Construction d'un microscope à haute résolution avec des capacités de piégeage optique classique et holographique

Résumé

Le système décrit ici utilise un piège optique traditionnel ainsi qu'une ligne de piégeage optique holographique indépendant, capable de créer et de manipuler de multiples pièges. Cela permet la création d'arrangements géométriques complexes de particules réfraction tout en permettant à grande vitesse des mesures simultanées à haute résolution, de l'activité des enzymes biologiques.

Résumé

Systèmes de microscope à haute résolution avec des pièges optiques permettent la manipulation précise d'objets divers de réfraction, tels que des billes diélectriques ¹ ou organites cellulaires ^2,3, ainsi que pour la haute lecture de la résolution spatiale et temporelle de leur position par rapport au centre du piège. Le système décrit ici a un tel "traditionnel" piège fonctionnant à 980 nm. Il fournit en outre un second système de piégeage optique qui utilise un ensemble holographique disponible dans le commerce afin de créer et de manipuler simultanément les modèles de piégeage complexes dans le champ de vision du microscope ^4,5 à une longueur d'onde de 1064 nm. La combinaison des deux systèmes permet la manipulation de plusieurs objets de réfraction en même temps tout en menant simultanément une vitesse élevée et mesures à haute résolution du mouvement et de la production de force au nanomètre et l'échelle de piconewton.

Introduction

Piégeage optique est l'une des techniques clés en biophysique ^6. Un progrès important dans le piégeage optique a été le développement de pièges holographiques qui permettent la création de modèles de piégeage en trois dimensions plutôt que les pièges de points classiques ^7. Ces pièges holographiques possèdent l'avantage de la polyvalence dans le positionnement des objets de réfraction. Cependant pièges classiques peuvent être facilement alignées est plus symétrique que les kits holographiques disponibles dans le commerce. Ils permettent également pour le suivi rapide et précis des objets piégés. Ici, nous décrivons un système (Figure 1) qui combine les deux approches de piégeage dans un seul instrument et permet à l'utilisateur d'exploiter les avantages des deux, selon le cas.

Les considérations générales de la construction de pièges optiques (basé sur des faisceaux laser unique ou multiple) sont discutés en détail ailleurs ^8-10. Ici, nous décrivons les considérations spécifiques à notre sEtup et fournir les détails de notre procédure d'alignement. Par exemple, les systèmes avec deux faisceaux de piégeage optique ont été décrits précédemment (par exemple ref. ^11), typiquement en utilisant un faisceau laser pour piéger un objet de réfraction et à l'aide de l'autre (faisceau de puissance intentionnellement bas) pour la lecture découplé de la position de l'objet piégé . Ici cependant, les deux faisceaux laser doivent être de haute puissance (300 mW ou ultérieure) parce que les deux doivent être utilisés pour le piégeage. Pour les mesures des systèmes biologiques, les lasers utilisés pour le piégeage devraient baisser de façon optimale dans une fenêtre NIR spécifique de longueur d'onde afin de minimiser la dégradation des protéines induite par la lumière ^1. Ici, nous avons choisi d'utiliser 980 diode nm et 1064 nm lasers DPSS en raison de leur faible coût, de haute disponibilité et de facilité d'utilisation.

Nous avons également choisi d'utiliser un modulateur spatial de lumière (SLM) de créer et de manipuler plusieurs pièges simultanément en temps réel ^4,5. Ces dispositifs sont disponibles dans le commercemais leur intégration dans une installation complète présente des défis uniques. Nous décrivons ici une approche pratique qui aborde ces difficultés potentielles et fournit un instrument très polyvalent. Nous donnons un exemple explicite de la configuration spécifique décrite qui peut être utilisé comme un guide pour les dessins modifiés.

