تقييم الظواهر الاعصاب في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تسلق فحوصات والجامعة المناعية الدماغ

Summary

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي تم وضعها لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على سن الدوبامين (DA) الخلايا العصبية في ذبابة الفاكهة: تسلق / باغت السلبية الناجمة عن انجذاب بالجاذبية الفحص الذي يسمح لدراسة الآثار الفنية من DA الخلايا العصبية انحطاط والمناعية هيدروكسيلاز التيروزين الذي يستخدم لتحديد وإحصاء الخلايا العصبية DA كليا يتصاعد الدماغ.

Abstract

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو كائن نموذجا قيما لدراسة الشيخوخة والعمليات التنكسية المرضية في الجهاز العصبي. وتشمل مزايا الطاير كنظام تجريبي معرفة منشأ الجينية، فترة حياة قصيرة وإمكانية لمراقبة وتحليل كمي السلوكيات المعقدة. التعبير عن جينات مرض مرتبط في السكان العصبية محددة من الدماغ ذبابة الفاكهة، ويمكن استخدامها في تصميم نموذج لأمراض الاعصاب الإنسان مثل الشلل الرعاش والزهايمر ^5.

الدوبامين (DA) الخلايا العصبية هي من بين السكان العصبية الأكثر ضعفا في الدماغ البشري الشيخوخة. في مرض باركنسون (PD)، واضطراب حركة الاعصاب الأكثر شيوعا، وتسارع فقدان الخلايا العصبية DA يؤدي إلى الانخفاض التدريجي الذي لا رجعة فيه في وظيفة الحركي. بالإضافة إلى العمر والتعرض للسموم البيئية، ويتفاقم فقدان الخلايا العصبية DA بواسطة الطفرات محددة في الترميزأو مناطق المروج من عدة جينات. تحديد هذه الأليلات PD المرتبطة يوفر أساس تجريبي لاستخدام ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسة تنكس عصبي من الخلايا العصبية DA في الجسم الحي. على سبيل المثال، التعبير عن الجينات البشرية α-synuclein PD-مرتبط في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية DA يلخص بعض الملامح من الأمراض التي تصيب البشر، مثل الفقدان التدريجي للخلايا العصبية DA وانخفاض وظيفة الحركي ^2. وفقا لذلك، وقد استخدم هذا النموذج بنجاح لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة في PD ^8.

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي عادة استخدمت لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على عمر الخلايا العصبية DA في ذبابة الفاكهة: فحص التسلق على أساس جفل الناجم عن استجابة انجذاب بالجاذبية السلبية والتيروزين المناعية هيدروكسيلاز من الدماغ الكبار كله يتصاعد الى رصد عدد من الخلايا العصبية DA في أعمار مختلفة. في كلتا الحالتين، في التعبير المجراة من UAS رransgenes تحديدا في الخلايا العصبية DA يمكن تحقيقه باستخدام هيدروكسيلاز التيروزين (TH) المروج-GAL4 خط سائق ^{3، 10.}

Introduction

خصوصية المقايسات وصفها هنا تعتمد على استخدام خط الطيران GAL4 الذي يستغل متواليات التنظيمية من الجين هيدروكسيلاز التيروزين لتحقيق التعبير معينة في الخلايا العصبية الدوبامين ^3. هيدروكسيلاز التيروزين يحفز الخطوة الأولى ومعدل منظم للفي تركيب الدوبامين. مناعية TH في الكبار يتراكب الدماغ يطير مع أن الدوبامين، مما يجعل TH مرشح جيد لتحديد الخلايا العصبية DA في الجسم الحي (انظر على سبيل المثال ^6). وعلاوة على ذلك، فإن نمط التعبير عن THGal4 هو أكثر تحديدا من ذلك من GAL4 خطوط أخرى مثل DdcGal4، والذي يحتوي على متواليات التنظيمية من الجين كربوكسيل دوبا ويدفع التعبير المعدلة وراثيا ليس فقط في الخلايا العصبية DA، ولكن أيضا في الخلايا العصبية سيروتونيني المفعول ومجموعات فرعية من الخلايا الدبقية ³ .

