بناء مجهر عالي الدقة مع التقليدية والتصوير المجسم قدرات ملائمة بصري

Summary

النظام المذكور في هذه الوثيقة توظف فخ البصرية التقليدية فضلا عن خط محاصرة البصرية الثلاثية الأبعاد مستقلة، قادرة على خلق والتلاعب الفخاخ متعددة. وهذا يسمح لإيجاد ترتيبات هندسية معقدة من الجزيئات الانكسار مع السماح أيضا عالية السرعة القياسات في وقت واحد، عالية الدقة لنشاط الإنزيمات البيولوجية.

Abstract

نظم عالية الدقة مع المجهر الفخاخ البصرية تسمح للتلاعب دقيق من الكائنات الانكسار المختلفة، مثل الخرز عازلة ¹ أو العضيات الخلوية ^2،3، فضلا عن ارتفاع المكانية والزمانية قراءات قرار من مركزها النسبي لوسط الفخ. وصف النظام لديه هنا واحد مثل "التقليدية" فخ التشغيل في 980 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك فإنه يوفر نظام محاصرة البصرية الثاني الذي يستخدم حزمة الثلاثية الأبعاد متاحة تجاريا في وقت واحد لخلق والتلاعب أنماط محاصرة المعقدة في مجال الرؤية من المجهر ^4،5 في طول موجة من 1،064 نانومتر. الجمع بين النظامين تسمح للتلاعب من الكائنات الانكسار متعددة في نفس الوقت أثناء القيام في وقت واحد السرعة العالية وقياسات عالية الدقة للحركة والإنتاج في قوة وحجم النانومتر piconewton.

Introduction

محاصرة الضوئية هي واحدة من التقنيات الرئيسية في الفيزياء الحيوية ^6. وثمة تقدم حاسم في محاصرة البصرية تطوير الفخاخ الثلاثية الأبعاد التي تسمح لإنشاء أنماط محاصرة ثلاثي الأبعاد بدلا من الفخاخ نقطة التقليدية ^7. هذه الفخاخ الثلاثية الأبعاد تمتلك ميزة من براعة في تحديد المواقع من الكائنات الانكسار. لكن الفخاخ التقليدية يمكن محاذاة بسهولة إلى أن تكون أكثر متماثل من مجموعات الثلاثية الأبعاد متاحة تجاريا. أنها تسمح أيضا لتتبع دقيق سريع من الكائنات المحاصرين. نحن هنا وصف نظام (الشكل 1) الذي يجمع بين النهجين محاصرة في صك واحد ويسمح للمستخدم لاستغلال فوائد كلا حسب الاقتضاء.

وتناقش الاعتبارات العامة من بناء الفخاخ البصرية (على أساس أشعة الليزر واحدة أو متعددة) بالتفصيل في مكان آخر ^8-10. هنا، ونحن الخطوط العريضة للاعتبارات محددة لدينا لياليetup وتقديم تفاصيل إجراء محاذاة لدينا. على سبيل المثال، وقد وصفت نظم مع اثنين من الحزم الضوئية محاصرة من قبل (على سبيل المثال المرجع ^11)، وعادة ما تستخدم شعاع ليزر واحد لمحاصرة كائن الانكسار واستخدام الأخرى (منخفض عمدا شعاع الطاقة) للقراءات منفصلة من موضع الكائن المحاصرين . لكن هنا، على حد سواء أشعة الليزر تحتاج إلى أن تكون عالية تعمل بالطاقة (300 ميغاواط أو أعلى) لأن كلاهما لاستخدامها في الاصطياد. لقياسات النظم البيولوجية، ينبغي أن أشعة الليزر المستخدمة لمحاصرة تقع على النحو الأمثل ضمن إطار الجرد الوطني محددة من الطول الموجي لتقليل ضوء يسببها تدهور البروتين ^1. هنا اخترنا لاستخدام 980 نانومتر الصمام الثنائي و1،064 نانومتر الليزر DPSS بسبب انخفاض التكلفة، وتوافر عالية وسهولة التشغيل.