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Protocole

1. Installation de 980 nm de longueur d'onde unique piège optique

1. Piégeage optique à 980 nm longueur d'onde est souvent optimal pour des expériences de biophysique et de diodes laser bon marché sont disponibles avec une puissance aussi élevée que 300 mW. Il est préférable pour une diode laser à queue de cochon à maintien de polarisation fibre monomode avec un diamètre de champ de mode connue. La fibre doit être suffisamment long pour agir comme un filtre de mode et est généralement terminée par un navigateur FC / PC ou un connecteur FC / APC. Parmi ceux-ci, FC / APC est préférable de minimiser la rétro-réflexion des instabilités de rétroaction de lumière et de potentiel.
2. Fixer la diode laser à 980 nm dans un support qui permet de puissance et de contrôle de la température. Il est préférable de fixer la monture sur une table optique directement à maximiser la dissipation thermique passive et minimiser ainsi le risque d'échec de la diode en raison d'un dysfonctionnement du régulateur de température.
3. Monter le connecteur de fibre PC / APC à des optiques de collimation du faisceau. Il estessentiel afin d'assurer que le faisceau collimaté de manière encore divergence minimale ports fibre réglables sont plus utiles. Assurez-vous que le port de fibre choisie correspond au diamètre du champ de mode de la fibre amorce de diode. Si le faisceau doit être tramée en utilisant des déflecteurs acousto-optiques (AOD) ou par des déflecteurs électro-optiques (NEM), la taille du faisceau laser collimaté doit être légèrement inférieure à la dimension de l'ouverture du déflecteur.
4. Fixer l'adaptateur collimateur de la table optique à une distance suffisante du microscope pour permettre faisceau de routage, l'expansion et le placement des autres composants souhaités. Réglez le port fibre pour assurer taille du faisceau cohérent sur des distances comparables à la trajectoire globale du faisceau du microscope.
5. Installer des miroirs indiqués sur la figure 1. Retirer l'objectif du microscope et d'utiliser des miroirs pour acheminer le faisceau à travers l'ouverture dans l'étage de montage objectif. Si l'on préfère, le placement des miroirs dichroïques DM1 et DM3 peut être omis jusqu'àplus tard. DM2 et DM3 sont à la fois Shortpass et transmettre la lumière visible, tout en reflétant le proche infrarouge et au-dessus.
6. Il est utile de monter temporairement un pointeur laser rouge à la place de l'objectif, aligné sur l'axe optique du microscope. Un adaptateur mécanique sur mesure est nécessaire pour assurer la concentration du pointeur laser. Faisceau visible à partir du pointeur laser peut alors être acheminé vers le centre de l'ouverture du port de la fibre et peut ensuite être utilisé pour installer les lentilles (voir ci-dessous).
7. Installez le 980 nm élargisseur de faisceau (L8 et L9) à une distance convenable du port fibre pour permettre l'insertion future des composants de la direction (AOD ou EOD) si nécessaire ^1. Le faisceau élargi doit légèrement déborder l'ouverture focal arrière de l'objectif. (Ici, des focales de 125 mm et 60 mm sont dans un arrangement de Kepler à environ le double de la taille du faisceau). Utilisez faisceau du pointeur laser visible (voir section 1.6) pour assurer le placement de la lentille et l'alignement approximatif.
8. Install les lentilles de direction de 980 nm (L2 et L3) dans un système de télescope comme indiqué (ici les deux ont 60 mm de focale) ^1. L3 est monté dans un plan conjugué au plan focal arrière de l'objectif. L3 mont sur une platine de positionnement de précision XYZ pour permettre de direction de faisceau. Il est utile pour la phase XYZ de disposer d'indicateurs numériques pour ses micromètres, ce qui permet un positionnement répétable et le repositionnement de la trappe. La «plage de déplacement 0,5 est généralement suffisant, mais plus voyager pour le positionnement L3 long de l'axe optique peut être utile. Utilisez faisceau du pointeur laser visible (voir section 1.6) pour assurer le placement de la lentille et l'alignement approximatif.

2. Installation du détecteur laser

1. Installez le DM3 miroir dichroïque dessus du condenseur comme le montre la figure 1. Un support personnalisé est généralement requis. Fixer la photodiode quadruple (DOU) ou un détecteur sensible à la position (PSD) ⁸ sur le côté de l'assemblage de condenseur et ensure que le faisceau laser 980 nm traduit par DM3 est frappant c'est à peu près au centre. Lors de l'utilisation DOU, veiller à ce que il est monté sur une petite scène XY pour permettre le centrage précis de la sonde sur le faisceau laser.
2. Installation L1 (typiquement une lentille de 30 mm) entre le capteur et DM3. L1 de position de manière à focaliser le faisceau à un seul point sur le capteur.
3. Installer le filtre coupe-bande, juste avant L1 pour bloquer le faisceau de 1064 nm, ainsi que toutes les réflexions parasites de lumière visible à partir de l'illuminateur de microscope et l'éclairage ambiant.

