Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Özet

2-foton mikroskopi yüksek çözünürlüklü intavital kullanan bir teknik doğrudan görselleştirmek ve yüzey glomerüllerde gloemrular filtrasyon ölçmek için. Bu yöntem, normal ve hastalıklı hem Devletler makromoleküllerin geçirgenlik özelliklerinin doğrudan belirlenmesi için olanak sağlar.

Özet

Bu albümin serum, uzun geçirgenliği podocytes oluşan bariyer, damar endotel hücreleri ve uyum içinde çalışan bir bazal membran değişiklikler neden olduğu düşünülmüştür gibi büyük temel makromoleküllerin idrar kaybı, ilgili Böbrek hastalıkları. Intravital 2-foton mikroskopi kullanılarak laboratuarda elde edilen veriler, proksimal tübül hücreleri (PTC), ^1,2 adlandırılan hücrelerin erken altkümedeki süzüldü albümin alma ile daha önce fizyolojik koşullar altında düşünce göre daha geçirgen glomerüler filtrasyon bariyer ^(GFB), ortaya ^3.

Önceki teknikler böbrek filtrasyon incelemek için kullanılır ve sıvı içerik ve analiz ⁴ örnekleme ile bu ilk boru bölümlerinin lümeninin micropuncture dahil Süzme bariyerinin karakteristik kurulması. İlgili yakından; Bu çalışmalar yok denecek kadar olması luminal sıvı albümin konsantrasyonu tespitnormalde idrarda tespit ne için. Ancak, bu teknik tarafından tanımlanan boyutlar ile dekstran polimerlerin karakterizasyonu serum albümin benzer bir büyüklükte, ortaya boru şekilli lümeni ve idrarda yüksek seviyelere sahipti; artan geçirgenliği ⁵ düşündürmektedir.

Burada doğrudan görselleştirmek ve in vivo olarak glomerüler floresan albümin geçirgenliği ölçmek için kullanılan tekniğin ayrıntılı bir taslak olduğunu. Bu yöntem, Bowman adlı kullanıcının alanı (idrar filtrasyon ilk odası) içine filtrasyon bariyeri genelinde filtre albumin tespiti için izin verir ve aynı zamanda proksimal tübüllerde ve sonraki albümin transcytosis ⁶ görselleştirme ile albümin reabsorbsiyonu ölçümü sağlar. Mesane yolda daha sonra boru segmentleri boyunca floresan albumin yokluğu önceki proksimal tübül segmentlerinde alma yolunun etkinliğini vurgulamaktadır. Ayrıca, bu teknik uygulandığında geçirgenliğini saptamak içinalbumin, hemen hemen aynı geçirgenlik değerlerine benzer bir boyutu olan dekstranlar ^2. bildirildi. Bu gözlemler doğrudan proksimal tübül hücre ıslahı dahil değişiklikler için birçok proteinürik böbrek hastalıklarının odak genişletmek için ihtiyaç destek.

Protokol

1. Sulfo-Rodamin 101 Sülfanil Klorür (Texas Kırmızı) için Albümin Rat Serum Çekimi

1. Nihai konsantrasyon 50 ml konik bir tüp içinde 15 mg / ml, 100 mM sodyum bikarbonat pH 9.0 arasında Rat (RSA) Serumu Albümini 6.667 ml, 100 mg çözülür.
2. Yeri buz / su kabı çözüm ve 0 ile 4 ° C arasında serin
3. 15 saniye boyunca ortam üzerinde girdap; Texas Kırmızı sülfonil klorit (TRSC) bir 10 mg flakon için yüksek kaliteli susuz dimetil formamid (DMF) içinde 200 ul ekleyin.
4. Vortex RSA ortamda çözüm ve çözünmüş TRSC ekleyin.
5. Folyo ile sarın 50 ml konik (oluşan Parafilm sıkı bir mühür sağlamak için kullanılabilir), yatay w / buz sadece ve yeri (kabarcık oluşumunu önlemek) yavaş yavaş çözüm kışkırtmak için rocker üzerinde buz kovası yer, reaksiyon 0 devam etmesine izin 4 ° C'de 1 saat boyunca kanştınldı.
6. % 0.9 serum fizyolojik 5 L olun ve klipleri ile ya) diyaliz membran olabilir odası kesilmiş bir 50 kDa molekül ağırlığı, b) di ıslakbir float-bir-leriyle, veya c) slayt-bir-leriyle kaset (indirekt TRSC kaldırmak için tüm uygun) olduğu gibi alysis boru.
7. 5 litrelik konteyner w /% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde diyaliz bölmesi ve bir yerde yer Reaksiyon karışımı, bir karıştırma çubuğu kullanılarak hafif çalkalama ile 4 ° C'de gece boyunca dialyze.
8. Neredeyse hiç renk değişimi bir gecelik inkübasyon sonuçları (Bu genellikle en az 4 değişim ile ~ 48 saat sürer) kadar sabah ve ikindi 5 L diyaliz solüsyonu değiştirin. Ayrıca, 50 kDa MWCO RSA, 66kDa en MW kadar yakın olmak, bu bir berrak bir solüsyon elde asla mümkün olduğunu, bu membran gözenek boyutu dağılımı bağlı olacaktır, 60 saat ve 5 değişim olduğu yeterli bir süre daha fazladır.
9. Ölçü hacmi ve TR-RSA yaklaşık konsantrasyon elde etmek için hacim ile 100 mg başlangıç ​​ağırlığı bölme, tipik konsantrasyon aralığı 10-13 mg / ml arasındadır. Son boya: albümin oranı 15,00 ~ 4:1 1 fluorofor olmalıdırProtein MW 0 Dalton. 4 ° C'de saklayın; oluşabilir parçalanması sonucu geçirgenlik değerleri değiştirecek gibi, TR-RSA çözüm FREEZE ASLA.

