O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

Resumo

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.

Resumo

Este protocolo descreve os passos necessários para a produção de um modelo robusto de doença infecciosa e colite, bem como os métodos utilizados para caracterizar Citrobacter rodentium infecção em ratinhos. C. rodentium é uma bactéria gram negativa, patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com a importância clínica humana patógenos enteropatogênica E. coli entero-e E. coli. Após a infecção com C. rodentium, ratos imunocompetentes sofrem de perda de peso modesta e transitória e diarréia. Histologicamente, alongamento cripta intestinal, infiltração de células imunes, e depleção de células caliciformes são observados. Eliminação da infecção é conseguida ao fim de 3 a 4 semanas. Medição da integridade da barreira epitelial intestinal, a carga bacteriana, ou de lesões histológicas em diferentes momentos após a infecção, permitiu a caracterização de estirpes de ratinho susceptíveis à infecção.

O mecanismo de virulências por agentes patogénicos bacterianos, que colonizam o tracto intestinal de hospedeiros, bem como as respostas específicas de acolhimento que defendem contra essas infecções são pouco compreendidos. Por conseguinte, a C. rodentium modelo de infecção bacteriana entérica serve como uma ferramenta valiosa para ajudar a nossa compreensão desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Postula-se que as respostas inflamatórias crónicas adaptativos observados em pacientes com DII desenvolver, em indivíduos geneticamente susceptíveis, após a exposição anormal do sistema imune da mucosa intestinal de bactérias entéricas. Assim, o estudo de modelos de colite infecciosa oferece um potencial significativo para a definição de respostas do hospedeiro potencialmente patogénicos em bactérias entéricas. C. rodentium colite induzida é um tal modelo raro que permite a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas, promovendo a nossa compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD;essencial para o desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos.

Introdução

Infecção por agentes patogénicos bacterianos entéricos desencadeia a inflamação gastrointestinal (GI), bem como a patologia do intestino e fisiopatologia, incluindo a diarreia e disfunção da barreira epitelial intestinal. Os mecanismos de virulência de patógenos bacterianos que colonizam o trato gastrointestinal de seus hospedeiros, bem como respostas de acolhimento específicas que defendem contra essas infecções são mal compreendidos, no entanto avanços recentes na modelagem de infecções bacterianas entéricas começaram a ajudar o nosso entendimento desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Doença de Crohn IBDS (CD) e UC são doenças complexas de etiologia desconhecida, caracterizada pela inflamação intestinal crônica e dano tecidual. Muitos modelos de rato de inflamação intestinal existe, a partir de inflamação espontânea em estirpes geneticamente modificados, tais como a IL-10 - / - de ratos, aos desafios químicos com os compostos, tais como o sulfato de sódio de dextrano (DSS) e dinitrobenzene sulfico (DNBS) ^1. Há a hipótese de que os desajustados respostas inflamatórias crônicas presentes em pacientes com DII desenvolver em indivíduos geneticamente susceptíveis após a exposição anormal do sistema imunológico da mucosa intestinal de bactérias entéricas ^2, portanto, o estudo de modelos de colite infecciosa também oferece um potencial significativo para definir potencialmente patogênica anfitrião . respostas a bactérias entéricas Citrobacter rodentium colite induzida é um dos modelos de colite infecciosa raras que tem sido bem caracterizados ^1,3, permitindo a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas e uma maior compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD, um passo essencial no desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos.

C. rodentium é uma bactéria gram negativa e anexando effacing (A / E), patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com o humano importantepatógenos enteropatogênica E. coli (EPEC) e E. enterohemorrágicas coli (EHEC) ^3-8. A família de agentes patogénicos A / E intimamente anexar à membrana apical da célula hospedeira do epitélio do ceco e do cólon, formação de uma estrutura não-invasivo pedestal semelhante sobre a célula hospedeira. Desafio oral com C. rodentium de 10 ⁸ -10 ⁹ organismos produz um modelo robusto de colite infecciosa caracterizada por hiperplasia do cólon ou alongamento das criptas, infiltração de células mononucleares imunológico e esgotamento das células caliciformes ^3,4. O sítio inicial da colonização, algumas horas após o desafio, é no remendo cecal, seguido de progressão para o cólon distai 2 a 3 dias após a infecção ^3. Em estirpes de murganhos imunocompetentes, a depuração do agente patogénico é alcançado 3 a 4 semanas após a infecção ^1,3,4. No entanto, muitas estirpes geneticamente modificados, ou seja deficiente ou gene knockout (- / -), ratinhos, foram encontrados para exibir aumensed susceptibilidade à infecção, resultando em danos exagerados e / ou infecção crónica e inflamação ^9-14. A utilização deste modelo de colite infecciosa nessas estirpes knockout, muitas proteínas de sinalização deficiente inatas, tem sido indispensável para revelar proteínas hospedeiras várias integrais para a resolução da infecção e inflamação intestinal.

