الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Summary

مع صغر الجسم التشريح العصبي شفافة موثقة جيدا، ومجموعة من التقنيات الجينية قابلة والكواشف، C. ايليجانس يجعل الكائن الحي النموذج المثالي لل في الجسم الحي التصوير باستخدام الخلايا العصبية بسيطة نسبيا، وانخفاض التكلفة التقنيات. نحن هنا وصف واحد التصوير داخل الخلايا العصبية سليمة باستخدام الحيوانات البالغة المشفرة وراثيا مؤشرات الكالسيوم الفلورسنت.

Abstract

والديدان الخيطية دودة C. ايليجانس هو كائن النموذج المثالي لبسيطة نسبيا، والتصوير بتكلفة منخفضة الخلايا العصبية في الجسم الحي. جسمها شفافة صغيرة وبسيطة وجيدة تتسم الجهاز العصبي يسمح بتحديد والتصوير مضان من الخلايا العصبية داخل أي الحيوان سليمة. تقنيات بسيطة الشلل مع تأثير ضئيل على علم وظائف الأعضاء في الحيوان السماح الممتدة الوقت الفاصل بين التصوير. تطوير fluorophores الكالسيوم وراثيا ترميز حساسة مثل cameleon ¹ و ² تسمح GCaMP في التصوير المجراة من الكالسيوم العصبية تتعلق بكل علم وظائف الأعضاء والخلايا نشاط الخلايا العصبية. سلالات معدلة وراثيا معربا عن العديد من هذه الخلايا العصبية في fluorophores محددة متوفرة أو يمكن بناؤها باستخدام تقنيات راسخة. هنا، نحن تصف الإجراءات التفصيلية لقياس ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا العصبيه واحدة في الجسم الحي باستخدام كل GCaMP وcameleon. نناقش مزايا وdisadvantالأعمار من كلا فضلا عن أساليب مختلفة لإعداد العينات (تجميد الحيوانات) وتحليل الصور. وأخيرا، فإننا نقدم نتائج تجربتين: 1) عن طريق GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية الحسية لمحددة لمجال كهربائي خارجي و 2) عن طريق cameleon لقياس استجابة الكالسيوم الفسيولوجية للخلية عصبية إلى أضرار الليزر الصدمة. وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم مثل هذه على نطاق واسع في C. وقد تم تمديد ايليجانس والقياسات في الحيوانات التحرك بحرية، الخلايا العصبية متعددة في نفس الوقت والمقارنة بين خلفيات وراثية. C. ايليجانس يقدم نظام قوي ومرن لفي الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية مع أنظمة المزايا على نموذج آخر من البساطة الفنية والتكلفة.

Introduction

هنا نقدم طرق عملية لفي الجسم الحي التصوير الكالسيوم في C. الخلايا العصبية ايليجانس. تطوير fluorophores الكالسيوم الحساسة للترميز وراثيا مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية يجعل C. ايليجانس نظام بسيط نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لقياس الفسيولوجيا العصبية والنشاط. ويتم التصوير لدينا مع المجهر المركب باستخدام معيار واسع المجال من التصوير مضان fluorophores المتاحة عموما. نقدم العديد من التقنيات المختلفة التي تستخدم fluorophores والاستعدادات عينة مختلفة، ومناقشة نقاط القوة والضعف لكل منها. وترد البيانات من التجارب ثم المثال الثاني. ويمكن الاطلاع ممتازة من الموارد الإضافية على التقنيات الموضحة هنا في WormBook، "تصوير نشاط الخلايا العصبية والعضلات" من قبل كير R.، ( http://www.wormbook.org ) ^3.

فئتين الرئيسية للجينياويشيع استخدام ترميز أتوماتيكيا للصحفيين الفلورسنت الكالسيوم في C. ايليجانس: واحد GCaMP قناة وcameleon الحنق القائم. سنقوم بشرح أساليب وتظهر أمثلة للبيانات التي تم إنشاؤها بواسطة كل منهما.