لقد اخترنا أيضا إلى استخدام المكانية ضوء المغير (حركة تحرير السودان) لإنشاء والتلاعب الفخاخ متعددة في وقت واحد في الوقت الحقيقي ^4،5. هي هذه الأجهزة المتوفرة تجارياومع ذلك إدماجها في الإعداد الكامل تحديات فريدة من نوعها. نحن هنا وصف نهج عملي الذي يتناول هذه الصعوبات المحتملة ويوفر أداة مرنة للغاية. ونحن نقدم مثالا صريحا لإعداد المحددة الموصوفة والتي يمكن استخدامها كدليل للتصاميم تعديلها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تركيب 980 نانومتر الطول الموجي فخ البصرية واحدة

1. محاصرة البصرية في 980 نانومتر الطول الموجي غالبا ما يكون الأمثل لتجارب الفيزياء الحيوية والثنائيات الليزر رخيصة متوفرة بسهولة مع انتاج الطاقة تصل إلى 300 ميغاواط. فمن الأفضل ليزر ديود أن سرحت مع الاستقطاب والحفاظ على الألياف وضع واحد مع الوضع المعروفة يبلغ قطرها المجال. يحتاج الألياف أن تكون طويلة بما فيه الكفاية ليكون بمثابة فلتر وضع وعادة يتم إنهاء إما مع FC / PC أو موصل FC / APC. من هذه، FC / APC هو الأفضل للحد من عودة انعكاس لعدم الاستقرار ردود فعل ضوء والمحتملين.
2. تأمين الليزر نانومتر 980 الصمام الثنائي في جبل الذي يسمح للسلطة والتحكم في درجة الحرارة. فمن الأفضل لإصلاح جبل إلى جدول البصرية مباشرة إلى تحقيق أقصى قدر من غرق الحرارة سلبية وبالتالي تقليل خطر فشل الصمام الثنائي نتيجة لوجود خلل من تحكم في درجة الحرارة.
3. تركيب موصل الألياف PC / APC إلى البصريات الموازاة شعاع. فمنالحرجة للتأكد من أن شعاع موازى لديهم الحد الأدنى من الاختلاف حتى منافذ الألياف القابلة للتعديل هي الأكثر فائدة. تأكد من أن المنفذ الألياف اختار يطابق قطرها مجال وضع من الألياف ضفيرة الصمام الثنائي. إذا كان الشعاع هو أن rastered باستخدام انحراف صوتية البصرية (AOD) أو انحراف الكهربائية الضوئية (التخلص من الذخائر المتفجرة) ثم يجب أيضا أن يكون موازى ليزر شعاع الخصر أقل قليلا من حجم الفتحة منحرف.
4. تأمين محول الموازاة إلى طاولة الضوئية على مسافة كافية من المجهر للسماح لشعاع التوجيه، والتوسع، ووضع المكونات المطلوبة الأخرى. ضبط ميناء الألياف إلى ضمان اتساق الخصر شعاع لمسافات مماثلة لمسار الشعاع العام إلى المجهر.
5. تثبيت المرايا هو مبين في الشكل 1. إزالة الهدف من المجهر واستخدام المرايا لتوجيه شعاع من خلال الفتحة في المرحلة هدف في تصاعد مستمر. إذا تفضل والتنسيب من المرايا مزدوج اللون DM1 وDM3 يمكن حذفها حتىفي وقت لاحق. DM2 DM3 وكلاهما shortpass ونقل الضوء المرئي بينما تعكس الأشعة تحت الحمراء وفوق القريب.
6. ومن المفيد لتركيب مؤقتا مؤشر ليزر أحمر في مكان الهدف، محاذاة على المحور البصري للمجهر. A محول الميكانيكية العرف هو ضروري لضمان وحدانية للمؤشر ليزر. شعاع مرئية من مؤشر الليزر ثم يمكن توجيه إلى وسط الفتحة من ميناء الألياف ويمكن عندئذ أن تستخدم لتثبيت العدسات (انظر أدناه).
7. تثبيت 980 نانومتر شعاع المتوسع (L8 وL9) على مسافة مناسبة من ميناء الألياف للسماح الإدراج المستقبل من مكونات التوجيه (AOD أو التخلص من الذخائر المتفجرة) حسب الضرورة ^1. شعاع توسعت يجب أن يفيض قليلا الفتحة البؤرية الخلفي من الهدف. (هنا، والعدسات مع أطوال البؤرية من 125 مم و 60 مم في ترتيب كبلر أن يتضاعف تقريبا الخصر شعاع). استخدام مرئية شعاع ليزر مؤشر (انظر القسم 1.6) لضمان السليم موضع العدسة والمحاذاة الخام.
8. تركيبL في 980 نانومتر العدسات توجيه (L2 و L3) في ترتيب التلسكوب كما هو مبين (هنا لديهما 60 مم البعد البؤري) ^1. هي التي شنت L3 في المكورات الطائرة إلى طائرة العودة المحورية لهذا الهدف. جبل L3 على الدقة XYZ مرحلة تحديد المواقع للسماح لتوجيه شعاع. ومن المفيد للمرحلة XYZ لدينا مؤشرات رقمية للميكرومتر، مما يسمح لتحديد المواقع للتكرار وتغيير وضعيتها في الفخ. في "نطاق 0.5 من السفر هو عادة ما تكون كافية، قد السفر إلا أطول لL3 تحديد المواقع على طول المحور البصري تكون مفيدة. استخدم مرئية شعاع ليزر مؤشر (انظر القسم 1.6) لضمان السليم موضع العدسة والمحاذاة الخام.