Protocolo

1. Preparação do inoculo e Citrobacter rodentium gavagem oral de ratos

1. Preparar e autoclave caldo Luria Bertani (LB).
2. Obter C. viável rodentium a partir de um estoque de glicerol congelados e raia na placa LB agar usando um loop de inoculação estéril ou pipeta. Incubar a 37 ° C durante a noite. Inocular 3 ml de caldo LB estéril num tubo de cultura com falcon colónias da placa LB usando uma ansa de inoculação ou a ponta da pipeta. Preparação do inoculo deve ser feita utilizando técnicas assépticas.
3. Incubar a C. cultura rodentium aerobicamente a 37 ° C durante a noite num agitador de bancada de incubação a 200 rpm. O caldo LB inoculado deve aparecer turva após cultura durante a noite.
4. Use uma lâmpada de ponta de agulha gavagem gástrica ligada a uma seringa de 1 ml para cada rato gavagem com 100 ul da noite para o dia C. cultura rodentium. Gentilmente scruff o mouse, segurando firmemente a pele solta sobre o seu pescoço e costascom o polegar e os dedos. Puxe a cabeça do animal com o dedo indicador para imobilizar a cabeça e endireitar o esôfago para a inserção da agulha de gavagem.
5. Manter o rato na posição vertical, e dirigir a ponta da agulha de bulbo gavagem ao longo do lado da boca e sobre a língua. Gentilmente passar a agulha ao longo do céu da boca e avançá-lo para o esôfago. Se houver qualquer resistência sentida durante este procedimento, remova a agulha gavagem e insira-o novamente.
6. Lentamente, injectar 100 ul do inóculo bacteriano e retire cuidadosamente a agulha de gavagem. Monitore a taxa de respiração e comportamento do mouse após o retornar à sua gaiola.

Notas:

• Nos passos 2 e 3, também se preparar um tubo de cultura falcon usando técnicas assépticas, com 3 ml de caldo LB estéril a ser cultivadas durante a noite para assegurar que não existe contaminação bacteriana do caldo de si. O caldo LB deve aparecer claro após cultura durante a noite.
• Agitar suavemente a cultura dentro do tubo falcon antes de carregar as seringas para administração por sonda de modo que uma dose igual de bactérias é entregue para cada ratinho, no passo 4.
• Cultura durante a noite deve ser descartado se tiver sido inoculado durante mais 24 hr.
• Todos C. infecções rodentium e habitação de animais infectados devem ser realizadas em um Nível de Biossegurança 2 instalações.

2. Medindo a permeabilidade da barreira epitelial do cólon em C. rodentium infectadas Mice

1. Medir a integridade da barreira num ponto de tempo desejado após a infecção.
2. No dia do ensaio, preparar suficiente 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano dissolvido em tampão fosfato salino (PBS) a uma concentração de 80 mg ml ^-1 de gavagem a cada rato com 150 ul e para preparar a curva padrão.
3. Rato da nuca e gavagem com 150 uL de FITC-dextrano. Retirar os alimentos do compartimento no momento.
4. Anestesiar ratos 4 horas apósgavaging e recolher tanto sangue quanto possível (~ ul 450) através de punção cardíaca. Adicionar o sangue até uma concentração final de 3% de dextrose ácido-citrato em um tubo de microcentrífuga para impedir a coagulação. Eutanásia os ratos e coletar tecidos de cólon em PBS para contagem bacteriana (passos 3,1-3,5) e em formalina a 10% para fixação dos tecidos e, finalmente, imunofluorescência (passos 4,1-4,8).
5. Girar as amostras de sangue a 1000 xg durante 12 min numa centrífuga a 4 ° C. Recolher o soro e dilua para 1/10 e 1/100 em PBS. Adicionar 100 uL de cada amostra a estas duas diluições numa placa de 96 poços em repetições.
6. Para preparar a curva padrão, diluir o original 80 mg ml ^-1 de FITC-dextrano utilizado para gavagem os ratos em PBS com as seguintes concentrações: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 0 ng / ml . Adicionam-se 100 ul de cada concentração de uma placa de 96 cavidades em triplicado.
7. Quantificar a fluorescência de cada amostra, utilizando um fluorímetro de uma excitação wavelength de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 535 nm.
8. Analisar os dados brutos traçando a curva padrão. Introduzir os dados em bruto para cada amostra para a equação da linha gerada pela curva padrão para determinar a concentração de FITC-dextrano em cada amostra.

