Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Resumo

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e reagentes, C. elegans Faz um organismo modelo ideal para In vivo Imagem neuronal relativamente simples, usando técnicas de baixo custo. Aqui descrevemos imagem único neurônio dentro de animais adultos intactos usando codificados geneticamente indicadores de cálcio fluorescentes.

Resumo

O verme nemátodo C. elegans é um organismo modelo ideal para imagens relativamente simples, de baixo custo neuronal in vivo. O corpo transparente e simples pequeno, bem caracterizado, sistema nervoso permite a identificação e imagens de fluorescência de qualquer neurónio dentro do animal intacto. Técnicas de imobilização simples, com um impacto mínimo sobre a fisiologia do animal permitir imagens com lapso de tempo prolongado. O desenvolvimento de fluoróforos geneticamente codificados de cálcio sensíveis como cameleon ¹ e ² permitem GCaMP imagem in vivo de cálcio neuronal relacionada a fisiologia celular e da atividade neuronal. Foram identificadas numerosas estirpes transgénicas que expressam estas fluoróforos em neurónios específicos estão prontamente disponíveis ou podem ser construídos usando técnicas bem estabelecidas. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para medir a dinâmica do cálcio dentro de um único neurônio in vivo utilizando tanto GCaMP e cameleon. Discutimos vantagens e disadvantidades de ambos, assim como vários métodos de preparação da amostra (imobilização de animais) e análise de imagem. Por fim, apresentamos os resultados de dois experimentos: 1) utilizando GCaMP para medir a resposta sensorial de um neurônio específico para um campo elétrico externo e 2) Usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio de um neurônio a danos de laser traumático. Técnicas de cálcio de imagem, como estes são usados ​​extensivamente em C. elegans e foram estendidos para medições em animais livremente móveis, neurônios múltiplas simultaneamente e comparação entre fundos genéticos. C. elegans apresenta um sistema robusto e flexível para a imagiologia neuronal in vivo com vantagens sobre outros sistemas de modelos em simplicidade técnica e custos.

Introdução

Aqui apresentamos métodos práticos para em imagens de cálcio vivo em C. neurônios elegans. O desenvolvimento de codificados geneticamente cálcio sensíveis fluoróforos com relação sinal-para-ruído de alto torna C. elegans um sistema relativamente simples e de baixo custo para a medição da neurofisiologia e da atividade. Nossa imagem é feita com um microscópio composto padrão, utilizando de campo amplo imagens de fluorescência de fluoróforos disponíveis correntemente. Nós apresentamos várias técnicas que empregam vários fluoróforos e preparações diferentes de amostra, discutir os pontos fortes e fracos de cada um. Os dados são então apresentados a partir de duas experiências de exemplo. Um excelente recurso adicional sobre as técnicas descritas aqui podem ser encontrados em WormBook, "Imaging a actividade dos neurónios e músculos" por R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

Duas grandes classes de geneticacamente codificados repórteres cálcio fluorescentes são comumente usados ​​em C. elegans: GCaMP único canal e FRET baseada cameleon. Vamos descrever métodos e mostrar exemplos de dados gerados por cada um.

GCaMP baseia-se numa modificação Green Fluorescent Protein (GFP) que é sensível à concentração de cálcio circundante. Isto é realizado através da fusão de GFP e a alta afinidade da proteína de cálcio calmodulina, de tal modo que a ligação do cálcio por calmodulina traz a molécula GFP em uma confirmação eficiente fluorescente ^2. Os avanços recentes no tamanho destes fluoróforos gerar sinal excepcional com aumento até 500% na intensidade de fluorescência ao longo de um intervalo fisiológico dos níveis de cálcio e de cinética razoavelmente rápidos de ~ 95 ms de tempo de subida e o tempo de decaimento ~ 650 mseg ^4. Ao longo de períodos de tempo relativamente curtos (min), estes sinais grandes podem permitir a imagiologia de resolução mais baixa (inferior a ampliação) e, dado um bem comportado o initaferição ial, negar a necessidade de linha de base contínua ou medições comparativas.