2. تركيب ليزر للكشف عن

1. تثبيت DM3 مرآة مزدوج اللون فوق المكثف كما هو موضح في الشكل رقم 1. مطلوب عادة جبل العرف. تأمين الصمام الثنائي الصورة رباعية (QPD) أو جهاز الكشف عن حساسية الموقف (PSD) ⁸ إلى جانب الجمعية مكثف وENSلدى عودتهم أن 980 نانومتر شعاع الليزر التي تعكسها DM3 يتم ضربه تقريبا على المركز. عند استخدام QPD، وضمان أن يتم تركيبه على مرحلة XY صغيرة للسماح لتوسيط دقيق من أجهزة الاستشعار على شعاع الليزر.
2. تثبيت L1 (عادة مم عدسة 30) بين DM3 وأجهزة الاستشعار. L1 الموقف وذلك لتركيز شعاع لبقعة واحدة على استشعار.
3. تثبيت مرشح من الدرجة قبل L1 لمنع شعاع نانومتر 1،064 فضلا عن أي الضالة انعكاسات الضوء المرئي من إضاءة المجهر والإضاءة المحيطة.

3. التثبيت من 1،064 نانومتر الطول الموجي التصوير المجسم فخ

1. وقد تم بناء جزء الثلاثية الأبعاد من الإعداد حول الأجهزة / البرمجيات حزمة المتاحة تجاريا ويتم تصنيف المرايا الثلاثية الأبعاد المستخدمة في هذه الحزمة لقوة الحادث أقصى حد 5 أو 10 واط / سم ^2. وضع واحد TEM00 الحزم في هذا النطاق الطاقة يمكن أن يكون مصدرها بسهولة من ليزر DPSS في 1،064 نانومتر الطول الموجي.
2. تركيب ليزر نانومتر 1،064 على ارتفاعمنصة لمطابقة تقريبا ذروة مسار الشعاع للخط 980 (انظر القسم 1).
3. إذا لا يمكن السيطرة عليها مباشرة، قوة الليزر يمكن ضبطها يدويا عن طريق تركيب لوحة موجة نصف (HWP) والمستقطب (PBS) الحق بعد يزر فتحة الإخراج. ومن المفيد لتركيب المستقطب في مرحلة دوارة لتكون قادرة على مواكبة متطلبات الثلاثية الأبعاد مرآة لشعاع الاستقطاب.
4. تثبيت 1،064 نانومتر شعاع المتوسع (L6 L7 و). يجب توسيع وسطه شعاع الليزر لتتناسب مع حجم مائل للمرآة الثلاثية الأبعاد. لنسب التوسع الكبير (فوق 10X) قد يكون مصدر قلق للحفاظ على حجم صغير المتوسع. وبالتالي قد يكون من المستحسن استخدام العدسات مع طول بؤري صغيرة بشكل غير معتاد (هنا: 16 ملم و 175 ملم).
5. تثبيت المرايا الأخرى كما اشارت الى توجيه شعاع نانومتر 1،064 من خلال هذا الهدف.
   1. آمنة DM1 مزدوج اللون (45 درجة زاوية السقوط) في جبل الحركية ووضع التجميع في مسار شعاع نانومتر 980 بحيث يسمح للundiminisheانتقال د من أن شعاع.
   2. تنشيط ضوء مؤشر ليزر. ينبغي أن تعكس المرآة DM1 كمية كافية من الضوء المرئي لوضع صحيح المكانية ضوء المغير (حركة تحرير السودان) في مسار هذا الشعاع. حركة تحرير السودان يحتاج أيضا إلى الزاوية بحيث أشعة الليزر الواردة والصادرة وأقرب ما يمكن إلى حالات عادية. إلا أن زاوية السقوط يجب أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية لضمان أن شعاع الليزر ليست قص بواسطة يتصاعد العدسة والمكونات البصرية الأخرى. وينبغي أن تكون زاوية ° 5 تحقيقه بسهولة وصغيرة بما فيه الكفاية. أخيرا المسافة من DM1 لحركة تحرير السودان يجب أن تقاس بدقة بحيث الإدراج من العدسات L4 L5 و(انظر 3.6 أدناه) يمكن تصريف الطائرة مرآة حركة تحرير السودان والطائرة الخلفي المحورية لهذا الهدف.
   3. تثبيت المرآة لتوجيه الضوء من 1،064 نانومتر المتوسع شعاع لحركة تحرير السودان. تأكد من أن ضوء مؤشر ليزر يضرب فتحة المتوسع شعاع على مركز.
6. تثبيت العدسات L4 L5 و (هنا: العدسات مع 125 ملم و 200 ملم على التوالي). هذا الزوج تلسكوب تقارن الطائرة مرآة حركة تحرير السودان إلى المستوى البؤري الخلفي من الهدف، وكذلك يقلل من الخصر إلى شعاع فقط فعم قليلا الفتحة الخلفي من الهدف. اخترنا العدسات مع الاتصال أطوال طويلة إلى الفضاء حركة تحرير السودان بعيدا عن DM1. هذا يزيل ليس فقط مجالا لخط ليزر ثاني ولكنه يميل أيضا إلى جعل المحاذاة أسهل.
7. إزالة مؤشر ليزر. ترك محول متزايدة لتكون بمثابة الخشنة فتحة المحاذاة.