Feany وبندر (2000): لاحظ أولا أن التعبير عموم العصبية للإنسان الجين α-synuclein PD-مرتبط يسرع الفقدان التدريجي من ستاrtle التي يسببها السلوك انجذاب بالجاذبية السلبية في ذبابة الفاكهة. وقد لاحظنا نتائج مماثلة باستخدام الخلايا العصبية DA-محددة خط THGal4 لدفع expressionof إلى α-synuclein التحوير ¹⁰ وتستخدم هذه ظيفية للقراءة لدراسة دور اعصاب من مسار Nrf2 في هذا ذبابة الفاكهة نموذجا للPD ^14. ويتم تكييف الفحص المحددة الموصوفة هنا من ² و ^3.

ذبابة الفاكهة الدماغ يحتوي على أكثر من 100 الخلايا العصبية DA، وترتيبها في لا يقل عن 5 مجموعات مختلفة (PPL1، PPL2، PAL، PPM1 / 2، PPM3) التي يمكن تصور كليا يتصاعد الدماغ عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر (انظر على سبيل المثال ¹¹ و ^7). انها لا تزال مثيرة للجدل سواء أو ليس عدد الخلايا العصبية DA في الانخفاض الدماغ ذبابة الفاكهة مع تقدم العمر ^{9 و 11،} ولكن لوحظ تنكس عصبي التي تعتمد على العمر في الذباب حيث تم تحور الجينات PD-مرتبط / بإفراط (overexpressed) لنمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان5. التعبير عن الإنسان α-DA synuclein في الخلايا العصبية لديها مثل هذا التأثير، وبالتالي، قد استخدمت كنموذج لPD. هنا نحن تصف مقايسة لالخلايا العصبية DA الاعتماد في الدماغ كله يتصاعد باستخدام TH كعلامة الخلية. وقد تم تكييف هذا الاختبار في الفترة من ¹³ و ^10.

Protocol

1. باغت بفعل سلبي الفحص انجذاب بالجاذبية

1. حدد الذباب من النمط الجيني المطلوب، بفصلها بين الجنسين، وبشكل عشوائي مجموعة منهم في أفواج من 20-30 الحيوانات والوجه لهم في قوارير غذائية جديدة كل 2-3 أيام؛ اختبار كل مجموعة من الذباب (أي الأفواج في العمر كعينة، واحد الفوج / التركيب الوراثي) على الأقل مرة في الأسبوع.
2. ثلاثين دقيقة قبل الاختبار انجذاب بالجاذبية السلبية، تخدير الذباب مع CO ₂ ووضعها في أنابيب من البلاستيك واضحة قبل صفت أدلى مع اثنين من قارورة فارغة الغذائية (انظر الجدول مواد) انضم في فتحاتها مع الشريط واضحة (أبعاد الغرفة: 19 سم x 2.85 سم). في المقايسات لدينا عادة نحن نستخدم 25 الذباب / أنبوب.
   ملاحظة. يمكن أن تختلف مدة الشفاء من التخدير من بضع دقائق إلى عدة ساعات (على سبيل المثال O / N) وينبغي أن يكون الأمثل للالمورثات محددة اختبارها.
3. بمناسبة ارتفاعات مختلفة (1-20 سم) على قطعة من الورق النشاف والشريط ورقة على السطحية العموديةه، عمودي على مقاعد البدلاء.
4. وضع أنابيب أمام ورقة: يجب أن تكون جميع أنابيب الانحياز وأقرب ما يمكن إلى ورقة للسماح الارتفاع دقيقة.
5. ضع الكاميرا الرقمية (راجع "معدات خاصة" جدول) أمام الأنابيب، على مسافة من 20-30 سم من الورق، وعلى الوقوف (على سبيل المثال مربع طرف ماصة)، حدد "فيلم" الخيار والبدء تسجيل، في هذا الوقت يجب عليك أيضا بدء الموقت لتتبع الوقت بين محاكمات متتالية.
6. السماح للذباب للجمع في الجزء السفلي من الأنبوب من خلال الاستفادة من أنبوب لبضع ثوان (مثلا 10 ثانية). يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة على الدوام (أي نفس المدة، نفس القوة، نفس المشغل) في كافة مراحل التجربة برمتها.
7. حركات الذباب سجل 'مع الكاميرا الرقمية لمدة 10 ثانية.
8. كرر الخطوات من 1،5-1،7 أربعة عشر مرات على فترات مين واحد.
9. تحليل البيانات:
   1. حساب عدد من الذباب التي هي فوق2 سم علامة بعد 10 ثانية عن طريق التفتيش البصري من الأفلام المسجلة.
      ملاحظة: في ظروف مقايسة لدينا فعل السلوك انجذاب بالجاذبية السلبية الذباب 'لا تستمر إلى ما بعد اول 10 ثانية بعد مذهلة (أي التي الذباب تتحرك في كل الاتجاهات 10 ثانية بعد مفاجئة لهم). قفز مسافة لا تقل عن طريق الذباب السيطرة (أي 1 أسبوع الذباب القديمة معربا عن سائق THGal4، انظر أسطورة من الشكل 1) في هذا الإطار الوقت كان 2 سم. وبالتالي، استخدمنا علامة سم 2 كمرجع لتحليل أنشطة التسلق من الذباب من الأعمار والأنماط الجينية 10 ثانية بعد الشروع في سلوك مختلف. قد تتطلب هذه المعايير تعديل لمراعاة الاختلافات في سلوك الذباب اختبار (بسبب مثلا لخلفيات وراثية مختلفة، أو ظروف المختبر). لاحظ أنه في ظروف مقايسة لدينا، كل اختبار الأنماط الجينية أداؤها أسوأ أو على غرار الذباب من النمط الجيني السيطرة.
   2. أخذ متوسط ​​نتائج من خمسة عشرالمحاكمات.
   3. متوسط ​​صريحة كنسبة مئوية من مجموع عدد الذباب في الأنبوب (= نشاط تسلق٪)، وعدد من يكرر (N) وتعطى من قبل عدد من الأفواج المستقلة اختبار لكل الوراثي
   4. تقييم دلالة إحصائية بين الأنماط الجينية المختلفة على مر الزمن. ويمكن تحقيق ذلك مع ر اختبار الطالب (عند المقارنة بين اثنين من المورثات) أو تحليل ANOVA 2 في اتجاه تليها Bonferroni بعد مخصصة اختبار (عند تنفيذ مقارنات متعددة) باستخدام البرمجيات التجارية مثل GraphPad (GraphPad البرامج، Inc.La جولا، CA، الولايات المتحدة الأمريكية).