Cameleon tem a vantagem de ser um fluoróforo com base em FRET, que gera uma medição raciométrica comparando dois canais independentes ou comprimentos de onda ^1. É constituída por dois fluoróforos separadas (ciano e amarelo emissores de proteínas fluorescentes, PCP e YFP) ligadas por uma proteína calmodulina. O complexo é iluminado com luz azul (440 nm) que excita o PCP. A ligação de cálcio traz os fluoróforos mais juntos, o aumento de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), a partir da PCP (dador) para o YFP (aceitador) e provocando a emissão de PCP (480 nm) para diminuir a emissão e YFP (535 nm) para aumentar . Os níveis de cálcio são medidos em relação como a razão entre a intensidade de YFP / PCP. Cinética Cameleon são mais lentos do que a de GCaMP, medido in vivo para ter um tempo de subida de uma sec ~ e um tempo de decaimento de ~ 3 seg ^5. No entanto,a razão entre os sinais que se deslocam em oposição aumenta o tamanho do sinal e compensa para um certo número de possíveis artefactos devido a alterações na concentração de fluoróforo de movimento, ou o desvio de focagem e de branqueamento.

Codificados geneticamente repórteres fluorescentes anular grande parte da preparação da amostra necessária com sondas exogenamente administrado e C. elegans pequeno corpo transparente permite imagens dentro do animal intacto utilizando fluorescência de campo simples de largura. O principal desafio técnico na preparação da amostra é, portanto, de forma segura para imobilizar os animais. Há um número de diferentes técnicas usadas cada uma com vantagens e desvantagens. Usando um agente farmacológico para paralisar os animais é fácil de implementar e permite que a montagem de vários animais em uma preparação (Levamisole, um agonista colinérgico que provoca o tecido do músculo para aproveitar é tipicamente usado ^6). C. elegans pode também ser fisicamente imobilizado por montá-losna dura de agarose a 10% ^{7, 8.} Isto minimiza o impacto sobre a fisiologia do animal, permite que a longo prazo de imagens (horas) e recuperação de vários animais, mas é mais difícil tecnicamente. Ambas as técnicas de restringir o acesso físico para os animais (que se encontram sob uma lâmina de cobertura) e podem, portanto, ser utilizados apenas com certos estímulos experimentais (tais como a luz, a temperatura do campo eléctrico ou danos no laser). Para estímulos onde o acesso físico é necessário, como o toque ou a administração de produtos químicos, muitos estudos com sucesso colado C. elegans em vigor (usando cola grau veterinária) ^9. Isso é tecnicamente mais desafiador, é uma preparação único animal e não permitir a recuperação dos animais. Por fim, vários dispositivos têm sido utilizados microfluidicos que fisicamente conter C. elegans, preservando a fisiologia animal, permitindo que a exposição à maioria dos tipos de estímulos (dependendo da concepção do dispositivo) e pode permitir a troca rápida e recuperação dos animais ^{10, 11. Porém a microfluídica exigem habilidades técnicas adicionais e capacidades em fabricação, design e implementação. Em imobilizada actividade dos animais e de resposta a estímulos podem ser geralmente medidos em sensorial e interneurónios. Atividade dos neurônios motores requer técnicas mais sofisticadas para geração de imagens de animais em movimento. Aqui iremos apresentar métodos detalhados empregando as duas técnicas mais simples de paralisação e imobilização farmacológica com agarose dura.}

Os métodos aqui apresentados podem ser usados ​​para medir a actividade neuronal e da fisiologia celular em C. elegans. Nós dar um exemplo de cada um: usando GCaMP para medir a resposta do neurônio sensorial ASJ a um campo elétrico externo, e usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio a danos de laser de um neurônio. Estes exemplos demonstram as vantagens e desvantagens dos dois tipos de fluoróforos e ilustram o que é possível com o sistema.