ويستند GCaMP على بروتين الفلورية الخضراء تعديل (GFP) التي تعتبر حساسة لتركيز الكالسيوم المحيطة بها. ويتم إنجاز هذا عن طريق مزيج من GFP وتقارب الكالسيوم عالية البروتين كالمودولين، على ان يكون ملزما من الكالسيوم عن طريق كالمودولين يرتفع جزيء GFP في تأكيد على كفاءة الفلورسنت ^2. التطورات الأخيرة في هذه fluorophores توليد إشارة استثنائية مع زيادة حجم ما يصل الى 500٪ في كثافة مضان على نطاق والفسيولوجية للمستويات الكالسيوم وحركية بسرعة معقولة من 95 مللي ثانية ~ الوقت وارتفاع ~ تسوس ميللي ثانية 650 مرة ^4. على مدى فترات زمنية قصيرة نسبيا (دقائق)، يمكن لهذه الإشارات كبيرة تسمح للتصوير دقة أقل (أقل التكبير)، ونظرا لحسن تصرف الحرف الأولالاتحاد العالمي للتعليم قياس خط الأساس، ينفي ضرورة أساسية متصلة أو قياسات نسبية.

Cameleon له ميزة كونه fluorophore الحنق على أساس أن يولد قياس ratiometric المقارنة بين اثنين من قنوات مستقلة أو موجات ^1. وهي تتألف من اثنين fluorophores منفصلة (البروتينات الفلورية سماوي والصفراء التي ينبعث منها، وYFP CFP) ويربطها به كالمودولين بروتين. يضيء مجمع مع الضوء الأزرق (440 نانومتر) التي يثير CFP. ملزمة من الكالسيوم يرتفع fluorophores أقرب معا، وزيادة نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) من CFP (المانحة) إلى YFP (متقبل) والتسبب في انبعاث CFP (480 نانومتر) لتقليل الانبعاثات وYFP (535 نانومتر) لزيادة . يتم قياس مستويات الكالسيوم النسبية بأنه نسبة كثافة YFP / CFP. حركية Cameleon تكون أبطأ من تلك التي GCaMP، وتقاس في الجسم الحي لقضاء وقت صعود ثانية 1 ~ وزمن اضمحلال 3 ~ ⁵ ثوانى. ومع ذلك،نسبة إشارات تتحرك معاكس يزيد من حجم إشارة ويعوض عن عدد من القطع الأثرية ممكن نظرا للتغيرات في حركة fluorophore، أو الانجراف التركيز التركيز والتبييض.

للصحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا ينفي الكثير من إعداد العينات المطلوبة مع تحقيقات تدار خارجيا وC. ايليجانس الجسم شفاف يسمح التصوير داخل صغيرة الحيوان سليمة باستخدام بسيطة مضان حقل واسع. التحدي الرئيسي في إعداد العينات التقنية لذلك لشل حركة الحيوانات بأمان. هناك عدد من التقنيات المختلفة المستخدمة لكل منها مزايا وعيوب. استخدام وكيل الدوائية على شل الحيوانات من السهل لتنفيذ ويسمح للتصاعد من الحيوانات متعددة على واحد إعداد (الليفاميزول، ناهض الكولينية التي تسبب الأنسجة العضلية للاستيلاء وعادة ما تستخدم ^6). C. ويمكن أيضا أن يجمد ايليجانس الجسدي من قبل متزايدة منهمعلى تصلب الاغاروز 10٪ ^{7 و 8.} يقلل هذا التأثير على علم وظائف الأعضاء الحيوانية، ويسمح على المدى الطويل التصوير (ساعة) والانتعاش من الحيوانات متعددة ولكن هو أكثر صعوبة من الناحية الفنية. كل من هذه التقنيات تقييد الوصول الفعلي إلى الحيوانات (التي هي تحت الغطاء زلة) وبالتالي يمكن أن تستخدم إلا مع المحفزات التجريبية معينة (مثل الضوء، حقل، ودرجة الحرارة الكهربائية أو تلف ليزر). لالمحفزات التي تتطلب الوصول المادي، مثل اللمس أو إدارة المواد الكيميائية، والعديد من الدراسات لصقها بنجاح C. ايليجانس في مكان (باستخدام الغراء البيطرية الصف) ^9. هذا هو أكثر تحديا من الناحية الفنية، هو إعداد حيوان واحد، ولا تسمح الانتعاش الحيوان. وأخيرا، فقد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك العديدة التي تقيد جسديا C. ايليجانس، يمكن الحفاظ على فسيولوجيا الحيوان، مما يسمح التعرض لمعظم أنواع المنبهات (اعتمادا على تصميم الجهاز) وتمكين التبادل السريع والتعافي من الحيوانات ^{10 و 11. لكن على microfluidics تتطلب مهارات فنية وقدرات إضافية في تصنيع وتصميم وتنفيذ. يمكن في النشاط والتحفيز يجمد الحيوانات عموما يمكن قياس استجابة في الحسية وinterneurons. نشاط الخلايا العصبية الحركية يتطلب تقنيات أكثر تطورا لتصوير الحيوانات في الحركة. هنا سنقدم طرق مفصلة توظيف الطريقتين الأكثر مباشرة من paralyzation الدوائية والشلل مع الاغاروز شديدة.}

