ال<em&gt; الليمونية rodentium</em&gt; نموذج الفأر: دراسة العوامل الممرضة والمضيفة المساهمات في التهاب القولون المعدية

Summary

الليمونية rodentium العدوى يوفر نموذجا قيما لدراسة الالتهابات البكتيرية المعوية وكذلك استضافة الاستجابات المناعية والتهاب القولون في الفئران. هذا البروتوكول يحدد قياس سلامة الحاجز، تحميل الممرض والأضرار النسيجية السماح للتوصيف دقيق للمساهمات الممرض والمضيف لالتهاب القولون المعدية الفئران.

Abstract

هذا البروتوكول يحدد الخطوات المطلوبة لإنتاج نموذج قوي من الأمراض المعدية والتهاب القولون، وكذلك الطرق المستخدمة لوصف الليمونية العدوى rodentium في الفئران. C. rodentium هو، سلبية الغرام الفئران محددة الممرض البكتيرية التي ترتبط ارتباطا وثيقا الهامة سريريا الإنسان E. ممرض للأمعاء مسببات الأمراض كولاي E. وenterohemorrhagic القولونية. على الإصابة بفيروس C. rodentium والفئران مناعيا يعانون من فقدان الوزن متواضعة وعابرة والإسهال. تشريحيا، ويلاحظ المعوية سرداب استطالة، تسلل خلية المناعة، والقدح استنفاد الخلايا. ويتحقق إزالة العدوى بعد 3 إلى 4 أسابيع. قياس الأمعاء الظهارية سلامة الحاجز، الحمل البكتيري، والأضرار النسيجية في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة، والسماح للتوصيف سلالات الفئران عرضة للإصابة.

ضراوة آليةS من مسببات الأمراض البكتيرية التي تستعمر الأمعاء من مضيفيهم، وكذلك الردود التي تدافع عن المضيف محددة ضد الالتهابات مثل هذه غير مفهومة تماما. لذا C. نموذج rodentium من العدوى البكتيرية المعوية بمثابة أداة قيمة للمساعدة في فهمنا لهذه العمليات. كما تم البكتيريا المعوية المرتبطة أمراض التهاب الأمعاء (IBDs). فقد تم الافتراض أن الاستجابات الالتهابية المزمنة غير القادرة على التأقلم ينظر في المرضى الذين يعانون IBD تطوير الأفراد عرضة وراثيا في أعقاب التعرض غير طبيعي في نظام المناعة المخاطية المعوية للبكتيريا المعوية. ولذلك، فإن دراسة نماذج من التهاب القولون المعدية يتيح إمكانات كبيرة لتحديد الاستجابات المحتملة المسببة للأمراض المضيفة للبكتيريا المعوية. C. rodentium الناجم عن التهاب القولون هو نموذج واحد نادرة بحيث يسمح لتحليل استجابات المضيف للبكتيريا المعوية، وتعزيز فهمنا للآليات المرضية المحتملة لIBD؛أساسيا في تطوير علاجات وقائية من الرواية والعلاجية.

Introduction

العدوى عن طريق مسببات الأمراض البكتيرية المعوية المعدية المعوية يتسبب (GI) التهاب، وكذلك الأمراض المعوية والفيزيولوجيا المرضية، بما في ذلك الإسهال والأمعاء الظهارية ضعف الجدار. ولا يزال الغموض يكتنف آليات الفوعة من مسببات الأمراض البكتيرية التي استعمار الجهاز الهضمي من مضيفيهم، وكذلك الردود التي تدافع عن المضيف محددة ضد الالتهابات مثل هذه، بدأت التطورات الحديثة في النمذجة ومع ذلك من الالتهابات البكتيرية المعوية لمساعدتنا على فهم هذه العمليات. كما تم البكتيريا المعوية المرتبطة أمراض التهاب الأمعاء (IBDs). مرض كرون في IBDs (CD) وUC هي أمراض معقدة من مرض غير معروف، يتميز التهاب الأمعاء المزمن وتلف الأنسجة. نماذج الماوس العديد من الالتهابات المعوية موجودة، من التهاب عفوية في سلالات معدلة وراثيا، مثل IL10 - / - الفئران، لمواجهة التحديات مع المركبات الكيميائية، مثل كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) ودinitrobenzene حمض السلفونيك (DNBS) ^1. فقد تم الافتراض أن الاستجابات الالتهابية المزمنة غير القادرة على التأقلم موجودة في المرضى IBD تطوير الأفراد في وراثيا عرضة عند التعرض غير طبيعي في نظام المناعة المخاطية المعوية للبكتيريا المعوية ^2، ولذلك دراسة نماذج من التهاب القولون المعدية كما يقدم إمكانية كبيرة لتحديد المضيف المحتمل المسببة للأمراض . الردود على البكتيريا المعوية التي يسببها التهاب القولون rodentium الليمونية هي واحدة من النماذج النادرة من التهاب القولون المعدية التي تميزت جيدا ^1،3، مما يسمح لتحليل استجابات المضيف للبكتيريا المعوية وزيادة فهم الآليات المحتملة من IBD المرضية؛ خطوة أساسية في تطوير علاجات وقائية الرواية والعلاجية.