4. نظام التثبيت ومحاذاة ملاحظات

1. عدسة L3 وحركة تحرير السودان يجب وضعه بحيث تكون مترافق بصريا إلى المستوى البؤري الخلفي من الهدف. النقطة المحورية المشتركة للL4 L5 و هو مترافق بصريا إلى الطائرة عينة إذا تم حقن الحزمة محاصرة البصرية في الفضاء لا نهاية من المجهر.
2. الغناء IR بطاقة عارض محاذاة شعاع نانومتر 980 للذهاب على طول محور وسط الفتحة في محول مؤشر ليزر.
3. استخدام الأشعة تحت الحمراء تي بطاقة* تأكد من أن شعاع نانومتر 1،064 يضرب نفس المكان كما شعاع نانومتر 980 على DM1، L2، و L3 وأن شعاع نانومتر 1،064 يذهب على طول محور وسط الفتحة في محول مؤشر ليزر.
4. استبدال مؤشر ليزر محول المتصاعدة مع هدف. ارتفاع النفط أو المياه الفتحة العددية الهدف هو نموذجي.
5. محاذاة فخ نانومتر 980 كما هو موضح في ⁹ عن طريق "المشي" شعاع الليزر حتى ينظر إلى نمط التدخل متماثل شعاعيا على الكاميرا.
6. مع الثلاثية الأبعاد مرآة قبالة (أي تعمل كمرآة السلبي) استخدام حركة تحرير السودان وDM1 إلى "السير" في undiffracted 1،064 شعاع نانومتر إلى محاذاة فخ نانومتر 1،064.
7. حركة تحرير السودان تنتج شعاع undiffracted كبيرة مما يؤدي في فخ الليزر غير قابلة للنقل قوي في مجال الرؤية. وهذا مفيد للمحاذاة ولكن قد يكون غير مرغوب فيه للتجارب. لمنع هذا الفخ يمكن للمرء أن إدراج كائن غير شفاف صغير في مسار الضوء undiffracted في المكورات الموقع إلى الطائرة عينة (على سبيل المثال اله مركز التنسيق المشترك للL4 L5 و). حجم هذا مانع بقعة المركزية يحتاج إلى أن تكون أكبر إلى حد ما من قطر القرص إيري للضوء مركزة (مانع مع 100-300 ميكرومتر في القطر لنظام وصفه).
8. djust 1،064 نانومتر الاستقطاب شعاع باستخدام المستقطب لتتناسب مع حركة تحرير السودان التوجه. تدوير لوحة نصف موجة لضبط انتاج الطاقة من شعاع كما تريد.
9. إذا رغبت في ذلك، إدراج AOD أو التخلص من الذخائر المتفجرة عناصر توجيه شعاع في خط ليزر 980 نانومتر. ضمان تصريف الافعال الصحيحة من هذه العناصر إلى الطائرة مرة أخرى الوصل للهدف وإعادة تنظيم الفخ. ومن المفيد لتركيب عناصر التوجيه في مرحلة goniometric.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الإعداد تجميعها يسمح للمشغل إلى اعتراض الأجسام الانكسار متعددة في الوقت الحقيقي والموقف منها في جميع الأبعاد الثلاثة داخل مجال الرؤية. نحن لتوضيح قدرات الثلاثية الأبعاد الصك من خلال محاصرة 11 المجهرية (الشكل 2). فخ حصر كل كائن يتم يدويا إعادة وضعه على محاصرة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لقد شيدت صك الذي يجمع بين اثنين من الفخاخ البصرية من أنواع مختلفة (الشكل 1) لتوفير مرافق منفصلة للتلاعب محاصرة الكائن والقياس. بنيت في فخ البصرية "التقليدية" حول 980 نانومتر ليزر الصمام الثنائي. يتم توسيع هذا شعاع، قاد ثم حقنها المجهر لدينا مقلوب ("الضوء...