التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

Summary

أصبح التصور من البيانات التجريبية عنصرا أساسيا في تقديم النتائج للمجتمع العلمي. جيل من يعيش تسجيل الوقت الفاصل بين الأجنة المتزايد يساهم في تحسين العرض وفهم العمليات التنموية المعقدة. هذا البروتوكول هو دليل خطوة بخطوة لوضع العلامات الخليوي عبر photoconversion من البروتين Kaede الذي في الزرد.

Abstract

الفقاريات palatogenesis هو عملية التنموية فشلت غاية ومعقدة، والتي تنطوي على الهجرة من قمة العصبية القحفية (CNC) الخلايا، والتقارب والإرشاد من البروز في الوجه، ونضوج الهيكل العظمي القحفي. لدراسة مساهمة قمة العصبية في الجمجمة لمناطق معينة من الحنك الزرد لsox10: تم إنشاء خط Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا. يوفر Sox10 تقييد نسب البروتين مراسل Kaede الذي لقمة العصبية، مما يجعل الخلية وصفها عملية أكثر دقة من الصبغة التقليدية أو الحقن مراسل مرنا. Kaede الذي هو البروتين الذي يحول الصورة للتحويل من الأخضر إلى الأحمر بعد تفعيل الصورة ويجعل من الممكن لمتابعة الخلايا على وجه التحديد. وsox10: Kaede الذي خط المعدلة وراثيا تم استخدامها لإجراء تحليل النسب لتحديد السكان الخلية CNC التي تؤدي إلى الفك العلوي الفك السفلي مقابل عناصر التماثل وتوضيح من البروز الوجه لamniotes. يصف هذا البروتوكول الخطوةق لتوليد يعيش الفيديو في الوقت الفاصل بين لsox10: الجنين الزرد Kaede الذي. وسوف تطور لوحة الغربالي بمثابة مثال عملي. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لجعل الوقت الفاصل بين متحد البؤر تسجيل أي Kaede الذي أو ما شابه ذلك البروتين مراسل photoconvertible في الزرد المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن استخدامها لالتقاط التنمية يست طبيعية فقط، ولكن أيضا غير طبيعية من هياكل القحفي في المسوخ الزرد.

Introduction

انشقاقات فموي وجهي تمثل التشوه القحفي الأكثر انتشارا، مع 1/700-1، 000 شحنات تتأثر ^1. تعطيل التنمية في وقت مبكر القحفي الجنينية يمكن أن يؤدي إلى تشكيل الشفة المشقوقة والحنك (CL / P). بينما الأسباب لالمشقوقة المتلازمات وقد ثبت إلى حد كبير، أسس جينية وراثية وأشكال nonsyndromic من clefting فموي وجهي لا تزال بحاجة إلى كشف ^2-4. من أجل فهم المسببات المرضية وهذه التشوهات، فمن الضروري توضيح تطوير هياكل القحفي على أساس الخلوية.

في جميع أنواع الفقاريات الخلايا العصبية قمة الجمجمة (CNCC) ترحيل من الأنبوب العصبي الظهري لملء الأقواس البلعومية، والتي سوف تسهم في تشكيل هياكل فموي وجهي. تعطيل التنمية في وقت مبكر الجنينية قمة العصبية يمكن أن يؤدي إلى تشكيل تشوهات القحفي بما CL / P ^5-7.

في الإعلانdition إلى التشابه الهيكلية بين الزرد والتنمية القحفي الثدييات (CNCCs يقيمون في مناطق متماثلة)، وحفظا للغاية شبكة تنظيمية الجينات. وقد تبين أيضا أن CNCCs تطوير بنفس الطريقة بين الأنواع حيوان سلوي والزرد ^8، مما يجعل من الزرد كائن قوية لدراسة الأساس الوراثي للالتنموية وCL / P. لها العديد من المزايا، بما في ذلك حجم صغير وسريع والرحم السابقين التطور الجنيني، ومعدلات التكاثر عالية. وعلاوة على ذلك، فإن الجنين شفافة بصريا، مما يجعلها قابلة للرصد الأحداث التنموية المعقدة تحت المجهر ^9. هو نموذج حيواني مثالية لدراسة الهجرة وتمايز الخلايا العصبية قمة الجمجمة.

