاءة مسار استرجاع في قطاعات نبيب الداني في وقت سابق. وعلاوة على ذلك، عندما تم تطبيق هذه التقنية لتحديد نفاذيةمن تم الإبلاغ عن dextrans وجود حجم مماثل لالزلال القيم نفاذية مطابقة تقريبا ^2. هذه الملاحظات دعم مباشرة على الحاجة إلى توسيع تركيز العديد من الأمراض الكلوية بروتيني البيلة إلى التعديلات المدرجة في القريب أنبوب صغير استصلاح الخلية.

Protocol

1. اقتران من مصل الزلال الجرذ إلى سلفو رودامين 101 كلوريد سلفونيل (تكساس الأحمر)

1. حل 100 ملغ من الجرذ مصل الزلال (RSA) في 6.667 مل من 100 ملي بيكربونات الصوديوم 9.0 درجة الحموضة؛ تركيز النهائي 15 ملغ / مل في 50 مل المخروطية أنبوب.
2. مكان الحل في الجليد / الماء كوب وبارد إلى ما بين 0-4 درجة مئوية.
3. إضافة 200 ميكرولتر من جودة عالية الفورماميد ثنائي ميثيل اللامائية (DMF) إلى قارورة ملغ 10 من تكساس الأحمر كلوريد سلفونيل (المركز التايلندي)؛ دوامة على المدى المتوسط ​​لمدة 15 ثانية.
4. دوامة حل RSA على المدى المتوسط ​​وإضافة المركز التايلندي المنحل.
5. التفاف 50 مل المخروطية في احباط (Parafilm يمكن استخدامها لأؤكد ختم ضيق يتشكل)، المكان أفقيا في دلو الجليد ث / الجليد فقط ومكان على الكرسي الهزاز للتحريض حل ببطء (تجنب تشكيل فقاعات)، تسمح رد فعل أن تواصل في 0 إلى 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
6. جعل 5 L من محلول ملحي 0.9٪، والرطب 50 كيلو دالتون الوزن الجزيئي بقطع الدائرة التي يمكن أن تكون إما أ) غشاء غسيل الكلى مع لقطات، ب) ديأنابيب alysis كما هو الحال في تعويم-A-lyzer، أو ج) الشريحة-A-lyzer كاسيت (كل مناسبة لإزالة المركز التايلندي اللامقترن).
7. مكان خليط التفاعل في غرفة غسيل الكلى ومكان في 5 L حاوية ث / محلول ملحي 0.9٪، dialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف باستخدام قضيب تحريك.
8. تغيير 5 L حل غسيل الكلى في الصباح وبعد الظهر في وقت متأخر حتى على نتائج الحضانة بين عشية وضحاها تقريبا في أي تغيير اللون (وهذا يأخذ عادة ~ 48 ساعة مع 4 على الأقل التبادلات). بالإضافة إلى ذلك، مع MWCO من 50 كيلو دالتون كونها قريبة جدا من ميغاواط من RSA، 66kDa؛ فمن الممكن أبدا إنتاج حل واضح، وهذا سوف تعتمد على التوزيع في حجم المسام في الغشاء، و 60 ساعة و 5 التبادلات غير أكثر من الوقت الكافي.
9. حجم قياس وتقسيم الوزن الأولي من 100 ملغ من حجم لإعطاء تركيز تقريبي من TR-RSA؛ عادة ما تتراوح تركيزات 10-13 ملغ / مل. يجب أن تكون نسبة الزلال ~ 4:1، 1 fluorophore في 15،00: الصبغة النهائية0 دالتون من MW البروتين. تخزينها في 4 درجة مئوية؛ NEVER تجميد حل TR-RSA، كما أدى التشرذم الذي قد يحدث سوف يغير القيم النفاذية.