يمكن استخدام الأساليب المعروضة هنا لقياس نشاط الخلايا العصبية وعلم وظائف الأعضاء في الخلية C. ايليجانس. نعطي مثالا على كل منها: استخدام GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية الحسية من ASJ إلى حقل كهربائي خارجي، واستخدام cameleon لقياس استجابة الكالسيوم الفسيولوجية للضرر الليزر من الخلايا العصبية. هذه الأمثلة تبين مزايا وعيوب هذين النوعين من fluorophores وتوضيح ما هو ممكن مع النظام.

Protocol

1. إعداد البصرية

1. استخدام المجهر المركب القياسية مع قدرات التصوير epifluorescence. نستخدم الكسوف نيكون تي U مقلوب المجهر مع اضاءة HG Intensilight.
2. للحصول على أفضل صورة وجودة الإشارة استخدام تضخم عالية، وارتفاع الهدف الفتحة العددية. ونحن عادة استخدام X60 نيكون النفط 1،4 NA الهدف الغمر. في بعض الحالات، من الممكن استخدام أقل التكبير (X40، X20) اعتمادا على مستوى التعبير من fluorophore وقوة الإشارة.
3. استخدام حساسية عالية تبريد الكاميرا CCD، مثل الكاميرا كلارا أندور لتعظيم حساسية الصورة وتقليل الضوضاء الخلفية.
4. لfluorophores لون واحد مضان المجهر استخدام معيار تصفية مجموعة المصممة لطول موجة معينة من fluorophore. لاستخدام GCaMP وضع معيار GFP الأمثل لتصفية الإثارة في 488 نانومتر والانبعاثات عند 525 نانومتر. وهناك حاجة إلى مزيد من التعديلات البصرية.
5. للfluorophores ratiometric، مثل cameleon، استخدام نظام التصوير ثنائي بحيث يمكن مطابقة الصور في وقت واحد القبض على اثنين من موجات منفصلة. ويتم إنجاز هذا من خلال إبراز الصور المزدوجة جنبا إلى جنب على الكاميرا. A الإعداد بسيطة لإنجاز هذا، وذلك باستخدام المكونات البصرية الأساسية على اللوح الصف البصرية، ويتضح في الشكل رقم 1. وتتكون من:
   1. مرشح المجهر تعيين مع 440 ± 20 نانومتر والإثارة تصفية نانومتر 455 تمريرة طويلة مرآة مزدوج اللون.
   2. قناع الصورة وضعت في الطائرة الصورة الأولية على الفور خارج المجهر التصوير الميناء (حيث استشعار CCD كاميرا وعادة الجلوس). هذا يحد من مجال الرؤية من النوع الذي سيملأ فقط نصف مستشعر الكاميرا. وضع هذا القناع في صورة نتائج أول طائرة في حدود صورة حادة والتداخل لا عند المتوقع الصورتين جنبا إلى جنب.
   3. تعيين أول واحد تتابع عدسة البعد البؤري بعيدا عن رانه الأولي الطائرة الصورة بحيث collimates ضوء.
   4. مرآة مزدوج اللون الذي يقسم الضوء إلى أطوال موجية 2 التصوير منفصلة أو القنوات التي تعكس لون واحد (> 515 نانومتر، والأصفر)، في حين يحيل الآخر (<515 نانومتر، سماوي).
