Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

Résumé

Nous décrivons ici deux essais qui ont été mis en place pour étudier la neurodégénérescence liée à l'âge des neurones dopaminergiques (DA) dans Drosophila: L'escalade / test de géotaxie négatif sursaut induite qui permet d'étudier les effets fonctionnels de neurones DA dégénérescence et l'immunomarquage de la tyrosine hydroxylase qui est utilisé pour identifier et compter les neurones dopaminergiques dans les montagnes entières du cerveau.

Résumé

Drosophila melanogaster est un organisme modèle précieux pour étudier le vieillissement et les processus pathologiques dégénératives du système nerveux. Les avantages de la mouche comme un système expérimental comprennent sa puissance de sa génétique, courte durée de vie et la possibilité d'observer et d'analyser quantitativement des comportements complexes. L'expression des gènes liés à la maladie dans les populations neuronales spécifiques du cerveau chez la drosophile, peut être utilisé pour modéliser les maladies neurodégénératives humaines telles que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer ^5.

Neurones dopaminergiques (DA) sont parmi les populations les plus vulnérables de neurones dans le cerveau humain vieillissement. Dans la maladie de Parkinson (PD), le trouble le plus fréquent neurodégénératif du mouvement, la perte accélérée des neurones DA entraîne une diminution progressive et irréversible de la fonction locomotrice. Outre l'âge et l'exposition à des toxines environnementales, la perte de neurones DA est exacerbée par des mutations spécifiques dans le codageou régions promotrices de plusieurs gènes. L'identification de ces allèles PD-associés fournit la base expérimentale pour l'utilisation de la drosophile comme modèle pour étudier la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques in vivo. Par exemple, l'expression du gène α-synucléine humaine PD-lié chez la drosophile neurones DA reprend certaines caractéristiques de la maladie chez l'homme, par exemple la perte progressive des neurones dopaminergiques et déclin de la fonction locomotrice ^2. En conséquence, ce modèle a été utilisé avec succès pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans PD ^8.

Nous décrivons ici deux essais qui ont été couramment utilisées pour étudier la neurodégénérescence liée à l'âge des neurones dopaminergiques chez la drosophile: un essai d'escalade basée sur la réponse de géotaxie négatif sursaut induite et immunomarquage de la tyrosine hydroxylase de tout le cerveau adulte monte sur surveiller le nombre de DA neurones à des âges différents. Dans les deux cas, l'expression in vivo du SAMU transgenes spécifiquement dans les neurones dopaminergiques peuvent être obtenus en utilisant une tyrosine hydroxylase (TH) promoteur Gal4 ligne de conducteur ^{3, 10.}

Introduction

La spécificité des essais décrits ici repose sur l'utilisation d'une ligne à mouche Gal4 qui exploite les séquences régulatrices du gène de la tyrosine hydroxylase pour obtenir une expression spécifique dans les neurones dopaminergiques ^3. Tyrosine hydroxylase catalyse la première et étape limitante dans la synthèse de la dopamine. immunoréactivité de TH dans les recouvrements du cerveau des mouches adultes avec celle de la dopamine, rendant TH un bon candidat pour identifier les neurones dopaminergiques in vivo (voir par exemple ^6). En outre, le profil d'expression de THGal4 est plus spécifique que celle des autres Gal4 lignes telles que DdcGal4, qui contient des séquences régulatrices du gène de la dopa décarboxylase et conduit l'expression transgénique non seulement dans les neurones dopaminergiques, mais aussi dans les neurones sérotoninergiques et sous-ensembles de cellules gliales ³ .

Feany et Bender (2000) ont observé que la première expression pan-neuronal du gène α-synucléine humaine PD-lié accélère la perte progressive de la stacomportement de géotaxie négatif rtle induite chez la drosophile. Nous avons observé des résultats similaires en utilisant spécifique de la ligne DA-neurone THGal4 à conduire le ExpressionOf une α-synucléine transgène ¹⁰ et utilisé cette fonction de lecture d'étudier le rôle neuroprotecteur de la voie Nrf2 dans ce Drosophila modèle de PD ^14. Le dosage spécifique décrit ici est adapté de ² et ^3.

Le cerveau Drosophila contient plus de 100 neurones dopaminergiques, disposés dans au moins 5 groupes différents (PPL1, pPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) qui peuvent être visualisées dans les montagnes entières du cerveau par microscopie confocale (voir par exemple ¹¹ et ^7). Il est encore controversée si oui ou non le nombre de neurones dopaminergiques dans le cerveau diminue avec la drosophile âge de ^{9 ans, 11;} toutefois, la neurodégénérescence liée à l'âge est observée chez les mouches où les gènes PD-linked ont été mutés / surexprimé pour modéliser les maladies humaines5. L'expression de l'α-synucléine humaine dans les neurones DA a un tel effet et, par conséquent, a été utilisé comme un modèle pour la maladie de Parkinson. Nous décrivons ici un essai de neurones dopaminergiques dans le cerveau entier comptent monte utilisant TH comme un marqueur de cellule. Ce test a été adapté à partir de ¹³ et ^{10 ans.}