Protocolo

1. Configuração óptica

1. Use um microscópio composto padrão com recursos de imagens de epifluorescência. Nós usamos um microscópio Nikon Eclipse Ti-U invertido com um iluminador HG Intensilight.
2. Para uma melhor imagem e qualidade de sinal usar uma grande ampliação, o objetivo alta abertura numérica. Normalmente usamos uma Nikon X60 1,4 NA objetiva de imersão em óleo. Em alguns casos, é possível a utilização de mais baixa ampliação (X40, X20), dependendo do nível de expressão do fluoróforo e intensidade do sinal.
3. Use uma alta sensibilidade arrefecida CCD da câmara, tal como uma câmera Clara Andor para maximizar a sensibilidade da imagem e minimizar o ruído de fundo.
4. Para fluoróforos de cor única utilização do filtro de fluorescência padrão microscópio ajustado concebido para o comprimento de onda particular do fluoróforo. Para usar um padrão GCaMP GFP filtro definido optimizado para a excitação a 488 nm e emissão a 525 nm. Sem mais modificações ópticas são necessárias.
5. Para raciométrica fluoróforos, tais como cameleon, utilizar um sistema de imagem dupla de tal modo que as imagens podem ser idênticas simultaneamente capturado em dois comprimentos de onda separados. Isto é realizado por projecção das imagens duplas lado a lado na câmara. Uma configuração simples de conseguir isto, utilizando componentes ópticos básicos sobre uma placa de montagem de grau óptico, encontra-se ilustrada na Figura 1. É constituída por:
   1. Um filtro microscópio definido com 440 ± 20 nm filtro de excitação e 455 nm de comprimento passar espelho dicróico.
   2. Uma máscara colocada no plano da imagem inicial imediatamente fora do microscópio de imagem da porta (onde a câmera sensor CCD normalmente sentar). Isto restringe o campo de visão tal que irá preencher apenas metade do sensor da câmara. Colocando a máscara para os resultados de imagem primeiro plano na imagem fronteiras nítidas e sem sobreposição quando as duas imagens são projectadas lado-a-lado.
   3. A lente primeiro relé definir uma distância focal longe de tele plano de imagem inicial de tal forma que colima a luz.
   4. Um espelho dicróico que divide a luz em dois comprimentos de onda de imagem separados ou canais que reflectem uma cor (> 515 nm, amarela), enquanto que o outro transmissor (<515 nm, ciano).
   5. Filtros de emissões (filtros passa-banda) restringindo ainda mais a luz transmitida para os comprimentos de onda específicos de imagem (ciano de 485 ± 40 nm e amarelas em 535 ± 30 nm),
   6. A segunda lentes de retransmissão (uma para cada canal) colocados nos percursos dos feixes esses que reorienta a luz para um plano de imagem segundo a imagem da câmara CCD.
   7. Um par de espelhos e um espelho dicróico segunda dirige os percursos dos feixes de modo que as duas imagens e recombinadas são projectadas lado-a-lado sobre o sensor CCD da câmara. Figura 4A mostra um exemplo da imagem resultante.
6. Alinhamento óptico inicial: Iniciar configuração e alinhamento da óptica com uma imag alto contrastee usando uma lente de ampliação baixa iluminação e da luz transmitida de campo amplo (a preto sharpie desenhada numa lâmina de microscópio funciona bem). Trazer a imagem para focar através das oculares de microscópio e em seguida comutado para a porta de microscópio para ser usado. Com iluminação de luz alta visualizar a imagem em um cartão de índice no plano inicial focal (alguns centímetros fora do porto microscópio). Posicionar a lente do primeiro relê (C) no caminho do feixe de forma que ele é uma distância focal a partir do plano focal inicial e colima a luz, enquanto não desviar o percurso do feixe (isto é, está directamente centrado no caminho do feixe). Coloque a máscara no primeiro plano focal, ajustados para restringir metade do campo de visão e produzir uma fronteira nítida na imagem. Posicionar os espelhos e filtros (D, E, G) de tal forma que o percurso do feixe permanece paralelo à superfície da mesa e é executado em dois caminhos paralelos lado a lado, como mostrado na Figura 1B. Centro das lentes de retransmissão segundo (F) nos seus respectivos percursos dos feixes emovê-los e para trás ao longo dos caminhos para levar as imagens para um foco em um cartão colocado foi o sensor CCD da câmera será. Se feito corretamente as duas imagens deve ser parfocal com as oculares de microscópio e portos outras câmaras. Finalmente coloque a câmera na posição e ajustar o alinhamento.
7. Alinhamento Sintonia fina óptica: Use a imagem dupla visto pela câmera CCD para afinar o alinhamento óptico. Usar uma imagem de alto contraste e iniciar com menor ampliação, a mudança para uma ampliação maior para o alinhamento final. Posicionar a imagem transmitida (ciano canal na Figura 1B), para cobrir uma metade do campo da câmara de vista movendo a câmara na posição X e Y. da imagem reflectida (canal amarelo na Figura 1B), para cobrir a outra metade da área de ver, ajustando os últimos dois espelhos (G), no seu caminho do feixe. Optimizar concentrar movendo a lente segundo relê para cada canal e para trás ao longo do percurso de feixe. Se esquerdoconfiguração do inalterado óptico deve ser estável e só requer ajuste sintonia rara multa.