Notas:

• Para a partir do passo 4, manter as amostras de sangue em gelo e minimizar a exposição à luz.
• Quando se mede a integridade da barreira epitelial um ponto no tempo, ou antes, 7 dias após a infecção é o ideal, como dano tecidual grave ocorre após este ponto. Medindo a integridade da barreira antes da ocorrência danos graves permite determinar diferenças máximas na permeabilidade durante C. infecção rodentium entre linhagens de camundongos.
• Assegure-se que os ratinhos de controlo não infectados, são também testados para a integridade da barreira epitelial.

3. Medição da carga bacteriana em tecidos de C. rodentium infectadas Mice

1. Adicione 1 ml de PBS estéril umand um metal autoclavado talão para um fundo redondo 2 tubo de centrífuga ml, utilizando técnica asséptica. Tecidos obtidas de cada animal serão colocados em tubos separados PBS. Pesar os tubos antes da adição do tecido.
2. Retire o ceco e cólon a partir do mouse. Separa-se o ceco do cólon e empurrar para fora o conteúdo luminal utilizando fórceps. Adicionar o conteúdo para um tubo de PBS. Depois de separar seções 0,5 centímetros do cólon distal e ceco por 10% de fixação de formalina, cortou o restante do cólon e ceco longitudinalmente e lavar com PBS estéril, antes de colocar tecidos em tubos.
3. Pesar os tubos PBS com o tecido e, em seguida homogeneizar as amostras usando um batedor de esferas durante 6 min a 30 Hz.
4. Utilizando técnicas assépticas, adicionar 180 ul de PBS estéril por poço de uma placa de 96 poços. Adicionar 20 ul de cada amostra homogeneizada para o primeiro poço em cada linha. Misturar bem e diluir em série, a adição de 20 ul de cada poço anterior para se obter a partir de diluições de 10 ^-1 (primeira,ll) a 10 ^-6. Placa de 10 ul de cada diluição de cada amostra, em triplicado, numa placa de fundo quadrado LB com uma grelha. Incubar durante a noite a 37 ° C.
5. Contagem de unidades formadoras de colónias (CFU), em seguida, calcular a média dos três contagens, e registar a diluição na qual cada amostra foi contada. Multiplicar CFU médio de 50, a 20 ul da amostra original 1 ml foi usado, e pelo factor de diluição à qual a amostra foi contada, resultando em CFU / ml. Finalmente, dividir pelo peso de tecido para determinar a CFU / g.

4. Avaliação histológica e imunofluorescência de tecidos infectados Colon

1. Recolha de tecidos como descrito no passo 3.2. Tecidos lojas em formol durante a noite, em seguida, lavar com etanol 70%. Incorporar tecidos em parafina e cortadas secções de 5 | iM para a coloração. Mancha com hematoxilina e eosina para avaliação histológica e prossiga para os passos seguintes para técnica de imunofluorescência.
2. Para tecidos deparaffinize antes da coloração, desliza em lugaruma tina de coloração Coplin e colocado em banho de água a 65 ° C durante 10 min. Em seguida, as lâminas em xileno para colocar quatro lavagens de 2 minutos cada. As lâminas devem então ser re-hidratadas com duas lavagens de 5 minutos em etanol a 100%, seguido de uma lavagem de 5 minutos em cada um dos seguintes: etanol a 95%, etanol a 75% e de dH ₂ 0. Estas lavagens devem ser feitas num exaustor de fumos, para evitar a exposição a vapores prejudiciais.
3. Colocar as lâminas na jarra de Coplin com pré-aquecido tampão citrato de sódio e depois coloque em um navio a vapor por 30 minutos, em seguida, deixe descansar por 30 min. Este processo divide a proteína ligações cruzadas formadas por fixação em formalina recuperar os locais antigénicos potenciais.
4. Lavar com PBS azida durante 5 minutos, três vezes. Lâminas secas e em torno da área do ponto de tecido com uma caneta PAP para criar uma barreira hidrofóbica, mantendo os reagentes de coloração localizadas no tecido.
5. Bloco tecido durante 1 hora à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (por exemplo, soro de cabra-α) numa câmara de humidade a imunocoloração.
6. Diluir primary anticorpo para a concentração desejada utilizando tampão de diluição do anticorpo. Verter o tampão de bloqueio e adicionar 50-100 uL de anticorpo primário para os tecidos. Incubar a 4 ° C durante a noite ou à temperatura ambiente durante 2 hr.
7. Lavar com PBS azida durante 5 minutos, três vezes. Adicionar 50-100 uL de anticorpo secundário diluído em tampão de diluição do anticorpo para os tecidos e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora, no escuro. Lavar com dH ₂ O durante 5 minutos, três vezes.
8. Desidratar slides, adicionar DAPI Prolongar meio de Ouro de montagem e uma lamela. Ver lâminas sob um microscópio de fluorescência.