التوسع في الأعمال المنشورة سابقا ^{8، 10، 11،} ونمط الهجرة من CNCC وصفت بالتفصيل باستخدام sox10: Kaede الذي نموذج المعدلة وراثيا ^5. Kaede الذي هو البروتين الصورة القابلة للتحويل التي توRNS من الأخضر إلى الأحمر بعد تفعيل الصورة ويجعل من الممكن تتبع CNCCs على وجه التحديد. خلال هذا التحول هو العمود الفقري المشقوق الببتيد، مما يدل على أن تحويل مستقرة، وهذا يعني يمكن تتبع الخلايا إلى وجهتها النهائية ^12. خطوط المعدلة وراثيا المسمى مع Kaede الذي تحت السيطرة النسخي من sox10 أظهرت أن الحنك وحيوان سلوي لوحة الغربالي من الزرد تتشكل homologously بواسطة مزيج من البروز الفك العلوي الثنائي (MXP) مع البروز الجبهي الأنفي (FNP) وأن Y على شكل الانصهار التماس يماثل بين الأنواع.

بين التطبيقات الأخرى، وsox10: تم Kaede الذي نموذج الزرد المعدلة وراثيا المستخدمة لتوليد أشرطة الفيديو من الأجنة الزرد في مراحل تنموية مختلفة لإظهار تشكيل هياكل القحفي العادية وغير العادية. Photoconversion من مجموعات محددة من الخلايا يجعل من الممكن تتبع تطورها. مع هذا الأسلوب نهجا لخلق التصوير الحي تطوير craniofacوقدم الاتحاد العالمي للتعليم في الهياكل الزرد، مما يجعل من السهل لإثبات بصريا هذه العملية التنموية المعقدة.

ويهدف هذا البروتوكول إلى تبادل الخبرات لتوليد هذه المقاطع باستخدام التطور الطبيعي من لوحة الغربالي في sox10: الزرد المعدلة وراثيا Kaede الذي كمثال على ذلك. يمكن كذلك أن يطبق هذا البروتوكول لصنع أشرطة الفيديو الوقت الفاصل بين أي هيكل المستمدة من الخلايا العصبية قمة الجمجمة في الزرد.

Protocol

1. الجنين لجمع Photoconversion

1. إعداد ما لا يقل عن عشرة أزواج من sox10: الزرد المعدلة وراثيا Kaede الذي بين 5 و 6:00 مساء.
2. في صباح اليوم التالي، وسحب فواصل وجمع البيض عند الظهر تقريبا. نقلها إلى أطباق بتري ووضعها في 28.5 درجة مئوية الحاضنة.
3. في حوالي 24 ساعة الإخصاب آخر، وتنظيف أطباق بتري عن طريق إزالة الأجنة الميتة. تحقق من المرحلة التنموية للأجنة ¹³ باستخدام المجهر الميدان الخفيفة وأي المجهر الفلورسنت مع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) التصفية. سوف Kaede الذي يكون مرئيا من خلال هذا المرشح.
4. عندما تصل الأجنة نقل 60 HPF خمسة أجنة الفلورسنت الزاهية في طبق بتري منفصلة وdechorionate عليها إذا لزم الأمر.