2. إعداد مجهر المرحلة مقلوب لإعدادات التصوير / مجهر

1. مكان ~ 4-7 قطعة من شريط الأوتوكلاف (حوالي ¾ "لفترة طويلة) مكدسة فوق بعضها البعض تماما داخل 50 ملم مع طبق 40 مم أسفل ساترة (طبق أسفل ساترة). ينبغي أن توضع هذه أقرب إلى واحدة من الحواف بحيث سوف حافة الشريط اجراء اتصالات مع حافة انحناء في الكلى ولكن ليس قطع الطريق ضوء الهدف (أرقام 1A و 1B)؛ سيتطلب الفئران أكبر مساحة أكبر بين الشريط وحافة الطبق.
2. مكان 2 منصات Repti-الحراريات المقبل إلى المرحلة جنبا إلى جنب مع 50 مم طبق (الشكل 1A). وضع الاحترار المياه بطانية سترة على خشبة المسرح.
3. تحقيق أقصى قدر من الكفاءة عندما جمع الصور بطمأنة برج موضوعية لديه 10X الهواء سR 20X (الهواء أو الماء الغمر) هدف وأعلى بالطاقة الهدف غمر المياه لجمع الصور لتحديد الكميات.
4. أثناء التصوير أنجع وسيلة لإضافة الماء إلى الأهداف هو تناوب عليها إلى الجانب وإضافة الماء باستخدام حقنة سم مكعب 1 مع قطعة طويلة من الأنابيب PE-200 يمكن أن تصل إلى الجزء العلوي من الأهداف.
5. تعيين شدة الإثارة من الليزر 10watt إلى ~ 15-20٪ باستخدام مرشحات الكثافة محايدة على البرنامج. يتم تعيين الغاليوم-أرسنيد فوسفيد الاستشعار البصرية غير descanned إلى 750 لجمع الانبعاثات الخضراء، و 625 لجمع انبعاثات الأحمر. الأزرق الانبعاثات (مثل وصمة عار هويشت النووية 33342) يتم جمعها باستخدام معيار كاشف multialkaline nondescanned مع إعداد بين 750-800.
6. لضمان جمع السليم للانبعاثات منخفضة الكثافة داخل الفضاء بومان، تأكد من تعيين الحدود الدنيا للكشف حتى لا تستبعد هذه القيم. سوف علامات تحذير مرئي بيان ما إذا كانت حساسيةالإعداد هو منخفض جدا، ويجري التعبير عن هذه القيم قيمة كثافة من الصفر.
7. تحميل 1 سم مكعب حقنة مع ~ 5-8 ملغ من حل الألبومين الفلورسنت المخفف بمحلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ لإحضار الحجم الكلي إلى 1 سم مكعب.

3. فضح الكلى في يستار الفئران ميونيخ لحيوي داخلي 2 فوتون التصوير

1. تبدأ مع الفئران قبل تخدير باستخدام Pentabarbitol (50 ملغ / مل حل، 120 μl/100 غرام من وزن الجسم)، Inactin (130 ملغ / مل حل، 120 μ/100 غرام من وزن الجسم)، أو Isofluorane (5٪ الاستقراء، 1.5 لصيانة 2.5٪)، وهو خط وريدي الساكن وصول (الوريدي الوداجي إما أو الفخذ)، والجهة اليسرى حلق من أسفل القفص الصدري إلى ما فوق الفخذ الأيسر.
2. وضع فأر مسطح على جانبها الأيمن بحيث يتم اليسار، جنبا حليق مواجهة؛ تأكد من أنه مسطح على الطاولة، مع موقفها ممدود وليس جاثم، مع الجبهة الكفوف لمس كل الكفوف الأخرى والخلفية لمس كل منهما الآخر (الشكل 2A).
3. جدا جس بلطف ليشعر الكلى لتحديد حيث يضع بشكل طبيعي داخل الحيز خلف الصفاق ورسم خط مستقيم مواز للجسم (من القفص الصدري إلى الفخذ) باستخدام شربي (الشكل 2A).
4. التقاط الجلد مع زوج من ملقط مسنن، وقرصة الجلد على طول الخط الذي رسمته باستخدام زوج من المرقأة لسحق الأنسجة ومنع النزيف. قطع على طول شق باستخدام زوج من مقص جراحي. سوف سحق الجلد الخارجي وطبقات العضلات قبل القطع والحد بشكل كبير من عادة قضاء على النزيف.
5. كرر هذا الإجراء للطبقة العضلات الخارجي، والتي هي رقيقة.
6. لشق في طبقة العضلات الداخلية، والتي سوف تعرض الصفاق، وإعادة جس الكلى لتقدير حجم. قرصة خط شق أصغر من الكلى، مؤكدا على شق ما يزيد قليلا على الكلى. فمن الأفضل لجعل هذا شق صغير جدا وجعله أكبر إذا لزم الأمر. إذا تم إجراء هذه كبيرة جدا، وسوف تكون هناك حاجة خياطة.هذا الشق الأخير هو الحرجة؛ بعيدا جدا أكثر في أي اتجاه سوف تؤثر على الاستقرار على المسرح وإما لحث الحركة الفنية من التنفس (أفضل سيناريو) أو سوف تمتد الكلوي عنيق والحد سلبا التروية الكلوي (السيناريو الأسوأ).
7. تحديد موقع الكلى (كما هو موضح في الشكل 2B) وقبضة من الدهون المحيطة باستخدام ملقط، والعمل نحو القطب السفلي من الكلية في تسليم أزياء اليد.
8. مرة واحدة يتم الوصول إلى القطب السفلي من الكلى، وسحب بلطف الكلى من خلال شق في حين الضغط بلطف جدا تحت الكلى إلى الداخل للظاهر. إذا شق صغير جدا، سحق الطبقة العضلية وخفض لتوسيع ذلك؛ تكرار الإجراء إلى الداخل للظاهر الكلى.

