باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات

Summary

البكتيريا تنتج مركبات يفرز التي لديها القدرة على التأثير في علم وظائف الأعضاء من جيرانهم الميكروبية. نحن هنا وصف شاشة coculture التي تسمح الكشف عن مثل هذه التفاعلات بين الأنواع بوساطة كيميائيا عن طريق خلط التربة مع سلالات الميكروبات مراسل النسخي الفلورسنت من العصوية الرقيقة على وسائل الاعلام الصلبة.

Abstract

في الطبيعة، ونادرا ما توجد البكتيريا في عزلة، بل هي بدلا محاطة مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي تغير البيئة المحلية عن طريق إفراز نواتج الأيض. هذه المركبات لديها القدرة لتعديل وظائف الأعضاء والتفريق بين جيرانهم والميكروبية من العوامل الهامة المحتملة في إنشاء وصيانة للمجتمعات الميكروبية المعقدة. قمنا بتطوير شاشة القائم على مضان coculture لتحديد مثل هذه التفاعلات الميكروبية بوساطة كيميائيا. ينطوي على الشاشة الجمع بين النسخي فلوري مراسل سلالة بالميكروبات البيئية على وسائل الاعلام الصلبة والسماح للمستعمرات أن ينمو في coculture. تم تصميم مراسل النسخي الفلورسنت بحيث السلالة البكتيرية اختيار تتفلور عندما يتم التعبير عن النمط الظاهري معينة من الفائدة (أي تشكيل بيوفيلم، تبوغ والإنتاج عامل الفوعة، الخ.) يتم تنفيذ فحص في ظل ظروف النمو عرجإعادة هذا النمط الظاهري لا يتم التعبير (وبالتالي سلالة المراسل هو عادة nonfluorescent). عندما يفرز الميكروب والبيئية المستقلب الذي ينشط هذا النمط الظاهري، فإنه ينشر من خلال أجار وينشط مراسل بناء الفلورسنت. وهذا يسمح للتحريض-المنتجة للميكروب المستقلب ليتم الكشف عن: هم المستعمرات nonfluorescent معظم الأقرب إلى المستعمرات الفلورسنت. وبالتالي، هذه الشاشة يسمح تحديد الميكروبات البيئية التي تنتج نواتج إنتشاري التي تنشط استجابة فسيولوجية معينة في سلالة المراسل. يناقش هذا المنشور كيفية: أ) تحديد شروط الفحص coculture المناسبة، ب) إعداد المراسل والميكروبات البيئية للفحص، ج) أداء الشاشة coculture، د) عزل المفترضة حمل الكائنات الحية، وه) تأكيد نشاطهم في الشاشة الثانوية. قمنا بتطوير هذه الطريقة للكشف عن الكائنات الحية في التربة التي تنشط بيوفيلم مصفوفة الإنتاج في العصوية الرقيقة

Introduction

ونحن مهتمون في فهم كيف تؤثر على الأيض التي تفرز البكتيريا علم وظائف الأعضاء وتطوير الميكروبات المجاورة. وقد اتسمت العديد من نواتج الأيض للآثار الحيوية النشطة على الميكروبات الأخرى. وتشمل مثالين موصوفة وصفا جيدا المضادات الحيوية، والتي تمنع نمو الميكروبات الأخرى، والجزيئات الاستشعار عن النصاب القانوني، الذي يغير من التعبير الجيني العالمي من الميكروبات الأخرى. ومع ذلك، والبكتيريا تنتج العديد من المنتجات الأخرى الطبيعية جزيء صغير التي ليس لها bioactivities المعروف ^1. نحن نفترض أن البكتيريا تطورت والحفاظ على القدرة على إنتاج بعض هذه المركبات لأنها تسمح لهم لتعديل الفيزيولوجيا الخلوية من الجيران الميكروبية في المجتمعات الميكروبية المعقدة التي توجد داخل معظم البكتيريا.