   5. مرشحات الانبعاثات (الفرقة تمرير مرشحات) تفرض قيودا إضافية على ضوء أحيلت إلى موجات محددة التصوير (سماوي عند 485 ± 40 نانومتر والأصفر عند 535 ± 30 نانومتر)،
   6. العدسات التتابع الثانية (واحد لكل قناة) وضعت في مسارات شعاع من النوع الذي يعيد تركيز الضوء على طائرة الصورة الثانية في الكاميرا CCD.
   7. ألف زوج من المرايا ومرآة مزدوج اللون 2 يوجه مسارات شعاع بحيث الصورتين معاد ويتوقع جنبا إلى جنب على جهاز الاستشعار CCD الكاميرا. الشكل 4A مثالا على الصورة الناتجة.
6. محاذاة البصرية الأولية: بدء الإعداد والتنسيق للبصريات مع ايماج التباين العاليه استخدام عدسة التكبير المنخفض وتنتقل الإضاءة الخفيفة واسعة المجال (أ sharpie السوداء المسحوبة على شريحة المجهر يعمل بشكل جيد). إحضار صورة من خلال التركيز oculars المجهر وتحولت بعد ذلك إلى ميناء المجهر لاستخدامه. مع إضاءة ضوء ارتفاع عرض الصورة على بطاقة الرقم القياسي في الطائرة التنسيق الأولي (عدة سنتيمترات خارج الميناء المجهر). ضع العدسة التتابع الأول (C) في المسار الحزمة من النوع الذي هو واحد من الطائرة مسافة التنسيق التنسيق الأولي وcollimates ضوء في حين لا تنحرف مسار شعاع (أي مباشرة وتتركز في مسار شعاع). وضع قناع على طائرة الوصل الأولى، تعديل لتقييد نصف مجال الرؤية وإنتاج الحدود حادة في الصورة. وضع المرايا والفلاتر (D، E، G) بحيث يبقى مسار الشعاع موازية لسطح الطاولة ويعمل في مسارين متوازيين جنبا إلى جنب، كما هو مبين في الشكل 1B. مركز العدسات التتابع الثاني (F) في كل مساراتها وشعاعنقلها ذهابا وإيابا على طول مسارات لجلب الصور إلى التركيز على وضع مؤشر بطاقة استشعار CCD كانت الكاميرا سيكون. إذا فعلت بشكل صحيح يجب أن يكون الصورتين مستتب البؤرتين مع oculars المجهر والكاميرا الموانئ الأخرى. وأخيرا وضع الكاميرا في موقف وصقل المحاذاة.
7. غرامة ضبط محاذاة الضوئية: استخدام الصورة المزدوجة عرضها من قبل الكاميرا CCD لضبط المحاذاة الضوئية. استخدام صورة عالية التباين والبدء مع انخفاض التكبير، والتحول إلى تضخم أعلى لمحاذاة النهائي. وضع الصورة المنقولة (سماوي القناة في الشكل 1B) لتغطية نصف مجال الكاميرا وجهة نظر عن طريق تحريك الكاميرا في المركز X Y. وتنعكس صورة (قناة الصفراء في الشكل 1B) لتغطية النصف الآخر من مجال عرض مشاركة عن طريق ضبط اثنين من المرايا (G) في مسار شعاع لها. تحسين التركيز عن طريق تحريك العدسة الثانية لتتابع كل قناة ذهابا وإيابا على طول مسار الشعاع. إذا تركتيجب الإعداد دون تغيير البصرية تكون مستقرة وتتطلب سوى نادرة التكيف تهذيب.

2. تحضير العينة والحصول على البيانات.