3. Installation de 1,064 nm de longueur d'onde holographique Piège

1. La partie holographique de l'installation est construite autour d'un ensemble matériel / logiciel disponible dans le commerce Les miroirs holographiques utilisés dans ce paquet sont évalués à un maximum de puissance incidente de 5 ou 10 W / cm ^2. Monomodes TEM00 poutres dans cette gamme de puissance peuvent être facilement proviennent d'un laser DPSS à 1,064 longueur d'onde nm.
2. Montez le laser 1064 nm sur une élévationplate-forme pour correspondre à peu près à la hauteur de la trajectoire du faisceau de la ligne 980 (voir section 1).
3. Si ce n'est pas directement contrôlable, la puissance du laser peut être réglé manuellement par l'installation d'une plaque demi-onde (HWP) et un polariseur (PBS) juste après l'ouverture de sortie du laser. Il est utile de monter le polariseur dans un étage rotatif pour être en mesure de faire correspondre exigence de miroir holographique de polarisation du faisceau.
4. Installez le nm élargisseur de faisceau 1,064 (L6 et L7). La taille du faisceau laser doit être élargie pour correspondre à la diagonale du miroir holographique. Pour des taux d'expansion grandes (au-dessus de 10X), il peut être une préoccupation de maintenir la taille de l'extenseur petit. Ainsi, il peut être souhaitable d'utiliser des lentilles avec inhabituellement faible distance focale (ici: 16 mm et 175 mm).
5. Installez les autres miroirs comme indiqué pour diriger le faisceau de 1,064 nm à travers l'objectif.
   1. Sécurisé DM1 dichroïque (45 ° d'angle d'incidence) dans une monture cinématique et placer l'ensemble dans le trajet de faisceau de 980 nm de sorte qu'il permet de undiminishetransmission d de ce faisceau.
   2. Activez la lumière de pointeur laser. Le miroir DM1 doit refléter une quantité suffisante de lumière visible afin de positionner correctement le modulateur spatial de lumière (SLM), sur le trajet de ce faisceau. Le SLM doit également être incliné de sorte que les faisceaux laser entrants et sortants sont aussi proches que possible de l'incidence normale. Toutefois l'angle d'incidence doit être suffisamment grand pour que le faisceau laser ne soit pas coupé par les montures de lentille et d'autres composants optiques. Un angle de 5 ° devrait être facilement réalisable et est suffisamment petit. Enfin, la distance de DM1 au SLM doit être mesuré avec précision pour que l'insertion des lentilles L4 et L5 (voir 3.6 ci-dessous) peut conjuguer le plan de miroir SLM et le plan focal arrière de l'objectif.
   3. Installation d'un miroir pour diriger la lumière à partir de 1064 nm élargisseur de faisceau au SLM. Assurez-vous que la lumière du pointeur laser frappe l'ouverture d'élargisseur de faisceau au centre.
6. Installez lentilles L4 et L5 (ici: lentilles avec 125 mm et 200 mm respectivement). Cette paire de lunette conjugue le plan de miroir SLM au plan focal arrière de l'objectif et permet également de réduire la taille du faisceau à seulement légèrement déborder le retour de l'ouverture de l'objectif. Nous avons choisi des focales longues à l'espace du SLM loin de DM1. Ce n'est pas seulement efface place à la deuxième ligne de laser, mais tend aussi à rendre plus facile l'alignement.
7. Retirez le pointeur laser. Laissez l'adaptateur de montage pour servir ouverture d'alignement grossier.

4. Installation et alignement Notes de système

1. Lentille L3 et SLM doivent être positionnés de manière à être optiquement conjugué au plan focal arrière de l'objectif. Le point focal commun de L4 et L5 est optiquement conjugué au plan de l'échantillon si les faisceaux de piégeage optique sont injectés dans l'espace de débordement du microscope.
2. chanter IR carte spectateur aligner le faisceau de 980 nm pour aller le long de l'axe central de l'ouverture dans l'adaptateur de pointeur laser.
3. Utilisez la carte IR to faire en sorte que le faisceau de 1064 nm frappe au même endroit que le faisceau de 980 nm à DM1, L2 et L3 et que le faisceau de 1064 nm va le long de l'axe central de l'ouverture dans l'adaptateur de pointeur laser.
4. Remplacer l'adaptateur de montage pointeur laser avec un objectif. Numérique huile ou d'eau objectif d'ouverture élevé est typique.
5. Aligner le piège à 980 nm tel que décrit dans ^neuf par "marche" du faisceau laser jusqu'à ce qu'un motif d'interférence radialement symétrique est visible sur la caméra.
6. Avec l'arrêt de miroir holographique (ie agissant comme un miroir passive) utiliser SLM et DM1 de «marcher» le faisceau diffracté 1,064 nm pour aligner le piège de 1,064 nm.
7. Le SLM produit un faisceau non diffracté importante qui se traduit par une forte piège laser immobile dans le champ de vision. Ceci est utile pour l'alignement, mais peut-être pas souhaitable pour des expériences. Pour bloquer ce piège, on peut insérer un petit objet opaque dans le trajet de la lumière non diffractée dans le conjugué de l'emplacement par rapport au plan de l'échantillon (par exemple ee point focal commun de L4 et L5). La taille de ce bloqueur de tache centrale doit être un peu plus grand que le diamètre de la tache d'Airy pour la lumière focalisée (un bloqueur de 100-300 um de diamètre pour le système décrit).
8. djust 1,064 polarisation du faisceau nm en utilisant le filtre pour correspondre à l'orientation SLM. Faire pivoter la lame demi-onde pour régler la puissance de sortie du faisceau si besoin.
9. Si vous le souhaitez, insérez AOD ou NEM éléments de direction faisceau dans la ligne de laser 980 nm. Veiller à la bonne conjugaison de ces éléments au plan focal arrière de l'objectif et de réaligner le piège. Il est utile de monter les éléments de direction sur une scène de goniométrie.