لاحظ

نحن لدينا أداء جميع المقايسات في نفس الوقت من اليوم، في RT وتحت ظروف الإضاءة نفسها. الحفاظ على الذباب في ساعة الضوء / الظلام بيئة دورة 12 من المستحسن للسيطرة على تأثير إيقاعات الساعة البيولوجية على السلوك الحركي للذباب '.

2. التيروزين المناعي هيدروكسيلازمقايسة من الجبال الدماغ كله

الحلول ومخازن

حل تثبيتي: امتصاص العرق 4٪ (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)

غسل العازلة: 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني

حجب العازلة: 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.15 M كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100 و 0.5٪ BSA

تصاعد وسائل الإعلام: Mowiol-Dabco (انظر بروتوكول الموصوفة في هارلو E، لين دال، والأجسام المضادة-A دليل المختبرات، ومختبرات كولد سبرينغ هاربر الصحافة، كولد سبرينج هاربور، NY، الولايات المتحدة الأمريكية، 10:418 (1988))

إجراء

1. وضع الذباب في طبق تشريح مليئة ETOH 70٪ لمدة 1 دقيقة لإزالة الشمع بشرة.
2. نقل الذباب لطبق تشريح أخرى مليئة الجليد الباردة PBS.
3. تشريح الدماغ:
   1. ضع يطير مع ما يصل الجانب البطني (اختياري: أجنحة إزالة والساقين).
   2. ضبط استخدام واحدة من ملقط ل: سحب الرأس بعيدا عن الجسمالابقاء على الجسم وآخر على التمسك بشرة تحت العين لمنع تلف الدماغ
   3. إزالة خرطوم.
   4. الابقاء على بشرة الرأس على طرفي نقيض من شق ترك الباب مفتوحا بعد إزالة خرطوم وسحب في اتجاهين متعاكسين حتى تتم إزالة الدماغ من الكبسولة الرأس.
   5. إزالة كل بشرة من الدماغ.
   6. إزالة جميع الأنسجة القصبة الهوائية مليئة بالهواء، وهذا سوف يمنع الدماغ من خلال تطفو الخطوات التالية الحضانة.
4. قطع بضعة ملليمترات قبالة الطرف من طرف P-200 ماصة ويوازن ذلك مع 0.1٪ تريتون حل X-100/PBS
5. باستخدام معدة طرف P-200 ماصة، نقل أدمغة إلى 0.5 مل أنبوب إيبندورف مليئة 0.5 مل من 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني والحفاظ على الجليد حتى تشريح كاملة.
6. إصلاح العقول في RT لمدة 20 دقيقة: تطبيق التناوب لطيف عن طريق وضع أنابيب إيبندورف على الرف ووضع رف على nutator.
7. إزالة تثبيتياستخدام P-1000 الصغيرة ماصة، إضافة 0.5 مل من 0.1٪ X-100/PBS تريتون، مزيج من قبل انقلاب والسماح احتضان لمدة 1 دقيقة، كرر هذه الخطوة غسل مرة واحدة.
8. إزالة العازلة من غسل الثاني، إضافة 0.5 مل من 0.1٪ تريتون X-100/PBS والسماح احتضان عند RT لمدة 20 دقيقة؛ كرر هذه الخطوة مرتين.
9. إزالة العازلة غسل أدمغة والسماح للاحتضان في عرقلة العازلة (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.15 M كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100 و 0.5٪ BSA) لمدة 1 ساعة على RT.