1. الحصول على الحيوانات تعبر عن fluorophore الكالسيوم الحساسة في الخلايا العصبية من الاهتمام من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) أو من مصادر أخرى. يمكن بناؤها الحيوانات المعدلة وراثيا بدلا من استخدام معيار C. ايليجانس التقنيات. واحد التعبير الخلية ليس من الضروري (وأحيانا غير مرغوب فيه إذا الخلايا العصبية متعددة للتحقيق، انظر ¹²⁾ ما دامت الصور والقياسات من خلايا متعددة يمكن فصلها بسهولة. إذا لم يتم دمج التحوير fluorophore في الجينوم، ويمكن تفاوت كبير في التعبير تحدث من الحيوان الى الحيوان. في هذه الحالة، preselecting الحيوانات مع ارتفاع مستويات التعبير باستخدام مجهر الفلورسنت تشريح يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويحسن القياسات. مستويات التعبير Fluorophore نيد أن تكون كافية ليمكن تصوير بسهولة مع الكاميرا تحت المعلمات اقتناء المطلوبة من قبل التجربة.
2. جعل منصات الاغاروز اللازمة لتقنية تجميد المطلوب (انظر 2.3 أدناه) عن طريق الضغط على قطرة صغيرة من الاغاروز المنصهر بين الشرائح الزجاج اثنين من مسافات قطعتين من الشريط المختبر. إذا لزم الأمر، يمكن نقل منصات الاغاروز إلى كوب زلة قبل تركيب غطاء الحيوانات. انظر الشكل 2.
3. شل C. ايليجانس للتصوير باستخدام أحد الأساليب التالية:
   1. Paralyzation الدوائية: إضافة الليفاميزول 0.05٪ لمنصات الاغاروز 2٪ (خلطها في الاغاروز المنصهر قبل اتخاذ منصات في 2.2). اختيار الحيوانات 5-10 على منصة وتغطية زلة مع غطاء. تطبيق كميات صغيرة من خليط الشمع الساخن (50٪ شمع البارافين والفازلين 50٪) إلى زوايا الغطاء زلة لأنه عقد في الموقف. 5-10 دقيقة تسمح للالليفاميزول نافذة المفعول والحيوانات لبecome لا تزال تماما.
   2. الاغاروز شديدة الشلل: C. يمكن ايليجانس يجمد جسديا باستخدام منصات قوية 10٪ الاغاروز و 0.05 ميكرون الجسيمات النانوية البوليسترين القطر. جعل 10٪ الاغاروز منصات (10٪ الاغاروز في المخزن المؤقت NGM حسب الوزن) كما في 2.2. إضافة ~ 3 ميكرولتر من حل حبة (1:10 المجهرية البوليسترين في NGM من حيث الحجم) إلى الجزء العلوي من لوحة. بسرعة، واختيار 5-10 C. ايليجانس في بركة من حل حبة على منصة وبلطف مع تغطية زلة غطاء. استخدام الشمع المنصهر تطبيقها على زوايا غطاء زلة لأنه عقد في الموقف. (لمزيد من التفاصيل على هذه التقنية رؤية ^(7)، فضلا عن المادة السابقة إن الرب ⁸⁾
   3. الإلتصاق: C. ويمكن لصقها في مكانها باستخدام ايليجانس كميات صغيرة من مادة لاصقة الصف البيطرية المطبقة على جانب واحد من الحيوانات.
   4. أجهزة ميكروفلويديك: لقد تم تصميم أجهزة ميكروفلويديك عديدة لعقد جسديا C. ايليجانس في مكان التصوير.
4. ضع الشريحة أعد على المجهر والتركيز على الخلايا العصبية المطلوب. غالبا ما يكون من الأسهل العثور على C. ايليجانس باستخدام الإضاءة الساطعة الميدانية وتضخم منخفضة. ثم التحول إلى تضخم عالية والتصوير مضان لإيجاد والتركيز على الخلايا العصبية المحددة.
5. التحفيز: إذا كانت هناك رغبة استجابة الخلايا العصبية لحافزا محددة (الضوء، المجال الكهربائي، والعظة ذوقي حاسة الشم، ودرجة الحرارة وما إلى ذلك)، يجب أن تكون مصممة جهاز التحفيز في الإعداد المجهر، بحيث يمكن أن تدار على الحيوانات في إعداد العينات في حين التصوير.
6. الحصول على الصور باستخدام الكاميرا CCD المجهر. وسوف تعرض مرات والإثارة مستوى الضوء تعتمد على إشارة خط الأساس ومستوى التعبير من fluorophore، مع إشارات أضعف تتطلب أوقات أطول التعرض للقرار متناسق وقت أقل. نستخدم عادة التعرض ميللي ثانية ~ 300 مرة.
7. الحصول على صور إما بشكل فردي أو على شكل منظمة الشفافية الدوليةلي مرور الفيلم. لأن C. الخلايا العصبية عموما ايليجانس عرض ديناميكية التنشيط بطيئة (أي أنها تفتقر إلى الإمكانيات القائمة على العمل الصوديوم)، معدلات الإطار بطيئة نسبيا من ثانية 1 ~ غالبا ما تكون كافية لقياس الخلايا العصبية المحركة. أسعار شراء ما يصل إلى ~ تم استخدام 90 لقطة في الثانية على الرغم من أن هذه قد تكون محدودة في الوقت التكامل اللازمة لمضان ضعيفة. يمكن مشاهدة الأفلام الفردية الخلايا العصبيه واحدة تمتد بسهولة لعدة دقائق (~ 5-10 دقيقة) أو لفترة أطول إذا إعداد تجميد مستقرة ومعدل الإطار بطيئة نسبيا.