2. تصاعد من الأجنة لPhotoconversion

1. جبل الجنين باستخدام مجهر الفلورسنت العادية. تصاعد الأجنة على المجهر متحد البؤر هي أمر بالغ الصعوبة.
2. استخدام موقفالماء ارض E3 E3 أو إعداد جديدة باستخدام الوصفة التالية:
   يضاف ما يلي في لتر واحد من الماء المقطر DH ₂ O إضافة التالية لجعل 1X E3L:
   0.292 غ 5.0 ملي مول كلوريد الصوديوم
   0.013 ز 0.17mM بوكل
   0.044 ز 0.33mM و CaCl ₂ (المجففة، 96٪، ACS كاشف)
   0.081 ز .33 ملي MgSO ₄ (anhydrated)
   اختياري: إضافة 200 ميكرولتر من 0.05٪ الميثيلين الأزرق ل1X E3 كمبيد للفطريات ويقلب.
   متوسطة تبقي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 أسبوع.
3. استخدام معيار تريكين أو إعداد تريكين باستخدام وصفة التالي:
   لمدة 5 L 0.2٪ تريكين خلط المكونات التالية:
   45 مل تريس الكلورين (1M pH9.5)
   5 LH ₂ O
   10 ز تريكين
4. إعداد 'عصير فيلم' (50 مل E3، 0.015٪ محلول تريكين)، وذلك بإضافة 3.75 مل 0.2٪ إلى 46.25 مل تريكين E3.
5. إعداد الاغاروز عن طريق خلط 46.25 مل E3 الماء مع 46.35 ملغ نقطة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز في كوب 50 مل قارورة وتذوب الجزيئات الصلبة عن طريق الميكروويف. ثم يضاف3.73 مل 0.2٪ تريكين إلى الاغاروز ووضع قارورة زجاجية مع الاغاروز إلى 50 درجة مئوية حمام مائي حتى الاستخدام.

3. إعداد وتركيب الأجنة

1. تخدير الأجنة مع E3/0.015٪ محلول تريكين في الخطوة 1.1.2 ونقل الجنين الى الشريحة الغرفة.
2. امتصاص كل فائض E3 مع المناديل الورقية ووضع الاغاروز على الجنين.
3. موقف الجنين الظهرية تماما مع نصائح microloader. تأكد من أن الجنين كله لا تطفو على السطح من الاغاروز، ولكن دفع إلى أسفل الجسم كله. ثم صب E3/0.015٪ محلول تريكين على الجنين جزءا لا يتجزأ من الاغاروز حتى يمتلئ تماما مع غرفة السوائل.

4. ضبط إعدادات البرامج على متحد البؤر المجهر

1. استخدام الهواء 20X الهدف immersible التي (الفتحة العددية 0.75؛ الثقب حجم 20) لتركيز الجنين. ثم اضغط على زر الضوء L100 على المجهر وتحديد القنوات في مجال البرمجيات. controls/A1settings فتح شاشة عرض الرموز / اقتناء وكليكك على زر الإعداد متحد البؤر. انقر المقبل 'السيارات' وحدد القنوات التالية قبل أن يغلق النافذة مرة أخرى:
   CH1: دابي القنوات 403.4 نانومتر (أطوال موجة بين 350-410 نانومتر يمكن استخدامها)
   CH2: 488.0 نانومتر
   CH3: 561.9 نانومتر

5. Photoconversion

1. إيقاف CH1 و 3 وتشغيل CH2 قبل النقر فوق الزر إزالة التعشيق والمسح الضوئي.
2. التركيز على الخلايا التي تهم photoconversion، الذي هو أفضل القيام به من خلال البدء مع الجهد 1frame/sec وعالية (HV) 200 ثم الصعود في لقطة / ثانية وخفض HV وفقا لذلك حتى تصل 1/32 لقطة / ثانية وHV حول 100-120، اعتمادا على الضوضاء في الخلفية.
3. عند الجنين هو في التركيز، والبحث على الحافة اليمنى من الشاشة، والاستيلاء على حافة خضراء وجعله أصغر لذلك يناسب مجال الفائدة لphotoconversion وفوق الحق مع الماوس. أصغر هو أفضل لأن photoconversion لا رجعة فيه.
4. تتحول لقطة / ثانية إلى 1 وHV إلى 200 وضربمسح. والتكبير في الصورة من مساحة photoconversion الآن مرئية.
5. خلايا Photoconvert عن طريق تشغيل CH1 (403.4 نانومتر). فضح ليزر photoconverting في أي مكان 5-60 ثانية، اعتمادا على حجم المنطقة الخضراء حتى Kaede الذي كما رأينا من خلال قناة GFP غائب تقريبا.
6. عندما تكون إشارة خضراء Kaede الذي تغيب تقريبا، تتحول CH1 قبالة. بدوره CH2 و 3 على. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على نافذة على الحقل A1 منطقة المسح الضوئي وضرب "العودة إلى حجمها الأصلي" للتحقق مما إذا كانت photoconverted الخلايا المطلوب.