2. Görüntüleme / Mikroskop Ayarları için Ters Mikroskop Sahne hazırlanması

1. Yer ~ otoklav bant 4-7 parça (yaklaşık ¾ "uzunluğunda) mükemmel bir şekilde, bir 40 mm altındaki lamel (lamel alt çanak) sahip 50 mm'lik bir çanak içinde birbiri üzerine yığılmış. Bu kenar uçlarından biri ile daha yakın yerleştirilmesi gerekir, böylece bant kenarı böbrek eğrilik kenarı ile temas ancak objektif ışık yolu (Şekil 1A ve 1B) engellemez; büyük sıçan yemeğin bant ve kenar arasında daha fazla boşluk gerektirir.
2. 50 mm çanak (Şekil 1A) ile birlikte sahne yanında yer 2 Repti-therm pedleri. Sahne üzerinde bir ısınma su ceketi battaniye yerleştirin.
3. Objektif taret temin görüntüleri toplama bir 10x hava o olduğunda verimliliği maksimizer 20x (hava veya su daldırma) objektif ve kantitatif için görüntüleri toplamak için daha yüksek enerjili su daldırma hedefi.
4. Görüntüleme sırasında hedefleri su eklemek için en etkili yolu tarafa çevirin ve hedefleri üst ulaşabilirsiniz PE-200 boru uzun bir parça ile bir 1 cc şırınga kullanarak su eklemektir.
5. Yazılım nötral yoğunluk filtreleri kullanarak ~% 15-20 için 10watt lazer ikaz yoğunluğunu ayarlayın. Galyum-arsenit fosfit olmayan descanned fotodedektörler kırmızı emisyon toplamak için yeşil emisyon ve 625 toplamak için 750 olarak ayarlanır. Mavi emisyon (örneğin nükleer leke Hoechst 33.342 gibi) 750-800 arasında bir ayar ile standart nondescanned multialkaline dedektör kullanılarak toplanır.
6. Bowman alanı içinde düşük yoğunluklu emisyonlarının uygun toplama sağlamak için, dedektörlerin alt limitleri değerleri dışlamak için değil şekilde ayarlanmış olduğundan emin olun. Görsel uyarı işaretleri gösterir, hassasiyetayarı çok düşük ve bu değerler sıfır bir yoğunluk değeri verilmektedir.
7. 1 cc toplam hacmi getirmek için% 0.9 steril serum fizyolojik ile sulandırılmış floresan albumin çözüm ~ 5-8 mg ile 1 cc şırınga yükleyin.