C. rodentium هو، سلبية الغرام إرفاق الفئران والأضواء (A / E) الممرض محددة البكتيرية التي ترتبط ارتباطا وثيقا البشرية الهامةممرض للأمعاء مسببات الأمراض E. القولونية (EPEC) E. والمعوى كولاي (EHEC) ^3-8. عائلة A مسببات الأمراض / E إرفاق ارتباطا وثيقا غشاء الخلية المضيفة القمي من ظهارة الأعور والقولون، وتشكيل غير الغازية مثل هيكل التمثال على الخلية المضيفة. عن طريق الفم مع التحدي C. rodentium من الكائنات الحية ^{8 9} 10 -10 تنتج نموذجا قويا من التهاب القولون المعدية التي تتميز تضخم القولون أو استطالة للالخبايا، وحيدات النوى تسلل خلية المناعة، والقدح استنفاد الخلايا ^3،4. الموقع الأولي للاستعمار، بعد ساعات قليلة من التحدي، هو في التصحيح الأعور، يليه التقدم إلى القولون البعيدة 2 إلى 3 أيام بعد الإصابة ^3. في سلالات الفئران مناعيا، ويتحقق إزالة مسببات المرض 3 إلى 4 أسابيع بعد الإصابة ^1،3،4. ومع ذلك، العديد من سلالات معدلة وراثيا، أي الجينات ناقصة أو خروج المغلوب وقد وجد الفئران، لعرض increa (- / -)الحوار الاقتصادي الاستراتيجي أكثر عرضة للإصابة مما أدى إلى أضرار مبالغ فيها و / أو عدوى مزمنة والتهاب ^9-14. استخدام هذا النموذج التهاب القولون المعدية في هذه السلالات خروج المغلوب، وكثير تفتقر الفطرية البروتينات مما يشير، وقد تم الكشف عن البروتينات لا غنى عنها في عدة المضيف جزءا لا يتجزأ من القرار العدوى المعوية والالتهابات.

Protocol

1. إعداد اللقاح والليمونية rodentium بالتزقيم عن طريق الفم للفئران

1. إعداد والأوتوكلاف لوريا Bertani مرق (LB).
2. الحصول C. قابلة للحياة rodentium من الأسهم المجمدة والجلسرين متتالية على لوحة LB أجار باستخدام حلقة عقيمة أو تلميح ماصة بتلقيح. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل. تطعيم 3 مل من مرق LB العقيمة في أنبوب الصقر مع ثقافة المستعمرات من لوحة LB باستخدام حلقة بتلقيح أو تلميح ماصة. وينبغي أن يتم إعداد اللقاح باستخدام تقنيات العقيم.
3. احتضان C. ثقافة rodentium هوائيا في 37 درجة مئوية خلال الليل في الحضانة الفوق شاكر في 200 دورة في الدقيقة. ينبغي للمرق LB تلقيح تظهر بعد غائم الثقافة بين عشية وضحاها.
4. يميل استخدام لمبة إبرة بالتزقيم المعدة تعلق على حقنة 1 مل لتسمين كل الماوس مع 100 ميكرولتر من C. بين عشية وضحاها rodentium الثقافة. القفا بلطف الماوس، من خلال استيعاب بشدة الجلد المترهل حول الرقبة والظهرمع الإبهام والأصابع. سحب رأس الحيوان مع السبابة لشل الرأس وتصويب المريء لإدخال الإبرة تسمين.
5. الحفاظ على الماوس في وضع رأسي وتوجيه نصيحة لمبة من الإبرة بالتزقيم على طول الجانب من فمه وأكثر من لغتها. تمرير الإبرة بلطف على طول سقف الفم ودفعها إلى أسفل المريء. إذا كان هناك أي مقاومة شعرت خلال هذا الإجراء، وإزالة الإبرة بالتزقيم وإعادة إدراجها.
6. حقن ببطء 100 ميكرولتر من اللقاح البكتيري وإزالة الإبرة بلطف تسمين. رصد معدل التنفس وسلوك الماوس بعد إعادته إلى قفصه.