4. وضع يستار الفئران ميونيخ على المسرح لتصوير

1. وضع الكلى نحو حافة الطبق ساترة مع الكلى تناوب قليلا نحو (الجانب الخلفي) الظهرية من الفئران وبالتالي فإن الجانب البطني من الكلى طو مما يجعل الاتصال مع الطبق أسفل ساترة (الشكل 1A). إضافة لذلك، معقمة 09. الحل تحسنت٪ المالحة إلى الطبق.
2. ننظر من خلال الهدف 10X 20X أو وتحقق من وجود الحركة. إذا تم الكشف عن الحركة، ولفة من الفئران أكثر قليلا حتى القفص الصدري هو أبعد من الطبق أسفل ساترة؛ تأكد الكلى هو أقرب إلى حافة الطبق دون تمتد الكلوي عنيق (1B الشكل).

5. الحصول على الصور لقياس نفاذية الكلوي من الزلال

1. حساب نفاذية كبيبي (Glomeruluar النخل معامل؛ GSC) وسوف من أي جزيء يتطلب اتخاذ الصور الخلفية المرجعية من الكبيبات الفردية قبل التسريب من جزيء نيون. إذا تم تجهيز المجهر مع مرحلة الآلية قادرة على مواقع وسم، والعثور على والكبيبات مركز على حدة باستخدام الهدف انخفاض بالطاقة، وعلامة كل موقع. A تمريرة مزدوجة فلوريسئين / رودامين epifluorescence فيلثالثا مثالية لهذا الإجراء على الرغم إما تصفية الانبعاثات ستعمل (لن النقيض من المرحلة أو غيرها من مصادر غير مضان من إضاءة لا تعمل). سوف الكبيبات تظهر هياكل دائرية فارغة محاطة الأنابيب القريبة جود autoflourescence الأصفر والبرتقالي المتأصلة عند عرضها من خلال تمرير مرشح مزدوج.
2. إذا لم يكن لديك مجهر مرحلة الآلية، مسح الكلى في نمط النقطية مع الهدف منخفضة الطاقة وعمل خريطة بدائية من حيث تقع الكبيبات الفردية؛ الاعتماد على المعالم الطبيعية مثل الأوعية الدموية السطحية الكبيرة تقع فوق الكبسولة الكلوي أو بقع الدهون.
3. التبديل البرج إلى الماء أعلى سلطة الهدف الغمر واتخاذ مجموعات بيانات 3D من كل الكبيبات والتأكد من العرى الشعرية والفضاء بومان هي واضحة للعيان. وسوف تستخدم لوحة pseudocolor (شيء ما عدا B / W) تساعد على تصور هذه الهياكل.
4. مع التركيز في على الأوعية الدموية السطحية لبث ببطء في تيوقال انه يتم إعطاء الألبومين الفلورسنت مما يجعل الوقت تأكد من السماح لتوزيع النظامية. لجزيئات منخفضة مع GSC فمن الضروري لتعظيم قيم الكثافة في البلازما ولكن ليس للوصول إلى مستويات من شأنها أن تشبع للكشف عن الصورة في المجهر. وهذا يزيد من إمكانية الكشف الجزيئات التي تمت تصفيتها. ملاحظة: هناك عادة 5-7 ثوانى الفاصل بين الوقت الذي يتم عرض الألبومين الفلورسنت إلى الوقت الذي يظهر على الشاشة (الحصول على إطارات كامل في ~ 1 إطار / ثانية).
5. تسمح حوالي 10 دقيقة للسماح أي شظايا الوزن الجزيئي صغير المحتملة لمسح قبل الحصول مجلدات 3D على فترات ميكرون 1 لاستخدامها في حساب GSC الزلال. عادة، سلالة من سيمونسن من ميونخ ويستار الفئران لديها الكبيبات سطح أقل بكثير، لذلك كل ما يمكن تصور وتصوير وكميا. سلالة Frömter لديها عدد أكبر بكثير حتى نتمكن تحديد عدد كميا إلى ~ 10.
6. في نهاية الدراسة هو الموت الرحيم الفئران عن طريق جرعة زائدة من anesthetIC المستخدمة في الدراسة. يتم تنفيذ pneumothoracotamy المزدوج لضمان القتل الرحيم.

