الآلي التحليلات السلوكية عالية الإنتاجية في يرقات اسماك الزرد

Summary

وضعت مختبرنا والإنتاجية العالية نظام التصوير الآلي رواية يمكن أن يكون مفيدا للكشف عن العديد من السلوكيات المختلفة في اليرقات الزرد لمدة 7 أيام من العمر. ويمكن استخدام النظام للكشف عن التغييرات الطفيفة في السلوك بعد أن يكونوا قد تعرضوا اليرقات إلى المواد السامة البيئية أو المستحضرات الصيدلانية.

Abstract

قمنا بإنشاء نظام التصوير عالية الإنتاجية رواية لتحليل سلوك اليرقات في الزرد لمدة 7 أيام من العمر في لوحات متعددة الحارات. يقيس هذا النظام السلوكيات العفوية وردا على التحفيز مكره، والذي يظهر أن اليرقات عبر عرض تقديمي ل PowerPoint. يتم تحليل الصور المسجلة مع ماكرو يماغيج، الذي يقسم قنوات اللون تلقائيا، ينقص الخلفية، وينطبق عتبة لتحديد موضع اليرقات الفردية في الممرات. يمكننا بعد ذلك استيراد إحداثيات في ورقة اكسل لقياس سرعة السباحة، وتفضيل حافة أو جانب من الممر، ويستريح السلوك، انجذاب بالتماس، وبعد المسافة بين اليرقات، وسلوك التهرب. التغييرات الطفيفة في السلوك يتم بسهولة الكشف عن استخدام النظام لدينا، مما يجعلها مفيدة للتحليلات سلوكية بعد التعرض للسميات البيئية أو المستحضرات الصيدلانية.

Introduction

الزرد أصبحت نموذجا محببا للعلوم الوراثية التنموية والسلوكية، ^1-4. تفقس من chorions من خلال 2-3 أيام آخر الإخصاب (DPF)، وتطوير الأجهزة تعمل بشكل كامل من قبل 4-5 DPF، ويحمل عدد كبير من السلوكيات بنسبة 7 DPF ^5،6. هي مناسبة بشكل مثالي ليرقات اسماك الزرد التحليلات عالية الإنتاجية بسبب صغر حجم ^7،8. البرنامج متاح تجاريا لتحليل الآلي للسلوك في اليرقات والكبار الزرد ^9-14. ومع ذلك، يمكن لهذا البرنامج أن تكون مكلفة ولها خيارات محدودة لقياس السلوكيات المعقدة من اليرقات الزرد في لوحات متعددة جيدا.

أنشأنا نظام التصوير عالية الإنتاجية الرواية التي هي غير مكلفة لإعداد ويمكن تحديد عدد من السلوكيات المختلفة في 7 DPF الزرد اليرقات ^15،16. النظام يسمح لنا بسرعة وكفاءة لاختبار الانحرافات السلوكية خفية بعد التعرض الجنينية إلى عدد منالمستحضرات الصيدلانية والمواد السامة البيئية ^16-18.

تم بناء النظام باستخدام خزائن خشبية، والتي منزل كاميرا رقمية في الجزء العلوي من مجلس الوزراء. الكاميرا تواجه الهبوط إلى أسفل لمجلس الوزراء حيث يتم وضع جهاز كمبيوتر محمول مع شاشة مواجهة ^15. ويستخدم الوقت الفاصل بين التصوير لالتقاط وضع اليرقات في الممرات. يمكن أن يضم اليرقات في ما يصل إلى أربعة لوحات متعددة جيدا أو متعددة الحارات التي تتمركز على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. نحن نستخدم عرض تقديمي ل PowerPoint لأنها تشكل حافزا مكره التي اليرقات الرد عن طريق تحريك بعيدا (تجنب) والسباحة نحو الحافة (انجذاب بالتماس) ^15،17. يتم استيراد الصور في يماغيج التي يستخدم ماكرو الآلي لتقسيم قنوات اللون، طرح الخلفية، وتطبيق الحد الأدنى للتعرف على اليرقات الفردية. يتم سرد إحداثيات لكل يرقة في كل صورة، ويمكن إدراجها في ملف إكسل التي نستخدمها لقياس تجنب وthigmotaالسلوك xis، الأسماك لمسافة الأسماك، والسباحة بسرعة، وكمية من الراحة ^16.