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optical table	Newport corporation	ST-UT2-56-8	Irvine, CA
Microscope, Inverted, Eclipse Ti	Nikon USA	MEA53220	Melville, NY
Plan apo 100X oil objective (1.4 NA)	Nikon USA	MRD01901	Melville, NY
Oil condenser Lens 1.4 NA	Nikon USA	MEL41410	Melville, NY
EMCCD camera	Andor technology USA	Ixon DU897	South Windsor, CT
1/3" CCD IEEE1394 camera	NET USA Inc	Foculus FO124SC	Highland IN
Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength	Klastech Laser Technologies	Senza-1064-1000	Dortmund; Germany
laser diode, TEM00, SLM, 980 nm	Axcel Photonics	BF-979-0300-P5A	Marlborough, MA
laser diode mount	ILX Lightwave	LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984	Bozeman, MT
adjustable fiber ports	Thorlabs	PAF-X-11-B	Newton, NJ
holographic system	Arryx	HOTKIT-ADV-1064	Chicago, IL
holographic mirror	Boulder Non-linear Systems	this is a part of HOTKIT-ADV-1064	Lafayette, CO
Calcite polarizer	Thorlabs	GL10-B	Newton, NJ
half-wave plate	Thorlabs	WPH05M-1064	Newton, NJ
Polarizer rotation mount	Thorlabs	PRM1	Newton, NJ
half-wave plate rotation mount	Thorlabs	RSP1	Newton, NJ
Shutter	Thorlabs	SH05	Newton, NJ
dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI	Chroma Technology	t750spxrxt	Bellows Falls, VT
dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI	Thorlabs	DMSP1000R	Newton, NJ
custom mechanical adapter	Thorlabs	SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore	Newton, NJ
notch filter	Semrock	FF01-850/310-25	Rochester, NY
Acousto-Optic deflector (2-axis)	intraAction	DTD-584CA28	Bellwood, IL
goniometric stage	New Focus	9081	Santa Clara, CA
60 mm steering lenses	Thorlabs	LA1134-B	Newton, NJ
16 mm aspherical expander lens	Thorlabs	AC080-016-C	Newton, NJ
175 mm expander lens	Thorlabs	LA1229-C	Newton, NJ
Spot blocker (cabron-steel sphere)	Bal-Tec	0.0100" diameter	Los Angeles, CA
Microspheres (Carboxyl-polystyrene)	Spherotech	CP-45-10	Lake Forest, IL