2. Preparação de amostras e Aquisição de Dados.

1. Adquirir animais que expressam um fluoróforo de cálcio no neurônio sensível de interesse do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) ou de outras fontes. Animais transgénicos Alternativamente pode ser construído usando o padrão C. técnicas elegans. Expressão única célula não é necessária (e por vezes não é desejável se os neurónios são múltiplos a ser investigado, ver ^12), desde que as imagens e as medições de várias células pode ser prontamente separados. Se o transgene fluoróforo não é integrado no genoma, uma variação significativa na expressão pode ocorrer de animal para animal. Neste caso, a pré-selecção de animais com níveis mais elevados de expressão, utilizando um microscópio de dissecação fluorescente aumenta a relação sinal-ruído e melhora as medições. Fluoróforo níveis de expressão need de ser suficiente para ser facilmente visualizado com a câmara sob os parâmetros de aquisição exigidos pela experiência.
2. Fazer as almofadas de agarose necessários para a técnica de imobilização desejado (ver 2.3), pressionando uma pequena gota de agarose fundida entre duas lâminas de vidro espaçadas por dois pedaços de fita de laboratório. Se necessário, as almofadas de agarose podem ser transferidas para uma lamela de vidro antes da montagem dos animais. Veja a Figura 2.
3. Imobilizar C. elegans para imagens utilizando uma das técnicas seguintes:
   1. Paralisação Farmacológica: Adicionar Levamisole 0,05% a almofadas de agarose (2% de mistura-o na agarose fundida, antes de fazer as almofadas em 2.2). Escolha 5-10 animais para a almofada e cobrir com uma lamela. Aplicar pequenas quantidades de mistura de cera quente (cera de parafina a 50% e 50% de vaselina), para os cantos da lâmina de cobertura para mantê-lo em posição. Permitir 5-10 minutos para o Levamisol para ter efeito e os animais para become completamente imóvel.
   2. Imobilização Agarose Stiff: C. elegans pode ser fisicamente imobilizado utilizando almofadas rígidas 10% de agarose e 0,05 uM nanopartículas de poliestireno diâmetro. Fazer almofadas de agarose a 10% (10% de agarose em tampão NGM em peso) como em 2.2. Adicionar ~ ul de solução de esferas 3 (1:10 microesferas de poliestireno em NGM por volume) para a parte superior da almofada. Rapidamente, escolha C. 5-10 elegans na piscina de solução de esferas na almofada e suavemente cubra com uma lamínula. Use cera fundida aplicada aos cantos da lâmina de cobertura para mantê-lo em posição. (Para detalhes adicionais sobre a técnica ver ^7, bem como um artigo JoVE anterior ⁸⁾
   3. Colagem: C. elegans pode ser colada no local usando pequenas quantidades de adesivo de grau veterinária aplicada a um lado do animal.
   4. Dispositivos microfluídicos: Inúmeros dispositivos microfluídicos foram projetados para segurar fisicamente C. elegans no lugar para imagens.
4. Coloque o slide preparado no microscópio e focar no neurônio desejado. É muitas vezes mais fácil de encontrar o C. elegans utilizando iluminação de campo claro e baixa ampliação. Em seguida, mudar para alta ampliação e imagens de fluorescência para encontrar e focar no neurônio específico.
5. Estímulo: Se uma resposta neuronal a um estímulo específico for desejado (campo, luz eléctrica, sinais gustativos e olfactivos, temperatura, etc), o aparelho de estímulo devem ser concebidas para a instalação de microscópio, de tal forma que ele pode ser administrado aos animais no a preparação da amostra, enquanto imagens.
6. Aquisição de imagens utilizando o microscópio câmera CCD. Os tempos de exposição e nível de luz de excitação depende do sinal de referência e o nível de expressão do fluoróforo, com sinais mais fracos que requerem tempos de exposição mais longos com resolução de tempo concordante menos. Normalmente usamos ~ 300 vezes a exposição ms.
7. Adquirir imagens individualmente ou como um time-lapso filme. Porque C. neurônios elegans geralmente exibem dinâmica de ativação lenta (ou seja, eles não têm potencial de sódio base de ação), taxas de quadros relativamente lentos de ~ 1 seg são muitas vezes suficientes para medir neurônio dinâmica. Taxas de aquisição até ~ 90 quadros por segundo têm sido usados, embora estes possam ser limitado pelo tempo necessário para a integração de fluorescência fraca. Os filmes individuais de um único neurónio pode facilmente estender-se por alguns minutos (~ 5-10 min), ou mais se a preparação é estável e imobilização a taxa de quadros relativamente lenta.