Protocol

1. جمع الأجنة الزرد ورفع يرقات

1. ينبغي إدراج أطباق بيركس زجاج مع العشب "وهمية" (المصنوعة من خيوط خضراء) (الشكل 1) إلى الخزانات عند الفجر وغادرت في لمدة ساعتين من أجل جمع الأجنة الزرد. يجب سكب الأطباق الزجاجية التي تحتوي على أجنة أكثر من مصفاة المحمولة وتشطف بالماء منزوع الأيونات. وينبغي بعد ذلك نمت الأجنة في الماء البيض. يحتوي على ماء بيضة 60 ملغ / لتر من المحيط الفوري في الماء منزوع الأيونات و 0.25 ملغ / لتر من زرقة الميثيلين، والذي يستخدم كمانع العفن.
2. اعتمادا على فرضية التجربة الفردية والأجنة يمكن أن تعامل على الفور أو خلال مراحل معينة من التنمية باستخدام المواد السامة أو الأدوية. وعادة ما يتم حل المواد السامة والمواد الصيدلانية في DMSO (في X تركيز 1،000) وينبغي مواصلة المخفف مباشرة في المياه المتوسطة البيض.
3. أثناء العلاج الجنينية واليرقات مع الأدوية أو السمومق، يمكن أن يضم اليرقات والأجنة في أطباق بتري العميق في مناطق ذات كثافة من حوالي 50-60 يرقات لكل 50 مل حتى التحليلات السلوكية في 7 DPF (يجب تغيير البيض المحلول المائي على الأقل مرة كل يومين لتجنب نمو الفطريات / البكتيرية من أجنة ميتة).

2. إعداد قوالب للتحليلات السلوكية

1. وضعت خصيصا القوالب البلاستيكية التي تقيس 11.7 سم × 7.6 سم × 5 مم تم بناؤها مخصصة في المنزل. وهناك حاجة إلى قوالب لإنشاء ممرات باستخدام الاغاروز الذي يسفك في لوحات من البلاستيك جيدا واحدة من الحرارية العلمية. البئر مقياس واحد لوحات 12.4 سم × 8.1 سم × 1.2 سم.
2. القوالب تحتوي على خمسة مسارات التي يتم الزاوية الجانبين في 60 درجة. الممرات في قوالب هي 3.5 ملم عالية مع وجود قاعدة من 18 مم في الجزء العلوي الذي هو أوسع في حين أن عرض القاع هو 14 مم. هناك مم الفجوة بين 4 مسارات في القالب (الشكل 2).
3. لإعداد الممرات صب 50 مل من الاغاروز ذاب (0.8٪ الاغاروز في deionizeالمياه د مع 60 ملغ / لتر المحيط الفوري) في لوحة واحدة بشكل جيد. ثم ينبغي أن توضع في قالب ببطء شديد على رأس الاغاروز سائل للقضاء على أي تشكيل فقاعة، ويمكن إزالتها عندما يبرد الاغاروز (والتي تأخذ حوالي 45 دقيقة).
4. وينبغي بذل الممرات الاغاروز لا وقت سابق من يوم واحد قبل التجربة السلوكية هو المراد تشغيلها (لتجنب الاغاروز تجفيف) ويمكن تخزين الممرات في درجة حرارة الغرفة مع الأغطية على الأطباق لمدة تصل إلى ما يقرب من 36 ساعة. وينبغي أن تستخدم الممرات الاغاروز فقط لتجربة واحدة وينبغي بعد ذلك التخلص منها.