3. تحليل البيانات

1. هناك عدد من حزم البرامج المختلفة الفلورسنت التصوير المتاحة مع قدرات التحليل الديناميكي وratiometric بما في ذلك يماغيج وعناصر NIS. نستخدم برنامج MATLAB بسيطة المخصصة التي تقيس إشارة الفلورسنت متوسط ​​فوق منطقة مختارة من الفائدة.
2. للصور الفردية (أو الوقت الفاصل بين الأفلام التي لا تزال قائمةلا تزال تماما) تحديد منطقة ذات الاهتمام (ROI) في الخلايا العصبية المصورة ومنطقة منفصلة في مكان قريب لقياس الخلفية. للصور ratiometric حدد ROI مماثلة والمناطق الخلفية لكل من الصور المزدوجة.
3. حركة طفيفة من الخلايا العصبية المصورة داخل فيلم الوقت الفاصل بين التحليل يتطلب إضافية لتحديد تلقائيا ROI في كل إطار، والتي يمكن إنجازه باستخدام العديد من برامج التتبع الكائن. برنامجنا يعرض صورة مضغوطة من كل الصور في الفيلم الذي تم تحديده يدويا الحدود الخام (التي تشمل وجوه المصالح في جميع الأطر) واختيار منطقة الخلفية مستقلة. الإطار الأول لل، يتم تحديد يدويا ROI من داخل المنطقة الحدودية. لكل إطار لاحقة، كان يختار البرنامج ألمع بكسل من داخل المنطقة الحدودية لإنشاء ROI من الحجم الصحيح (أي نفس عدد بكسل كما ROI الإطار الأول دليل). للصور حيث objecر المصالح هو أكثر إشراقا بما فيه الكفاية ثم الخلفية المحيطة في المنطقة الحدودية هذا البروتوكول يختار ROI معقولة لكل إطار.
4. يتم احتساب إشارة الفلورسنت، F، لكل إطار وحدة بكسل متوسط ​​العائد على الاستثمار في المتوسط ​​ناقص كثافة في المنطقة الخلفية. وتحسب القيم Ratiometric كنسبة من إشارات اثنين (YFP-YFP _{الخلفية)} / (CFP-CFP _{الخلفية)} -0.65. العامل بين 0.65 يعوض عن تنزف من خلال لقناة CFP في القناة YFP، والتي سوف تعتمد على fluorophores فضلا عن مجموعة خاصة تستخدم فلتر (هذه القيمة هي عادة ~ 0.6 من الاجهزة cameleon).
5. يتم حساب مستوى الكالسيوم النسبية لكل إطار والتغيير في المئة في كثافة تطبيع إلى قيمة خط الأساس الأولي تقاس من الإطار الأول (أو سلسلة من إطارات): ΔF / F = (F (ر)-F _س) / _س F، حيث F (ر) هو في مضان ر _س الوقت وFهو القيمة الأساسية الأولية.
6. A ROI اختيار خلايا الجسم يولد أقوى إشارات أقوى ولكن من الممكن أيضا اختيار وقياس الاشارات من ROI على طول العمليات العصبية.