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Résultats

La configuration assemblée permet à l'opérateur de piéger plusieurs objets de réfraction en temps réel et les positionner dans les trois dimensions dans le champ de vision. Nous illustrons les capacités holographiques de l'instrument en piégeant 11 microsphères (figure 2). Le piège confinant chaque objet est manuellement repositionné sur le piégeage de sorte que l'arrangement final représente le logo de l'Université de l'Utah, où cette expérience a été réalisée. U...

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Discussion

Nous avons construit un instrument qui combine deux pièges optiques de différents types (Figure 1) pour fournir des installations de piégeage séparés pour la manipulation d'objets et de mesure. Le piège optique "classique" est construit autour d'une diode laser à 980 nm. Ce faisceau est élargi, dirigé et ensuite injecté dans notre microscope inversé (poutre "lumière rouge" dans la figure 1). Le piège optique holographique est construit autour d&#...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optical table	Newport corporation	ST-UT2-56-8	Irvine, CA
Microscope, Inverted, Eclipse Ti	Nikon USA	MEA53220	Melville, NY
Plan apo 100X oil objective (1.4 NA)	Nikon USA	MRD01901	Melville, NY
Oil condenser Lens 1.4 NA	Nikon USA	MEL41410	Melville, NY
EMCCD camera	Andor technology USA	Ixon DU897	South Windsor, CT
1/3" CCD IEEE1394 camera	NET USA Inc	Foculus FO124SC	Highland IN
Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength	Klastech Laser Technologies	Senza-1064-1000	Dortmund; Germany
laser diode, TEM00, SLM, 980 nm	Axcel Photonics	BF-979-0300-P5A	Marlborough, MA
laser diode mount	ILX Lightwave	LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984	Bozeman, MT
adjustable fiber ports	Thorlabs	PAF-X-11-B	Newton, NJ
holographic system	Arryx	HOTKIT-ADV-1064	Chicago, IL
holographic mirror	Boulder Non-linear Systems	this is a part of HOTKIT-ADV-1064	Lafayette, CO
Calcite polarizer	Thorlabs	GL10-B	Newton, NJ
half-wave plate	Thorlabs	WPH05M-1064	Newton, NJ
Polarizer rotation mount	Thorlabs	PRM1	Newton, NJ
half-wave plate rotation mount	Thorlabs	RSP1	Newton, NJ
Shutter	Thorlabs	SH05	Newton, NJ
dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI	Chroma Technology	t750spxrxt	Bellows Falls, VT
dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI	Thorlabs	DMSP1000R	Newton, NJ
custom mechanical adapter	Thorlabs	SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore	Newton, NJ
notch filter	Semrock	FF01-850/310-25	Rochester, NY
Acousto-Optic deflector (2-axis)	intraAction	DTD-584CA28	Bellwood, IL
goniometric stage	New Focus	9081	Santa Clara, CA
60 mm steering lenses	Thorlabs	LA1134-B	Newton, NJ
16 mm aspherical expander lens	Thorlabs	AC080-016-C	Newton, NJ
175 mm expander lens	Thorlabs	LA1229-C	Newton, NJ
Spot blocker (cabron-steel sphere)	Bal-Tec	0.0100" diameter	Los Angeles, CA
Microspheres (Carboxyl-polystyrene)	Spherotech	CP-45-10	Lake Forest, IL