3. التقاط الصور

1. ما يصل الى 20 يرقات يمكن وضعها في كل حارة من لوحات. وتستخدم عادة 5 يرقات لكل حارة لتسهيل تتبع أدق من سرعة السباحة وإلى تقليل عدد اليرقات التي هناك حاجة في التجربة. يمكن ملء الممرات بالماء البيض مع أو بدون الأدوية أو المواد السامة وهذا يتوقف على التجربة. ومع ذلك، ينبغي أن لا تكون الممرات وilled على طول الطريق حتى يتم وضعها في خزانات التصوير، وهذا سوف منع تجاوز. من أجل التناسق، يجب أن يكون يرقات فترة التأقلم من عشر دقائق بعد يتم وضعها في قوالب الاغاروز وضعه على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. سوف تتحرك بكفاءة اليرقات من طبق بيتري إلى الاغاروز حارة تساعد على الحد من التوتر اليرقات. هذا هو أسهل عندما يتم إيواء اليرقات في خزانات ضحلة أو أطباق بتري.
2. تشمل خزانات التصوير كاميرا رقمية كانون المستخدمة في التصوير الوقت الفاصل بين وجهاز كمبيوتر محمول. يجب وضع الكاميرا في الجزء العلوي من مجلس الوزراء وتهدف إلى أن الجزء السفلي من مجلس الوزراء حيث يجب أن توضع بوصة شاشة الكمبيوتر المحمول مع شاشة 15.6 مواجهة (الشكل 3). وينبغي وضع أربع لوحات باليد مباشرة على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. في هذا الوقت يمكن تصدرت الممرات قبالة مع الماء البيض أو المعالجة الكيميائية بحيث يكون مستوى مع الجزء العلوي من ممر (للقضاء على الظلال على حواف Lانيس في الصور).
3. يتم استخدام عرض تقديمي ل PowerPoint لأنها تشكل حافزا مكره لليرقات. في الكرات الحمراء تتحرك الماضي عرضت لالزرد اليرقات في 6 أو 12 لوحات متعددة جيدا ^15،17،18. يبدأ برنامج البور الحالي مع خلفية بيضاء فارغة لمدة 15 دقيقة، تليها 15 دقيقة من شريط أحمر متحرك على النصف العلوي من لوحة (الشكل 4). من أجل القضاء على الحرارة المفرطة لليرقات، فمن الأفضل لشراء جهاز كمبيوتر محمول مع شاشة درجة الحرارة لا ترتفع إلى ما فوق 28 درجة مئوية. لتجنب التبخر من السائل داخل الممرات الاغاروز، وينبغي أن تبقى وقت التصوير القصوى إلى أقل من ساعة واحدة.
4. وينبغي برمجة الكاميرا الرقمية للتصوير الفوتوغرافي الوقت الفاصل، والتقاط الصور كل 6 ثوانى ليصبح المجموع 300 صورة لكل تجربة. ومع ذلك، فإن تواتر وطول يمكن تعديلها اعتمادا على التجربة والقياس الكمي السلوكية. في الآونة التصوير الموسعة الماضي كانوا يعملون باستخدام فترات أطول بين كل صورة. وCAMERويمكن تعيين في دقة أقل للتصوير في سرعة الفيديو (30 لقطة في الثانية الواحدة). بينما يحد من دقة أقل التسجيلات إلى لوحة multiwell واحد، وتسجيلات الفيديو هي مناسبة للتصوير السريع أحداث السباحة ^15.