10. احتضان العقول مع تخفيف 1:100 من الأجسام المضادة لمكافحة TH (انظر "جدول الكواشف محددة") في عرقلة الحل، لمدة يومين، في 4 درجات مئوية، مع دوران طيف (انظر الخطوة 2.6).
11. تكرار غسل الخطوات 2.7. و2.8 ..
12. تتوازن أدمغة مع تخفيف 1:200 من الثانوية antibodyin عرقلة الحل، لمدة يومين، في 4 درجات مئوية، مع تناوب لطيف.
13. تكرار غسل الخطوات 2.7. و2.8 ..
14. إعداد الشرائح التركيب كما هو موضح في الشكل 2A:
    1. ADD 2 X 25 قطرات ميكرولتر من تصاعد وسائط إلى غطاء زجاجي (24 × 60 مم، لا. 1.5).
    2. مكان كأسين الغطاء (حجم 18 × 18 مم، رقم 2) على تركيب وسائل الاعلام مما يترك فجوة في منتصف الشريحة واسمحوا الجافة.
    ملاحظة. تحقق من صاحب العينة على مرحلة المجهر متحد البؤر الخاصة بك. يمكنك جعل غطاء زجاجي نفس حجم 25 × 75 مم الشريحة عن طريق ربط 22 × 22 مم 1.5 غطاء زجاجي إلى واحدة من نهايات (استخدام طلاء الأظافر، والشريط).
15. إزالة العازلة غسل، إضافة 50 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام والسماح للعقل لكي تتوازن معها من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
16. باستخدام قطع P-200 ماصة (انظر الخطوة 2.4) نقل أدمغة إلى الشريحة في الفضاء بين coverslips على اثنين وغطاء لهم مع ساترة لا. 1.5 (انظر الشكل 2A؛ لتوجيه العقول على الشريحة انظر صفحة ^7).
    ملاحظة: هي التي شنت هذه العينات بين كأسين غطاء للسماح التصور على حد سواء الأمامي ومقر البريد المركزيالجانب rior من الدماغ.
17. ملء الفضاء كله بين النظارات غطاء مع تصاعد وسائل الإعلام؛ ماصة من زاوية واحدة لإزالة كل الهواء؛ اسمحوا الجافة وختم بطلاء الأظافر.
18. لتقييم عدد من الخلايا العصبية الدوبامين في كتلة معينة الحصول على سلسلة من المقاطع البصرية على طول المحور Z مع 1.0 ميكرون خطوة حجم باستخدام المجهر متحد البؤر (لتحديد التشريحية للمجموعات الدوبامين في الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة انظر صفحة ^7).

النتائج

لقد استخدمت المقايسات الموصوفة هنا إلى دراسة دور الإجهاد واقية المسار Nrf2 في نموذج ذبابة الفاكهة من PD ^14. يعتمد هذا النموذج على التعبير عن الإنسان الجين α-synuclein في الخلايا العصبية DA باستخدام TH GAL4 السائق ^{2، 10.}

ويبين

Discussion

المقايسات الموصوفة هنا توفر نهجا مفيدا لدراسة دور الجينات المحددة، مما يشير إلى مسارات أو مركبات صغيرة في صيانة الخلايا العصبية DA في الشيخوخة، وكذلك في مختلف الخلفيات الوراثية المرتبطة بالمرض (استعرضت في ^5).

وباغت التي يسب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)
Materials Table.