3. Análise de Dados

1. Há uma série de diferentes pacotes de imagens fluorescentes de software disponíveis com as capacidades de análise dinâmica e raciométrica incluindo ImageJ e NIS-Elements. Nós usamos um simples costume programa MATLAB, que mede a média do sinal fluorescente sobre uma região de interesse selecionada.
2. Para imagens individuais (ou time-lapse filmes que permanecemperfeitamente imóvel) selecionar uma região de interesse (ROI) dentro do neurônio com imagens e uma região separada próxima para a medição de fundo. Para imagens raciométrica seleccionar ROI semelhante e as regiões de fundo para cada uma das imagens duplas.
3. Ligeiro movimento do neurônio com imagens dentro de um filme de lapso de tempo requer uma análise adicional para selecionar automaticamente o ROI em cada quadro, o que pode ser feito usando esquemas de rastreamento inúmeros objetos. Nosso programa exibe uma imagem compactada de todas as imagens do filme a partir do qual um limite bruto (abrangendo o objeto de interesses em todos os quadros) é manualmente selecionados e uma região de fundo independente selecionada. Para o primeiro quadro, um ROI é manualmente selecionadas dentro da região de fronteira. Para cada quadro subsequente, o programa selecciona os pixels mais brilhantes de dentro da região de fronteira para gerar um ROI de tamanho correcto (isto é, o mesmo número de pixels, como o ROI armação manual do primeiro). Para imagens onde o object de interesses é suficientemente brilhante, então o fundo em torno na região de fronteira este protocolo seleciona um ROI razoável para cada quadro.
4. O sinal de fluorescência, F, de cada quadro é calculado como a média de intensidade de pixel do ROI, menos a intensidade média da região do fundo. Os valores de medida proporcional são calculadas como a razão entre os dois sinais (YFP-YFP _fundo) / (CFP-PCP _fundo) -0,65. O factor de 0,65 compensa purga através do canal para o canal PCP YFP, que será dependente dos fluoróforos, bem como o conjunto de filtros particular usado (este valor é tipicamente ~ 0.6 para configurações cameleon).
5. O nível de cálcio em relação a cada quadro é calculada como a percentagem de alteração na intensidade normalizada para um valor de linha de base inicial medido a partir do primeiro quadro (ou uma série de quadros): Af / F = (F (t)-F _o) / F _o, em que F (t) é a fluorescência no tempo t e _o Fé o valor de referência inicial.
6. A selecção do organismo ROI célula gera os sinais mais fortes mais robustas, mas também é possível seleccionar e medir os sinais a partir de uma ROI ao longo dos processos nervosos.