4. تحليل الصور

1. يجب فتح الصور مع يماغيج واستخدامها مع ماكرو التي تم كتابتها خصيصا في المنزل. الماكرو تلقائيا انشقاقات قنوات اللون بحيث اللون الأحمر يمكن إزالتها، وينقص الخلفية، ينطبق عتبة، ويحدد اليرقات من خلال تحليل الجسيمات. الماكرو معظم الحالية لمدة خمس تحليل اليرقات لين هو Zebrafish_macro25k. استخدام المطالبات في الماكرو لتعيين عدد من الصور، واللون لتطرح، عتبة الصورة، الخ
2. بعد أن يتم تشغيل كافة الصور من خلال الماكرو يماغيج، سيتم عرض ملف النتائج وسيحتوي X، Y إحداثيات اليرقات الفردية لكل صورة جنبا إلى جنب مع عدد الصورة وعدد لين.
3. يجب حفظ ملف النتائج في تنسيق Excel وفرزها على أساس الخلفية فارغة مقابل المتحرك خلفية شريط ثم الرقم جيدا. قالب اكسل وينبغي أن تستخدم لديها المعادلات التي بنيت في أن يحدد وضع اليرقات تلقائيا في الآبار، وبعد المسافة بين اليرقات، وسرعة الحركة، وكمية من الراحة. يتم إنشاء قالب اكسل أحدث 25ib في المختبر Creton، والذي يتوفر عند الطلب. ينبغي بناء الرسوم البيانية التي تبين مجموعات العلاج المختلفة في ورقة اكسل جنبا إلى جنب مع تي اختبارات للمقارنة بين مجموعات العلاج والضوابط. التحليل الإحصائي مزيد يمكن القيام بها باستخدام SPSS.

النتائج

في المقايسات لدينا في وقت سابق، وذلك باستخدام كذاب الكرة مكره التحفيز ويرقات النوع البري غير المعالجة التي يتم الرد على الكرة تتحرك عن طريق السباحة أسفل في البئر (سلوك التهرب) ونحو حواف البئر (السلوك انجذاب بالتماس) ^15. أكدنا في وقت لاحق أن سلوك انجذاب بالتماس في هذا الاختبار هو مقياس السلوك ذات الصلة القلق في الزرد اليرقات ^17. كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في حركة اليرقات بعيدا عن الكرة وتفضيل حافة بالمقارنة مع خلفية بيضاء فارغة. وقد تأكدت هذه السلوكيات أيضا في فحص جديد لدينا باستخدام شريط أحمر متحرك، بل وأصبحت أكثر قوة ^16. وعلاوة على ذلك، يمكننا الآن أخذ عينات عدد أكبر من السلوكيات في فحص واحد بما في ذلك سرعة السباحة، والراحة، وتفضيل نهاية أو جانب من البئر، والمسافة بين الأسماك (الشكل 5). اليرقات السيطرة نمت في الماء البيض تظهر تفضيل زيادة لتكون لأسفل في طبق وعلى حافة الممر علىأي fter يتم تقديمها مع التحفيز مكره (تحريك شريط أحمر). ويتم الحصول على نتائج مماثلة عندما تزرع اليرقات في المياه بيضة تحتوي على 1 ميكروغرام / مل DMSO، مذيبة التي يشيع استخدامها في حل مختلف المستحضرات الصيدلانية والمواد السامة و1،000 الحلول الأسهم X.

وتظهر نتائج ممثل في الشكل 5 في اليرقات تعامل مع المياه البيض وDMSO (كما الضوابط) وتركيزات متفاوتة من الفوسفات العضوي للآفات التي توجد عادة في الأطعمة غير العضوية. النتائج المعروضة هي عينة من تجربة واحدة. ومع ذلك، عندما كرر، فإن النتائج تشير إلى أن سرعة السباحة والسلوك انجذاب بالتماس يتم تعديلها من قبل تركيزات منخفضة من مبيدات الآفات العضوية الفوسفاتية، والتي تحاكي مستويات الاستهلاك الغذائي في الإنسان ^18.

الشكل 1. وتستخدم صواني جمع. أطباق بيركس زجاج لجمع البريدmbryos من الدبابات الأسماك البالغة. وقطعت الأغطية من الأطباق بيركس وإدراجها مع شبكات من البلاستيك وكان مخيط غزل الخضراء على الشبكات في البلاستيك. هذا يخلق جوا خصبا للالزرد الكبار عن طريق محاكاة البيئة الطبيعية.