ملاحظات:

• في الخطوات 2 و 3، وإعداد أيضا أنبوب الثقافة الصقر باستخدام تقنيات العقيم مع 3 مل من مرق LB العقيمة بين عشية وضحاها ليكون مثقف لضمان عدم وجود التلوث الجرثومي من مرق نفسه. يجب أن تظهر واضحة مرق LB بعد الثقافة بين عشية وضحاها.
برفق تستنهض الهمم الثقافة داخل أنبوب الصقر قبل التحميل الحقن لبالتزقيم بحيث يتم تسليم جرعة متساوية من البكتيريا إلى كل الماوس، في الخطوة 4.
• يجب التخلص من ثقافة بين عشية وضحاها إذا تم تلقيح أكثر من 24 لأنها ساعة.
• جميع C. وينبغي إجراء العدوى rodentium والإسكان في الحيوانات المصابة في منشأة السلامة الأحيائية المستوى 2.

2. قياس نفاذية الجدار القولون الظهارية في C. rodentium الفئران المصابة

1. قياس سلامة الحاجز في نقطة الوقت المطلوب بعد العدوى.
2. في يوم الفحص، وإعداد ما يكفي من ثيوسيانات فلوريسئين 4 كيلو دالتون (FITC)-ديكستران الذائبة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى تركيز 80 مل ^-1 ملغ إلى تسمين كل الماوس مع 150 ميكرولتر وإعداد منحنى القياسية.
3. القفا الماوس وبالتزقيم مع 150 ميكرولتر من FITC-ديكستران. سحب الطعام من القفص في هذا الوقت.
4. تخدير الفئران بعد 4 ساعاتgavaging وجمع أكبر قدر ممكن من الدم (~ 450 ميكرولتر) من خلال ثقب في القلب. إضافة الدم إلى تركيز النهائي من سكر العنب حامض سيترات 3٪ في أنبوب microcentrifuge لردع التخثر. الموت ببطء الفئران وجمع أنسجة القولون في برنامج تلفزيوني لتحديد أعداد البكتيريا (الخطوات 3،1 حتي 3،5) والفورمالين 10٪ في لتثبيت الأنسجة وتلطيخ في نهاية المطاف المناعي (الخطوات 4،1 حتي 4،8).
5. تدور عينات الدم في 1،000 x ج لمدة 12 دقيقة في جهاز للطرد المركزي في C. ° 4 جمع المصل ويخفف إلى 10/1 و 1 100 / في برنامج تلفزيوني. إضافة 100 ميكرولتر من كل عينة في هذه التخفيفات سنتين إلى لوحة 96 بشكل جيد في مكررات.
6. لإعداد منحنى القياسية، تخفيف الأصلي 80 ملغ مل ^-1 FITC-ديكستران تستخدم لتسمين الفئران في برنامج تلفزيوني على التركيزات التالية: 800، 400، 200، 100، 50، 25، 12.5، 6.25، و 0 ميكروغرام / مل . إضافة 100 ميكرولتر من كل تركيز لوحة 96 أيضا في ثلاث نسخ.
7. قياس مضان من كل عينة باستخدام مقياس التألق في لWAV الإثارةelength من 485 نانومتر و 535 نانومتر الطول الموجي الانبعاثات.
8. تحليل البيانات الخام عن طريق التآمر منحنى القياسية. إدخال البيانات الخام لكل عينة في المعادلة من خط إنشاؤها بواسطة منحنى القياسية لتحديد تركيز FITC-ديكستران في كل عينة.

ملاحظات:

• من فصاعدا 4 الخطوة، والحفاظ على عينات الدم على الجليد وتقليل التعرض للضوء.
• عند قياس سلامة طلائي الحاجز نقطة في الوقت، أو قبل، 7 أيام بعد الإصابة هو الأمثل، وشديدة تلف الأنسجة يحدث بعد هذه المرحلة. قياس سلامة الحاجز قبل قوع أضرار جسيمة يسمح لك لتحديد الاختلافات القصوى في النفاذية خلال C. عدوى rodentium بين سلالات الفئران.
• ضمان أن يتم اختبار السيطرة على الفئران غير المصابة أيضا لسلامة حاجز الظهارية.