6. حساب GSC للنيون الزلال من وحدات التخزين 3D

1. باستخدام Metamorph برامج معالجة الصور تحميل مجموعات البيانات 3D لكل الكبيبات، فإن كلا من مجموعة أساسية ومجموعة اتخاذها بعد ضخ الزلال الفلورسنت.
2. في مجلد يحتوي على الألبومين الفلورسنت تحديد حلقة الشعرية سطحية مع مساحة كافية مساحة فارغة بين الهوامش المحددة لها وعلى حافة كبسولة بومان.
3. في حجم خلفية تحديد موقع الطائرة نفسها التنسيق التي ينبغي أن تحتوي على جميع الإشارات البصرية للصورة التي تحتوي على الزلال. حدد منطقة ضمن حلقة شعري من الاهتمام ونلاحظ أن متوسط ​​القراءة كثافة. المقبل تحديد منطقة داخل الفضاء بومان ونلاحظ أن متوسط ​​القراءة كثافة. وسوف تستخدم هذه كقيم الخلفية.
4. لتحديد الكميات، تحديد المنطقة مماثلة داخل الفضاء بومان في ج الزلالontaining الصورة. القيام بذلك لمدة سنتين على الأقل من أقاليم أخرى لتأخذ في المتوسط ​​قيمة لمتوسط ​​كثافة داخل الفضاء بومان.
5. اختر حلقة الشعرية مع ألمع كثافة البلازما ورسم المنطقة من حوله. القادم باستخدام وظيفة عتبة، تسليط الضوء على القيم مشرق داخل البلازما المنتشرة، وتجنب الشرائط السوداء التي تنتشر في RBC. لاحظ أن متوسط ​​قيم كثافة المساحة البلازما المحددة. فمن المهم لتحديد تفضيلي المناطق مشرق من البلازما بسبب عوامل داخل الدم لن تؤدي إلا لسبب والتقليل من مستويات مضان البلازما.
6. باستخدام جدول بيانات Microsoft Excel بإدخال القيم لحساب GSC حيث:

النتائج

ويبين الشكل 3 مثالا لصورة مأخوذة من الكبيبة سطح ميونيخ يستار الفئران Frömter والخطوات المتخذة لتحديد نفاذية الفلورسنت الزلال. قيمة GSC لالزلال من 0.0111 المشتق من هذا الخريف الكبيبة الفردية ضمن نطاق ينظر في هذه السلالة من ميونخ فئران ويستار عندما تكون في حالة بنك ا...

Discussion

تمثل الخطوات تسليط الضوء هنا ما نشعر به لتكون تلك التي من شأنها أن تنتج قيم نفاذية متسقة ودقيقة لأنها تحايل على المزالق التالية:

1. نثر: إن استخدام fluorophores ينبعث منها الأحمر يسمح لجمع أكثر كفاءة من الضوء منذ الفوتونات ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07