6. جعل Z-كومة

1. العثور على أيقونة 'التقاط Z-سلسلة' في شريط القائمة وتعيين الحدود العليا والدنيا من Z-كومة قبل البدء بتشغيله. مجموعة طرفيات المستعملين المحليين.

7. البرمجيات إعدادات الوقت الفاصل

1. انتقل إلى واجهة المستخدم الرسومية A1Simple مربع والقراد الإعدادات التالية:
   1/32 لقطة / ثانية
   حجم 1024
   متوسط ​​4 أو 8X اعتمادا على عدد من Z-المداخن التي يجب أن يؤخذ في حلقة واحدة
2. انتقل إلى:ضوابط عرض / اكتساب / اقتناء تسلسل ND ووضع إطار زمني (8 30MIN)، انقر فوق مستمر وZ-المكدس. تعيين الحدود كما تم اختبارها من قبل وبدء الفيلم.
3. الحفاظ على إضافة E3/0.015٪ تريكين الحل غرفة الشريحة على مدار اليوم. في الليل، وتملأ الغرفة تماما. والتي تستمر حتى صباح اليوم التالي.
4. في صباح اليوم التالي، وإعادة ملء E3/0.015٪ محلول تريكين ومعرفة ما اذا كان الجنين لا يزال على قيد الحياة. فقدان مضان يشير إلى الموت. تواصل الغيارات والشيكات على مدار اليوم.
5. عند الانتهاء من تشكيل الهيكل، أو قد مات الجنين، والانتهاء من الفيلم.

8. معالجة مرحلة ما بعد الإنتاج

1. انقر فوق "إظهار الإسقاط كثافة الأقصى 'على شريط الأدوات، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وإنشاء مستند جديد. شريط الفيديو هو الآن واضحة في نوعية أفضل وجه ممكن. انتقل إلى حذف الإطارات التي لا يحتاج إليها وضبط طرفيات المستعملين المحليين. أخيرا حفظ ك. افي. وسوف يكون على ما يرام هذا الشكل لنظام التشغيل Windows. لماك تحميل البرمجيات رس تحويل ل. وسائل التحقق أو. WMV.

النتائج

في sox10: وصفت CNCCs Kaede الذي خط المعدلة وراثيا، وآخر المهاجرة المهاجرة الخضراء fluorescently. الخلايا CNCC المسمى مع الأخضر الفلورسنت Kaede الذي ألخص الذاتية sox10 التعبير مرنا ^5.

بين التطبيقات الأخرى، وقد استخدم هذا النموذج الحيواني لتصور أ...

Discussion

هنا يتم عرض طريقة جديدة لرؤية التنمية القحفي في نموذج الزرد. وsox10: تم Kaede الذي خط الزرد المعدلة وراثيا المستخدمة بنجاح لوصف نمط المهاجرة من CNCC بالتفصيل ما يستخدم كائن نموذج ^5.

وقد استخدمت الدراسات السابقة المعالم الإجمالي مث?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sox10:kaede transgenic zebrafish line	MGH		Available via the Liao lab
Petri dishes 100x15 mm	BD Falcon	351029
Petri dishes 35 mmx10 mm	BD Falcon	351008
Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose	Invitrogen	15517022
Lab Tek 2 Chamber SlideSystem	LabTek	154453
Microloaders 200/pk	Fisher	E5242956003
Nikon A1R Si Confocal Ti series	Nikon	No Catalog number
NIS Elements Software AR3.2 64-bit	Nikon	No Catalog number