3. قياس الحمل البكتيري في أنسجة C. rodentium الفئران المصابة

1. إضافة 1 مل العقيمة PBS علىالثانية أدنى من المعادن تعقيمها حبة إلى الدور 2 مل أنبوب الطرد المركزي باستخدام تقنية العقيم. سيتم وضع الأنسجة الفردية التي تم جمعها من كل حيوان في أنابيب PBS منفصلة. وزن الأنابيب قبل إضافة الأنسجة.
2. إزالة الأعور والقولون من الماوس. فصل من الأعور والقولون وطرد محتويات اللمعية باستخدام ملقط. إضافة إلى محتويات أنبوب PBS. بعد فصل الأقسام 0.5 سم من القولون الأعور عن القاصي وتثبيت الفورمالين 10٪، وخفض فتح القولون الأعور المتبقية وطوليا ويغسل مع PBS معقمة قبل وضعها في أنابيب الأنسجة.
3. وزن الأنابيب PBS مع الأنسجة ومن ثم التجانس العينات باستخدام الخافق حبة لمدة 6 دقائق عند 30 هرتز.
4. باستخدام تقنيات العقيم، اضافة 180 ميكرولتر PBS معقمة لكل بئر لوحة 96 أيضا. إضافة 20 ميكرولتر من كل عينة متجانسة إلى البئر الأولى في كل صف. تخلط جيدا وتخفيف متسلسل، مضيفا 20 ميكرولتر من كل جانب السابقة للحصول على التخفيفات من 10 ^-1 (أولا نحنليرة لبنانية) ل10 ^-6. لوحة 10 ميكرولتر من كل عينة من كل تخفيف من ثلاث نسخ على لوحة أسفل LB مربع مع شبكة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
5. عد الوحدات مستعمرة تشكيل (CFU)، ثم التهم متوسط ​​3، وسجل في التخفيف الذي كان يحسب كل عينة. مضاعفة متوسط ​​CFU بنسبة 50، كما تم استخدام 20 ميكرولتر من العينة الأصلية 1 مل، وعامل التخفيف الذي كان يحسب العينة مما أدى إلى CFU / مل. وأخيرا، القسمة على وزن الأنسجة لتحديد CFU / ز.

4. تقييم النسيجية وتلوين المناعي للأنسجة المصابة القولون

1. جمع الأنسجة كما في الخطوة 3.2. بين عشية وضحاها في الأنسجة متجر الفورمالين، ثم تغسل مع الايثانول 70٪. تضمين الأنسجة في البارافين وقطع 5 أقسام ميكرومتر لتلطيخ. وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين لتقييم النسيجية، والشروع في الخطوات التالية لتلطيخ المناعي.
2. لdeparaffinize الأنسجة قبل تلطيخ، مكان الشرائح فيجرة تلطيخ coplin وضعها في حمام مائي 65 ° C لمدة 10 دقيقة. المقبل، والشرائح مكان في الزيلين لمدة أربعة يغسل من 2 دقيقة لكل منهما. وينبغي بعد ذلك أن الشرائح ميهت مع يغسل 5 دقائق بالسيارة اثنين في الإيثانول بنسبة 100٪، تليها واحدة 5 دقائق يغسل في كل مما يلي: الإيثانول 95٪، والإيثانول 75٪ _و2 0 درهم. وينبغي أن يتم في هذه يغسل غطاء الدخان لتجنب التعرض لأبخرة ضارة.
3. الشرائح مكان في جرة مع coplin قبل تحسنت الصوديوم سترات عازلة ومن ثم إلى مكان باخرة لمدة 30 دقيقة، ثم ترك الجلوس لمدة 30 دقيقة. هذه العملية يكسر البروتين عبر وصلات التثبيت الفورمالين التي شكلتها استرداد مواقع مستضدي المحتملة.
4. يغسل مع أزيد PBS لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات. الشرائح الجافة ومنطقة في جميع أنحاء الأنسجة علامة بالقلم PAP لخلق حاجز مسعور، والحفاظ على الكواشف تلطيخ مترجمة على الأنسجة.
5. كتلة الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع العازلة حظر (مثل α-الماعز المصل) في غرفة الرطوبة المناعية.
6. تمييع متزمتARY الأجسام المضادة لتركيز المطلوب باستخدام الأجسام المضادة العازلة التخفيف. صب قبالة حجب العازلة وإضافة 50-100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى الأنسجة. احتضان عند 4 ° C أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
7. يغسل مع أزيد PBS لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات. إضافة 50-100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية مخففة في التخفيف العازلة الأجسام المضادة إلى الأنسجة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام. يغسل مع DH ₂ O لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات.
8. يذوى الشرائح، إضافة دابي إطالة المتوسطة الذهب المتزايدة وتطبيق ساترة. عرض الشرائح تحت المجهر مضان.