الشكل 2. قالب من البلاستيك والممرات الاغاروز. A) ويظهر العفن على اليسار. يسكب 0.8٪ الاغاروز في لوحة واحدة جيدا؛ يتم إدراج القالب ببطء ثم إزالة عندما يبرد الاغاروز B) لوحة على اليمين يظهر الممرات التي تم إنشاؤها في الاغاروز من قبل قالب من البلاستيك.

الشكل (3). وكانت خزائن التصوير. خزائن التصوير سبيسيالY بنيت في مختبرنا وتستخدم لتحليلات سلوكية عالية الإنتاجية. تم إرفاق 15 ميجابيكسل كاميرا رقمية إلى الأعلى لمجلس الوزراء إلى أسفل من أجل جمع الوقت الفاصل بين الصور من اليرقات في لوحات المتعدد رقم وضعت على أعلى الشاشة من جهاز كمبيوتر محمول. بين لوحات والشاشة هناك الناشر البلاستيك الذي يستخدم لمنع أنماط تموج في النسيج في الصور التي تم جمعها.

الشكل 4. الخلفية فارغة ومكره التحفيز باور بوينت، وهذا هو باور بوينت الحالي الذي يتم استخدامه لاستحضار التغيرات السلوكية في اليرقات الزرد. ويوفر الاختلافات السلوكية بين قوي A) الخلفية فارغة وB) شريط أحمر متحرك.

الشكل 5. السلوكيات كميا في مقايسة الإنتاجية العالية. مثال من السلوكيات التي يتم كميا من الفحص السلوكية لدينا داخل ورقة Excel التي نستخدمها لX، Y إحداثيات من اليرقات. أشرطة بيضاء تظهر البيانات من اليرقات تتعرض لخلفية فارغة وأشرطة حمراء تظهر البيانات من اليرقات تتعرض لشريط متحرك الأحمر في برنامج البور بوينت. الرسوم البيانية تشير القياسات التي يمكن الحصول عليها من التحليل السلوكي أ) النسبة المئوية ليرقات أسفل في الممر، B) النسبة المئوية لليرقات في نهاية الممر، C) نسبة اليرقات على حافة الممر، D) المسافة بين السمك (مم)، E) السباحة سرعة اليرقات (مم / دقيقة)، F) النسبة المئوية بقية اليرقات. في الرسوم البيانية المعروضة، والبيانات هي من treatmوالأنف والحنجرة من اليرقات مع سيطرة DMSO وعدة تركيزات من مبيد تتراوح ،001-،1 ميكرومتر (المستويات التي توجد عادة في النظام الغذائي للإنسان). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Discussion

بينما نحن باستمرار تحسين مقايسة لدينا السلوكية الرواية، فقد كان دائما مفيدا للكشف عن تجنب والسلوك انجذاب بالتماس في الزرد اليرقات ^15. وقد أجريت العديد من التجارب لتحسين نتائج الفحص، مثل اللون من التحفيز المستخدمة، العدد المثالي لليرقات لكل حارة، وطول الفحص السلوكية. سابقا، كنا لوحات متعددة جيدا (مع 6 أو 12 بئرا) ^15،17،18. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة قمنا بإنشاء القالب حارة رواية لخلق مساحة أكبر للسباحة اليرقات مما يسمح لنا لجمع عدد أكبر من التدابير السلوكية في فحص واحد ¹⁶ (الشكل 5). وتشمل التعديلات الأخرى الاختلافات في باور بوينت عرض (حركة تغيير أو طول مقايسة) وحجم الممرات المستخدمة (لدينا أيضا قوالب للممرات الضيقة أكثر).