Protocole

1. Sursaut induite Assay géotaxie négative

1. Sélectionnez mouches du génotype désiré, séparez-les par genre, au hasard de les regrouper dans des cohortes de 20-30 animaux et retournez-les dans de nouveaux flacons de nourriture tous les 2-3 jours; essai, chaque groupe de mouches (c. cohortes d'âge comparable, une cohorte / génotype) au moins une fois par semaine.
2. Trente minutes avant le test de géotaxie négatif, anesthésier les mouches avec du CO ₂ et de les placer dans des tubes en plastique transparent pré-étiquetés faites avec deux flacons vides de nourriture (voir le tableau des matériaux) réunis à leurs ouvertures avec du ruban adhésif transparent (dimensions de la chambre: 19 cm x 2,85 cm). Dans nos tests, nous utilisons habituellement 25 mouches / tube.
   Remarque. Le temps de récupération de l'anesthésie peut varier de quelques minutes à plusieurs heures (par exemple O / N) et doit être optimisé pour les génotypes spécifiques testés.
3. Marquer différentes hauteurs (de 1 à 20 cm) sur un morceau de papier buvard et la bande du papier sur une surfac verticale, perpendiculaire à la table.
4. Placer les tubes devant le papier: les tubes doivent être tous alignés et aussi près que possible du papier pour permettre une mesure précise de la hauteur.
5. Placez l'appareil photo numérique (voir l '«équipement spécial» Table) en face des tubes, à une distance de 20-30 cm du papier, sur un support (par exemple, une boîte d'embouts de pipettes), sélectionnez l'option "film" et commencer enregistrement, à ce moment vous devriez également commencer une minuterie pour garder une trace du temps entre essais consécutifs.
6. Laisser les mouches pour recueillir au bas du tube en appuyant sur ​​le tube de quelques secondes (par exemple 10 s). Cette étape doit être effectuée régulièrement (c. même durée, même force, même opérateur) pendant toute l'expérience.
7. Les mouvements du disque vole avec l'appareil photo numérique pendant 10 secondes.
8. Répétez les étapes 1.5-1.7 quatorze fois à intervalles d'une minute.
9. Analyser les données:
   1. Comptez le nombre de mouches qui sont au-dessus de la2 cm marque après 10 secondes par inspection visuelle des vidéos enregistrées.
      Remarque: Dans nos conditions de test de comportement géotaxie négatif des mouches n'a pas duré au-delà des 10 premières secondes après la surprenante (c.-à-mouches commencé à se déplacer dans toutes les directions 10 sec après les effrayer). La distance minimale a augmenté de mouches de contrôle (c. âgé de 1 semaine mouches exprimant le conducteur THGal4, voir la légende de la figure 1) dans ce laps de temps était de 2 cm. Ainsi, nous avons utilisé la marque de 2 cm comme référence pour analyser les activités d'escalade de mouches de différents âges et les génotypes 10 sec après le début du comportement. Ces paramètres peuvent être adaptés de tenir compte des différences dans le comportement des mouches testés (en raison par exemple de différentes origines génétiques ou des conditions de laboratoire). Notez que dans nos conditions de test, tous les génotypes testés effectué pire ou même les mouches du génotype de la commande.
   2. Prendre la moyenne des résultats de la quinzaineessais.
   3. Moyenne express en tant que pourcentage du nombre total de mouches dans le tube (= activité escalade%), le nombre de répétitions (N) est donnée par le nombre de cohortes indépendantes testées pour chaque génotype
   4. Évaluer la signification statistique entre les différents génotypes au fil du temps. Ceci peut être accompli avec le test t de Student (lorsque l'on compare deux génotypes) ou une analyse ANOVA 2-way suivie par Bonferroni test post-hoc (lorsque vous effectuez des comparaisons multiples) en utilisant des logiciels commerciaux tels que GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA).

Remarque

Nous réalisons tous nos tests en même temps de la journée, à la température ambiante et dans les mêmes conditions d'éclairage. Garder les mouches dans un environnement de cycle lumière / obscurité de 12 heures est conseillé de contrôler l'effet des rythmes circadiens sur le comportement locomoteur des mouches.

2. Immunofluorescence de la tyrosine hydroxylaseDosage des Monts du cerveau entier

Solutions et tampons

Solution de fixation: 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS)

Tampon de lavage: 0,1% de Triton X-100 dans du PBS

Le tampon de blocage: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 et de 0,5% de BSA

Milieu de montage: Mowiol-Dabco (voir protocole décrit dans Harlow E, D. Lane, Antibodies-A manuel de laboratoire, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988))