3. Intravital için Münih Wistar Rat Böbrek açığa 2-Foton Görüntüleme

1. Pentabarbitol (50 mg / ml solüsyon, 120 μl/100 g vücut ağırlığı), Inactin (130 mg / ml solüsyon, 120 μ/100 g vücut ağırlığı) ya da izofloran (% 5 indüksiyonu, 1,5 ile bir ön anestezi sıçan başla ) 2.5% bakım, bir kalıcı venöz erişim hattı (ya juguler veya femoral ven), ve sol kanattan sadece göğüs kafesi altında sadece sol uyluk yukarıdan tıraş.
2. Bu yüzden onun sağ tarafındaki düz sıçan yerleştirin ki sol, tıraşlı yüzü yukarı bakacak, onun duruş uzatılmış ve (Şekil ön pençeleri birbirlerine dokunmadan birbirleriyle ve arka pençeleri dokunmadan, çömelmiş değil ile, masada düz olmasına dikkat edin 2A).
3. Çok hafifçe doğal retroperiton içinde bırakır belirlemek ve bir Sharpie kullanarak vücudun (uyluk göğüs kafesi itibaren) (Şekil 2A) paralel düz bir çizgi çizmek için böbrek hissetmek palpe.
4. Dişli forseps bir çift ile cilt Pick up ve doku ezmek ve kanamayı önlemek için hemostat bir çift kullanarak çizilen hat boyunca cilt çimdik. Cerrahi bir makas kullanarak kesi boyunca kesin. Önce kesim için dış deri ve kas tabakaları Kırma önemli ölçüde azaltmak ve genellikle kanama ortadan kaldırır.
5. Ince dış kas tabakası, için bu yordamı yineleyin.
6. Periton gösterecektir iç kas tabakası, içine kesi için, boyutunu tahmin etmek böbrek yeniden palpe. Böbrek daha küçük bir kesi hat sıkıştırın; kesi güvence sadece böbrek bitti. Bu kesi çok küçük yapmak ve gerekirse daha büyük yapmak için en iyisidir. Bu çok büyük yapılmış ise, dikiş gerekli olacaktır.Bu son kesi önemlidir; çok uzakta herhangi bir yönde üzerinde sahnede istikrarı etkileyen ve neden nefes (en iyi durum senaryosu) den ya hareket eserler veya renal pedikül ve olumsuz azaltmak böbrek perfüzyon (en kötü durum senaryosu) uzatmak olacaktır.
7. El moda üzerinde el böbreğin alt kutbu doğru çalışma, böbrek (Şekil 2B gösterildiği gibi) ve kavrama forseps kullanarak çevreleyen yağ bulun.
8. Böbreğin alt kutbu ulaşıldığında çok yavaşça exteriorize için böbrek altında sıkma ise, hafifçe kesiden böbrek çekin. Kesi çok küçük ise, kas tabakası ezmek ve genişletmek için kesilmiş, böbrek exteriorize için prosedürü tekrarlayın.

4. Görüntüleme için Sahne Alanı'nda Münih Wistar Rat yerleştirme

1. Böbrek ile lamel çanak kenarına doğru böbrek yerleştirin biraz sıçan dorsal (arka taraf) doğru döndürülmüş böbreğin ventral tarafı bu yüzdens lamel alt çanak (Şekil 1A) ile temas. Çanak bir ılık, steril 09.% Tuz solüsyonu eklenir.
2. 10x veya 20x objektif bakmak ve hareket kontrol edin. Hareket tespit edilirse göğüs uzağa lamel alt çanak bu yüzden, biraz üzerinde fare döndürün; böbrek gibi renal pedikül (Şekil 1B) zorlamadan çanak kenarına yakın olduğundan emin olun.