4. حل المشاكل

1. تبيض: التعرض للضوء يمكن أن يسبب الإثارة تبيض من fluorophore ويتميز بانخفاض مطرد في إشارة إلى أن تعتمد على مستويات التعرض. قياسات Ratiometric مساعدة للتعويض عن ذلك. يمكن انتقائية لكن تبييض طول موجي واحد لا تزال تحدث (التبييض عادة أسرع CFP ثم YFP). إذا تبيض يحدث خفض مستوى التعرض للضوء عن طريق الحد من التعرض مرات و / أو شدة الإثارة (مع مرشحات الكثافة محايدة في مسار الإضاءة). إذا لزم الأمر، يمكن للمرء تعويض للتبييض عن طريق تشغيل محاكمات صورية (مع التعرض الإثارة نفسها ولكن لا التحفيز العصبي) وقياس الوقت المستمر للتسوس الإشارة.
2. C. الحيوان لا يزال نسبيا طوال فترة تسجيل: ز> الشلل. ايليجانس الرد على التعرض للضوء والمحفزات التجريبية، مما يجعلها الأكثر عرضة للتنقل في وقت التسجيل. يمكن إدخال حركة طفيفة الضوضاء كبيرة في قياس وخصوصا عندما قياس العمليات من محور عصبي. تحليل Ratiometric يساعد على تخفيف هذه الآثار إلى حد ما والقياسات من خلايا الجسم هي أكثر قوة. والتنفيذ الدقيق وتنقيح الإجراءات تجميد يؤدي إلى الحيوانات لا تزال تماما.
3. اختيار الخلفية: الاختيار الدقيق للمنطقة الخلفية اللازمة لتحليل الصور الناجحة. يجب أن تكون موحدة المناطق الخلفية بشكل معقول وأكثر قتامة ثم الخلايا العصبية المصورة. يجب إزالته بما فيه الكفاية لتجنب الضوء المتناثرة (وبالتالي التقاط إشارة) من الخلايا العصبية المصورة. نجد منطقة موحدة 20-50 ميكرون من ROI يعمل بشكل جيد في معظم الحالات.
4. بصريات Ratiometric: المحاذاة الصحيحة للبصريات التصوير هو أمر حاسم لتوليد صورة واضحة مزدوجة. المرفقات المجهر التجارية للتصوير ratiometric متوفرة. تقنية البديل هو استخدام التصوير السريع متتابعة باستخدام عجلة سريعة للتبديل فلتر بسرعة بين موجات الانبعاثات أثناء تسجيل صور منفصلة لكل منها.
5. تحليل Ratiometric: تحليل الموصوفة هنا هي تقنية بسيطة نسبيا والتي تولد إشارات قوية بحكم المتوسط ​​على مدى ROI. فإنه يتطلب كائن مشرق معترف بها لتحديد العائد على الاستثمار. المزيد من التحليل ratiometric متطورة من الممكن عن طريق مواءمة بدقة ورسم الخرائط على الصور المزدوجة بحيث يمكن حساب نسبة الفلورسنت بكسل بكسل.

النتائج

هنا نقدم نتائج تجربتين منفصلتين. أول توظف GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية لمن الحسية محددة لتحفيز خارجي تعريف، وإعطاء مثال جيد على كيفية استخدام الكالسيوم للصحفيين الفلورسنت لرصد نشاط الخلايا العصبية في بصريا C. سليمة ايليجانس. والثاني يعمل cameleon لقياس ال...

Discussion

وقد تم ترميز مؤشرات الكالسيوم وراثيا المستخدمة على نطاق واسع في C. ايليجانس بيولوجيا الأعصاب. استخدمت هذه التقنيات فئات عديدة لدراسة استجابة الخلايا العصبية الحسية الأولية للمؤثرات الخارجية كما هو موضح هنا مع الاستجابة لASJ مجال كهربائي. ومن الأمثلة البارزة الإ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3'X3' optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B