Procédure

1. Mettez mouches dans un plat de dissection rempli avec 70% EtOH pendant environ 1 min pour éliminer la cire cuticule.
2. Transfert vole vers un autre plat de dissection rempli de PBS glacé.
3. Disséquer le cerveau:
   1. Placez la volée avec le haut de la face ventrale (en option: ailes et les pattes supprimer).
   2. Tirez la tête loin du corps: utiliser un ensemble de forceps àtenir sur le corps et un autre pour s'accrocher à la cuticule sous l'oeil pour éviter d'endommager le cerveau
   3. Retirez la trompe.
   4. Tenir à la cuticule de la tête sur des côtés opposés de la fente reste ouvert après avoir enlevé la trompe et tirer dans des directions opposées jusqu'à ce que le cerveau est prélevé à partir de la capsule de la tête.
   5. Retirez tous les cuticule du cerveau.
   6. Retirez tout le tissu trachéal rempli d'air, ce qui permettra d'éviter le cerveau de flotter pendant les étapes d'incubation suivantes.
4. Couper quelques millimètres de la pointe d'une pointe de pipette P-200 et s'équilibrer avec une solution à 0,1% de Triton X-100/PBS
5. Avec la pointe P-200 pipette préparé, transférer le cerveau à un tube Eppendorf 0,5 ml remplie avec 0,5 ml de PFA 4% / PBS et garder sur la glace jusqu'à ce que la dissection est terminée.
6. Fixer les cerveaux à température ambiante pendant 20 min: appliquer une légère rotation en mettant les tubes Eppendorf sur une grille et placer la grille sur un nutator.
7. Retirez le fixateurl'aide d'une micro pipette P-1000, ajoutez 0,5 ml de 0,1% X-100/PBS Triton, mélanger par inversion et laisser incuber pendant 1 min; répéter cette étape de lavage une fois.
8. Retirez le tampon de la deuxième lavage, ajouter 0,5 ml de 0,1% X-100/PBS Triton et laisser incuber à température ambiante pendant 20 min; répéter cette étape deux fois.
9. Retirez le tampon de lavage et de laisser les cerveaux incuber dans un tampon de blocage (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 et de 0,5% de BSA) pendant 1 heure à température ambiante.
10. Incuber les cerveaux avec une dilution 1:100 d'anticorps anti-TH (voir le "Tableau des réactifs spécifiques») dans une solution de blocage, pendant deux jours, à 4 ° C, avec une légère rotation (voir l'étape 2.6.).
11. Répétez les étapes de lavage 2.7. et 2.8 ..
12. Equilibrer les cerveaux avec une dilution de 1:200 d'une solution de blocage antibodyin secondaire, pendant deux jours, à 4 ° C, avec une légère rotation.
13. Répétez les étapes de lavage 2.7. et 2.8 ..
14. Préparer les lames de fixation comme illustré à la figure 2A:
    1. Add 2 x 25 gouttes ul de milieu de montage à un couvercle en verre (24 x 60 mm, no. 1.5).
    2. Placez deux verres de couverture (taille 18 x 18 mm, no. 2) sur le support de montage en laissant un espace au milieu de la diapositive et laisser sécher.
    Remarque. Vérifiez le porte-échantillon sur la scène de votre microscope confocal. Vous pouvez faire le couvercle en verre de la même taille d'un x 75 mm diapositive 25 en attachant un x 1,5 mm couvercle en verre 22 22 à l'une des extrémités (utiliser le vernis à ongles et bande).
15. Retirer le tampon de lavage, ajouter 50 ul de milieu de montage et permettent le cerveau de s'équilibrer avec elle par aspiration et refoulement.
16. En utilisant une coupe P-200 pointe de pipette (voir l'étape 2.4) transférer le cerveau à la diapositive dans l'espace entre les deux lamelles et les couvrir avec une lamelle pas. 1.5 (voir Figure 2A; d'orienter le cerveau sur la diapositive voir ^7).
    Remarque: les échantillons sont montés entre deux verres de couverture pour permettre la visualisation à la fois la partie antérieure et la posterieur latéral du cerveau.
17. Remplir tout l'espace entre les lamelles avec les médias de montage; pipette d'un coin à enlever tout l'air; laisser sécher et le joint avec le vernis à ongles.
18. Pour évaluer le nombre de neurones dopaminergiques dans une grappe spécifique acquérir une série de sections optiques le long de l'axe z avec un 1,0 um étape de taille à l'aide d'un microscope confocal (pour l'identification anatomique des grappes dopaminergique dans le cerveau adulte drosophile voir ^7).

Résultats

Nous avons utilisé les tests décrits ici d'étudier le rôle de la voie Nrf2 protection des contraintes dans un modèle drosophile de PD ^14. Ce modèle repose sur l'expression du gène α-synucléine humaine dans les neurones DA l'aide d'un TH Gal4 conducteur ^{2, 10.}

La figure 1 montre un résultat représentatif d'un sursaut géotaxie négatifs induits (escalade) analyse dans les mouches mâles exprimant différents transg...

Discussion

Les tests décrits ici de fournir une approche utile pour étudier le rôle des gènes spécifiques, les voies de signalisation ou de petits composés dans l'entretien des neurones dopaminergiques dans le vieillissement ainsi que dans différents fonds génétiques de maladies liées (revue en ^5).

Le comportement de géotaxie négatif sursaut induite de la drosophile a été largement utilisé comme fonctionnel lecture de toutes les fonctionnalités de neurones dopami...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)
Materials Table.