حاليا، وهذا النظام الآلي عالية الإنتاجية هي فريدة من نوعها في قدرتها على قياس طائفة واسعة من السلوكيات في zebrاليرقات عفيش في نفس الوقت مثل السرعة، وتجنب، والقرب من اليرقات الأخرى، وانجذاب بالتماس في لوحات متعددة الحارات. النتائج يمكن الحصول عليها بسرعة ويمكن تحليل عدد كبير من اليرقات في وقت التصوير. النظام على حد سواء غير مكلفة لبناء وسهلة وسريعة لاقامة. وجود قيود من هذا النظام هو أن الحركات 3-D لا يمكن تقييمها في اليرقات الزرد. النظم الآلية التي تتبع الزرد الكبار لديها القدرة 3-D ويمكن التعرف على مجموعة واسعة من السلوكيات مثل حركة أعلى أو لأسفل داخل عمود الماء ^10،19. الحد الآخر هو أن نظام التصوير لدينا حاليا لا الأمثل للتحليلات عالية الإنتاجية في سرعة الفيديو. الفيديو التصوير السرعة هو ممكن عندما وضع الكاميرا إلى دقة أقل ^15، ولكن هذا يحد من تحليل لوحة واحدة.

في استخدام طريقة "لين" التي أنشئت حديثا، يحتاج عدة أجزاء من الفحص ليتم تنفيذها بطريقة دقيقة. عند وضع اليرقات في تيانه الممرات، فمن الأهمية بمكان للتأكد من أن مستوى السائل ضحلة جدا حتى يتم وضع لوحات على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. إذا الممرات مليئة جدا من السائل، فإن اليرقات الهروب إلى المحيط الخارجي للوحة. وبالإضافة إلى ذلك، عند إدراج القالب في الاغاروز، يجب الحرص على خفض العفن ببطء شديد. إذا تم إدراج القالب بسرعة كبيرة جدا، وسوف تشكل فقاعات في الاغاروز وسوف يتم تحديد من قبل J الماكرو صورة كيرقات إضافية. وينصح أنه إذا الممرات الاغاروز لديهم حتى بضعة فقاعات، فمن الأفضل لجعل جديدة.

في المستقبل، نود أن تحسين مقايسة لدينا السلوكية لتحليل السلوكيات المعقدة الأخرى مثل التعلم في اليرقات الزرد ودراسة كيف يمكن أن تتأثر التعلم عن طريق التعرض للسميات والمستحضرات الصيدلانية في التنمية في وقت مبكر. ونحن نعمل حاليا على المقايسات التي قد تكون مفيدة لتحليل سلوك التعلم في النتائج السلوكية التي قد تسهل تحديد أي مناطق الدماغ هيتتأثر بعض المواد السامة أو المواد الصيدلانية خلال التنمية. وقد تم تطوير المقايسات الآلي لقياس السلوكيات في الزرد اليرقات ²⁰ وهذه المقايسات التعلم قد تكون قابلة للتعديل لالفرز الفائق الإنتاجية باستخدام استجابة تجنب قوية في لوحات متعددة الحارات.

نقترح أن هذا الاختبار السلوكية يمكن أن تستخدم في الدراسات المستقبلية لاختبار الآثار التنموية لعدد كبير من الأدوية والمواد السامة. ان مثل هذه الدراسات توفر ثروة من المعلومات حول عوامل الخطر المحددة والمساهمة في وضع المبادئ التوجيهية للصحة والسلامة أفضل للنساء الحوامل والأطفال.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Instant Ocean	That Pet Place	198262
Agarose	Fisher	BP1356-100
Methylene Blue	That Pet Place	214325
Equipment
One well plates	Fisher	12-565-493
Digital camera	Canon	EOS Rebel T1i
Imaging Cabinets	WoodCraft Towers
Laptops	Acer Aspire	Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.
Camera Lens	Canon	EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens
Plastic diffuser	Pendaflex	52345
Software
PowerPoint 2010	Microsoft
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/
Excel 2010	Microsoft
Statistical software	SPSS 20