ملاحظات:

• يمكن أن تكون بديلا PBS أزيد مع PBS الطازجة كبديل لتجنب نمو البكتيريا في غسل المتوسطة من 4 الخطوة فصاعدا.

النتائج

خلال التجربة العدوى القياسية، يصاب ما يقرب من الفئران مع 2.5 × ⁸ 10 CFU من خلال أنبوب تغذية في C. 100 ميكرولتر بين عشية وضحاها rodentium الثقافة. إصابة الفئران C57BL / 6 مع C. النتائج rodentium في فقدان الوزن متواضعة وعابرة والإسهال. على الرغم من أن نادر الحدوث مع C...

Discussion

الليمونية rodentium العدوى يوفر نموذجا قيما لدراسة كل الأمراض المعدية والتهاب القولون في الفئران. هذا النموذج الفريد يسمح لتوصيف كل من الاستجابات المضيفة، فضلا عن الخصائص المسببة للأمراض من البكتيريا. حدد الخطوات في هذا التفصيل بروتوكول نجاح استخدام هذا النموذج.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف / المواد	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
لوريا مرق	ABM	G247	إضافة 25 غراما من مسحوق LB ل1L من الماء. الأوتوكلاف قبل استخدام.
لوحة أسفل مربع مع شبكة	الصياد	08-757-11A
الصقر الثقافة أنبوب	Sarstedt	62.515.006
يميل لمبة إبرة بالتزقيم المعدة	أدوات العلوم الجميلة	18060-20
1 مل حقنة	BD العلوم البيولوجية	309659
4 كيلو دالتون FITC-ديكستران	سيجما	FD-4
حامض الستريك	سيجما	C7129
سيترات الصوديوم	الصياد	S279-500
سكر العنب	الصياد	D16.1
حمض سترات الدكستروز			20 ملم حمض ctiric، 110 ملم سترات الصوديوم، 5 ملي سكر العنب
96-السوداء جيدا لوحة	الصياد	07-200-762
بكرات معدنية (5 مم)	QIAGEN	69989
الفورمالين 10٪	الصياد	5F93-4
5 مل قارورة	DiaMed	STK3205
الهيماتوكسيلين	الصياد	H345-23
يوزين	الصياد	E511-100
الزيلين	الصياد
توين 20	سيجما	P5927
Coplin جرة تلطيخ	VWR	47751-792
سيترات الصوديوم العازلة			10 ملم سترات الصوديوم، 0.05٪ توين 20، الرقم الهيدروجيني 6،0
حلمة الثدي القلم	Cedarlane	Mu22
مصل الماعز	سيجما	G902-3
ألبومين المصل البقري (BSA)	الصياد	BP1600-100
تريتون X-100	سيجما	T8532
أزيد الصوديوم	سيجما	SZ002
حجب العازلة			2٪ مصل الماعز، BSA 1٪، 0.1٪ تريتون X-100، 0.05٪ توين 20، الصوديوم 0.05٪أزيد، 0.01 M PBS، ودرجة الحموضة 7.2، ومزيج المحل في 4 درجات مئوية.
الأجسام المضادة التخفيف العازلة			0.1٪ تريتون X-100، 0.1٪ BSA، 0.05٪ أزيد الصوديوم، EDTA 0.04٪
حجب العازلة التخفيف العازلة والأجسام المضادة لالنقل البري الدولي			نفس صفات على النحو الوارد أعلاه، ولكن دون إضافة المنظفات (تريتون X-100 وتوين 20)
إطالة الذهب الكاشف Antifade مع دابي	إينفيتروجن	P-36931
Coverslips	الصياد	12.54SE
الفوق الحضانة شاكر	Barnstead مختبر الخط	ماكس Q4000
مقياس التألق	بيركن إلمر	Victor2D
المبردة الطرد المركزي	بيكمان كولتر	Microfuge 22R
سفينة بخارية	بلاك اند ديكر
مضان المجهر	زايس	محوري Image.Z1