4. Resolução de Problemas

1. Branqueamento: A exposição a luz de excitação pode causar descoloração do fluoróforo e é marcada por uma diminuição constante no sinal que é dependente do nível de exposição. Medições raciométrica ajudar a compensar esta situação. No entanto seletiva de branqueamento de um comprimento de onda ainda pode ocorrer (normalmente alvejantes PCP mais rápido, então YFP). Se ocorre branqueamento reduzir o nível de exposição à luz, reduzindo o tempo de exposição e / ou de intensidade de excitação (com filtros de densidade neutra na via de iluminação). Se necessário, pode-se compensar de branqueamento, executando testes simulados (com a mesma exposição excitação mas nenhum estímulo neuronal) e quantificando a constante de tempo de decaimento do sinal.
2. : Para a análise de imagens simples descritos aqui, é fundamental que o animal permanece relativamente imóvel durante todo o período de gravação C.. elegans responder à exposição à luz e estímulos experimentais, tornando-os mais susceptíveis de se mover, no momento da gravação. Ligeiro movimento pode introduzir ruído significativo na medição especialmente quando se mede a partir de processos de axônios. Análise raciométrica ajuda a minimizar estes efeitos, em certa medida e de medições a partir do corpo das células são mais robustas. Execução cuidadosa e refinamento dos procedimentos de imobilização irá resultar em animais completamente imóvel.
3. Escolha do Fundo: A seleção cuidadosa de uma região de fundo é necessário para a análise de imagem de sucesso. Regiões fundo deve ser razoavelmente uniforme e mais escura, então o neurônio imagens. Deve ser suficientemente removidos para evitar a luz difusa (e, portanto, um captador de sinal) do neurónio imagens. Nós encontramos uma região uniforme 20-50 uM do ROI funciona bem na maior parte dos casos.
4. Óptica raciométrica: O alinhamento correto da ótica de imagem é fundamental para a geração de uma imagem clara dupla. Anexos microscópio comerciais para imagiologia raciométrica estão disponíveis. Uma técnica alternativa é empregar imagiologia sequencial rápida utilizando uma roda de filtro rápido para rapidamente alternar entre comprimentos de onda de emissão durante a gravação de imagens separadas para cada um.
5. Análise raciométrica: A análise aqui descrito é uma técnica relativamente simples que gera sinais robustos em virtude de uma média de mais de um ROI. Ele requer um objeto reconhecidamente brilhante para selecionar o ROI. Uma análise mais sofisticada raciométrica é possível alinhar com precisão e mapeamento das imagens duplas tais que a razão de fluorescência podem ser calculados pixel a pixel.

Resultados

Aqui apresentamos os resultados de dois experimentos distintos. O primeiro utiliza GCaMP para medir a resposta de um neurónio sensorial específica a um estímulo externo definido, que dá um bom exemplo de como repórteres fluorescentes de cálcio pode ser utilizado para monitorizar a actividade neuronal opticamente em C. intacto elegans. O segundo emprega cameleon para medir a concentração de cálcio intracelular transiente provocado dentro de um neurónio, em resposta ao dano do laser específico...

Discussão

Indicadores de cálcio geneticamente codificados têm sido amplamente utilizados em C. elegans neurobiologia. Numerosos grupos têm utilizado as técnicas para estudar a resposta de neurónios sensoriais primários a estímulos externos, como aqui demonstrado com a resposta ASJ a um campo eléctrico. Exemplos proeminentes incluem sensação de toque mecânico, produtos químicos específicos, temperatura e um campo elétrico ^{12, 16-19.} Actividade de células do músculo interneurônio e também foram...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3'X3' optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B