5. Albümin renal geçirgenliği ölçmek için Görüntü Alma

1. Glomerüler geçirgenlik (Glomeruluar Eleme Katsayısı; GSC) hesaplanması herhangi makromolekülün önce floresan molekülün infüzyon bireysel glomerül referans arka plan resimleri alarak gerektirecektir. Mikroskop işaretleme yerleri kapasitesine sahip motorlu bir sahne ile donatılmış ise, bulmak ve düşük güçlü amacı ile merkezi bireysel glomerüller ve her yeri işaretlemek. Bir iki geçişli Fluorescein / Rodamin Epifloresans filya emisyon filtresi (faz kontrast veya aydınlatma olmayan diğer floresan kaynakları çalışmaz) çalışacaktır rağmen ter bu işlem için idealdir. Glomerüller çift geçiş filtresi bakıldığında doğal bir sarı-turuncu autoflourescence olan proksimal tübüllerde çevrili boş dairesel yapılar olarak görünür.
2. Mikroskop motorlu bir sahne yoksa, düşük güç amacı ile bir raster desen böbrek tarama ve bireysel glomerül bulunduğu ilkel bir harita yapmak, bu tür böbrek kapsül üzerinde bulunan büyük yüzeysel kan damarları gibi doğal yerlerinden dayanarak veya yağ yamalar.
3. Yüksek güç suya daldırma hedefi için taret geçin ve kılcal döngüler ve Bowman adlı kullanıcının alanı açıkça görülebilir emin her glomerüller 3D veri setleri almak. Bir Pseudocolor palet (S / B başka bir şey) kullanarak bu yapıların görselleştirmek için yardımcı olacaktır.
4. Yüzeysel bir kan damarı üzerinde odaklanarak yavaş yavaş t demlenmeyeo floresan albümin verme emin zaman sistemik dağıtımı için izin verilir. Düşük GSC ile moleküller için plazma yoğunluk değerleri en üst düzeye çıkarmak, ancak mikroskop fotoğraf detektörler doyurabilecek olacak seviyelere ulaşmak için değil önemlidir. Bu süzüldü moleküllerin tespit edilebilirliğini arttırır. Not: (1 kare / saniye ~ tam kare edinme) ekranda görünür floresan albümin zaman tanıtıldı zaman arasında bir 5-7 saniye hızlandırılmış genellikle yoktur.
5. Yaklaşık 10 dakika süresince herhangi bir olası küçük molekül ağırlıklı parçalarının albümin GSC hesaplanmasında kullanılmak üzere 1 mm aralıklarla 3 boyutlu hacim elde önce temizlemek için izin verin. Tipik olarak, Münih Wistar sıçan Simonsen'in gerginlik çok daha az yüzey glomerüllerde vardır, görülebilmesi tüm görüntülü ve sayısal böylece. Biz ~ 10 sayısal sayısını sınırlamak çok Frömter gerginlik çok daha büyük bir numarası vardır.
6. Çalışmanın sonunda, fare anesthet bir aşırı ile ötenaziic çalışmada kullanılan. Bir çift pneumothoracotamy ötenazi sağlamak için gerçekleştirilir.

6. 3D Birimleri gelen Floresan Albumin için GSC hesaplanması

1. Metamorph görüntü işleme yazılımı kullanarak arka plan seti hem, her glomerüller için 3D veri setleri yük ve floresan albumin infüzyonu sonra alınan ayarlayın.
2. Tanımlanmış marjları ve Bowman kapsül kenarı arasında yeterli alan boş yere sahip bir yüzeysel kılcal döngü bulun floresan albümin içeren hacmi.
3. Arka hacmindeki albümin içeren görüntünün tüm görsel ipuçları içermelidir aynı odak düzlemi bulun. Ilgi kılcal döngü içinde bir bölge seçin ve ortalama yoğunluk okuma unutmayın. Sonraki Bowman alanı içinde bir bölge seçin ve ortalama yoğunluk okuma unutmayın. Bu arka plan değerleri olarak kullanılır.
4. Kantitatif için, albümin c Bowman alanı içinde benzer bölgeyi seçingörüntü ontaining. Bowman alanı içinde ortalama yoğunluğu için ortalama bir değer almak için en az iki diğer bölgeler için bunu yapın.
5. En parlak plazma yoğunluğu ile kılcal döngü seçin ve çevresinde bir bölge çizin. Eşik işlevini kullanarak sonraki, RBC en dolaşan karanlık çizgiler kaçınarak, dolaşımdaki plazma içindeki parlak değerleri vurgulayın. Seçilen plazma alanı ortalama yoğunluk değerleri unutmayın. Kan içinde faktörler sadece yol ve plazma floresan düzeylerinin küçümsenmesi hizmet edecektir çünkü tercihen plazma parlak alanları seçmek önemlidir.
6. Bir Microsoft Excel elektronik nerede GSC hesaplamak için değerleri girin kullanarak:

Sonuçlar

Şekil 3 Münih Wistar Frömter sıçan ve floresan albumin geçirgenliğini belirlemek için atılan adımların bir yüzey glomerulus alınan bir görüntü bir örneğini göstermektedir. 0.0111 albumin için GSC değeri Münih Wistar rat zaman beslenen durumu ³ bu gerginlik görülen aralığında bu bireysel glomerulus sonbaharda elde. Bu görüntüler görülen kararlılık dikkatli planlama ve Şekiller 1 ve 2 de gösterilen, talimatların yürütülme...

Tartışmalar

Burada vurgulanan adımları biz aşağıdaki tuzaklar aşmak için tutarlı ve doğru geçirgenlik değerleri üretecek olanlar için ne hissediyorum temsil:

1. Saçılma: uzun dalga boyu fotonlar dağılım daha az eğilimli olduğundan kırmızı yayan fluorophores kullanımı ışık daha verimli toplama için izin verir. Ya yeşil ya da mavi yayan fluorophores kullanarak çünkü kılcal döngüler ve Bowman adlı kullanıcının alanı ³ yoğunluk değerleri artan değişkenlik GSC yıllarda b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07