Notas:

• PBS azida pode ser substituído com PBS preparado de fresco como uma alternativa para evitar o crescimento bacteriano no meio de lavagem para a partir do passo 4.

Resultados

Durante uma experiência de infecção padrão, os ratinhos são infectados com cerca de 2,5 x 10 ⁸ UFC, pela via oral de 100 ul durante a noite C. cultura rodentium. Infecção de ratinhos C57BL / 6 com C. rodentium resultados na perda de peso modesta e transitória e diarréia. Embora uma ocorrência rara com C57BL / 6, os animais podem ficar doentes e necessitam de eutanásia. Portanto, os ratinhos devem ser monitorizados para o grau de perda de peso e os sintomas da aflição, t...

Discussão

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de doenças infecciosas tanto em ratos e colite. Este modelo único permite a caracterização de ambas as respostas do hospedeiro, bem como as propriedades patogénicas de bactérias. As etapas descritas neste detalhe o protocolo de uso bem sucedido desse modelo.

Há vários passos críticos neste protocolo para manter em mente quando induzir colite e analisar as respostas. Em primeiro lugar, a prepara?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Luria Broth	ABM	G247	Adicionar 25 g de pó de LB para 1L de água. Autoclave antes de usar.
Placa de fundo quadrado com grade	Pescador	08-757-11A
Tubo de cultura Falcon	Sarstedt	62.515.006
Lâmpada derrubado agulha gavagem	Belas Science Tools	18060-20
1 seringa ml	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-dextrano	Sigma	FD-4
Ácido cítrico	Sigma	C7129
Citrato de sódio	Pescador	S279-500
Dextrose	Pescador	D16.1
Ácido citrato dextrose			20 mM de ácido ctiric, 110 mM de citrato de sódio, 5 mM de dextrose
Placa preta de 96 poços	Pescador	07-200-762
Esferas de metal (5 mm)	Qiagen	69989
10% de formalina	Pescador	5F93-4
Frasco de 5 ml	DiaMed	STK3205
Hematoxilina	Pescador	H345-23
Eosina	Pescador	E511-100
Xileno	Pescador	HC700-1GAL
Tween 20	Sigma	P5927
Coplin tina de coloração	VWR	47751-792
Tampão citrato de sódio			Citrato de sódio 10 mM, Tween 20 0,05%, pH 6,0
Caneta pap	Cedarlane	Mu22
Soro de cabra	Sigma	G902-3
Albumina de Soro Bovino (BSA)	Pescador	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
A azida de sódio	Sigma	SZ002
Tampão de bloqueio			Soro de cabra a 2%, 1% de BSA, 0,1% de triton X-100, Tween 20 0,05% de sódio, 0,05%azida, 0,01 M PBS, pH 7,2, mistura e armazenar a 4 ° C.
De tampão de diluição de anticorpos			0,1% de triton X-100, 0,1% de BSA, azida de sódio a 0,05%, EDTA a 0,04%
De tampão de diluição de anticorpo tampão de bloqueio e de tir			Receitas mesmos que acima, mas sem adição de detergentes (triton X-100 e Tween 20)
Prolongar Reagente Antifade ouro com DAPI	Invitrogen	P-36931
Lamelas	Pescador	12.54SE
Incubação de bancada shaker	Barnstead Laboratório Linha	Max Q4000
Fluorometer	Perkin Elmer	Victor2D
Centrífuga refrigerada	Beckman Coulter	Microcentrífuga 22R
Navio a vapor	Black & Decker
Microscópio de fluorescência	Zeiss	Axio Image.Z1