أنواع الخلايا العصوية الرقيقة

فقد ركزنا دراستنا على التفاعلات الميكروبية بوساطة كيميائيا التي تنطوي BacilLUS الرقيقة. هذا ليس فقط بسبب مكانتها باعتبارها البكتيريا إيجابية الجرام النموذج والأدوات الوراثية الناتجة المتاحة للتلاعب، ولكن أيضا بسبب قدرتها على التمايز إلى أنواع الخلايا تتميز. وتشمل الأمثلة الخلايا التي هي: السباحة؛ إنتاج المصفوفة خارج الخلية ما هو مطلوب لتشكيل بيوفيلم قوية؛ المختصة لتولي DNA من البيئة، وsporulating، من بين أمور أخرى ^2. كل من هذين النوعين من الخلايا يعبر عن regulon النسخي المميزة التي تجعلها من الناحية الفسيولوجية و / أو جسديا متميزة من أشقائهم متطابقة وراثيا. في ظل العديد من الظروف النمو، أنواع الخلايا متعددة تتعايش مختلف المجموعات السكانية الفرعية كما في مستعمرة واحدة من B. الخلايا الرقيقة ^3. على الرغم من أن العديد من أنواع البكتيريا قد تظهر مشابهة نوع من الخلايا عدم التجانس، فإن هذه الظاهرة لا سيما وقد درس جيدا في B. الرقيقة.

على وجه الخصوص، هي الجينات التي الاستعراض الدوري الشاملegulated داخل كل من هذه B. محددة وقد تم تحديد أنواع الخلايا الرقيقة. تحديد هذه الجينات upregulated ضروري لعمل الموصوفة هنا لأن الكثير من هذه الظواهر الميكروبية من الفائدة من الصعب أو من المستحيل مراقبة مباشرة. على سبيل المثال، لا يمكننا الكشف عن سمة بصريا مثل السباحة على الصلبة (1.5٪) لوحات أجار، على الرغم من جزء من السكان من B. الخلايا الرقيقة إنتاج سياط في ظل هذه الظروف ^3. مثال آخر هو بيوفيلم مصفوفة الإنتاج. يمكن تصور إنتاج مصفوفة من قبل مستعمرة مورفولوجيا (كما أنه يؤدي إلى المستعمرات متجعد ظاهريا)، ولكن فقط على بعض المتوسطة النمو، وفقط بعد عدة أيام من النمو ^4. ومع ذلك، من خلال معرفة الجينات التي upregulated خلال التمايز، يمكننا بناء صحفيين النسخي والتي تكون بمثابة علامات لتمايز الخلايا إلى أنواع الخلايا هذه.

بنيات مراسل

هذه ر الفلورسنتتتكون صحفيين ranscriptional من المروجين لجينات معينة الخلية نوع القيادة إنتاج الجين المراسل، على سبيل المثال بروتين فلوري. وتشمل الأمثلة P-YFP _حاج (للسباحة الخلايا)، _P-تابا YFP (للخلايا المنتجة للمصفوفة بيوفيلم)، _وP-sspB YFP (لsporulating الخلايا)، حيث P _س يشير إلى منطقة المروج لجين س. تتكامل هذه التركيبات مراسل في مكان محايد على كروموسوم (الشكل 1 و انظر أدناه) بحيث يتم ترك التنظيم الأم من النمط الظاهري سليمة. ومع ذلك، والآن عندما خلية يعبر عن هذا النمط الظاهري، فإنه يعرب أيضا عن بروتين فلوري. هذا يوفر تصور بسهولة قراءة من تفعيل سيما السلوك المظهري، مما يسمح لنا للكشف عن الميكروبات التي تستخدم لتنشيط هذه الاستجابة الفسيولوجية. على الرغم من أن مثل هذه صحفيين تستخدم عادة في علم الأحياء الدقيقة، فإنها لم تطبق على نطاق واسع في الشاشات لidentifوقد وصفت التفاعلات الأيضية ذ بين الميكروبات قبل هذه الطريقة ^5.

هناك عدد من الاعتبارات المهمة في تصميم وبناء من نوع خاص خلية سلالات المراسل. لقد استخدمت صحفيين الفلورسنت النسخي حصرا، على الرغم من أن أنواع أخرى من بنيات ممكنة بالتأكيد. نحن لا نشجع استخدام اندماج متعدية كعلامات لنوع من الخلايا في التمايز الشاشة لدينا، ولكن لسببين: 1) الرغبة في مغادرة نوع معين من البروتين الخلية الأم رابط الجأش، و 2) الاعتراف بأن منتشر، خلية وسوف يكون من الأسهل مضان واسعة للكشف عن نقاط والمترجمة داخل الخلايا (مشتركة مع اندماج متعدية).

مراسل اختيار الجينات

بعد البت في استخدام النسخ باعتبارها من القراءة، يجب تحديد الجين مراسل (على سبيل المثال LacZ، مضان، أو luciferase المراسل). LacZ له ميزة خاصة التي تحتاج إلى أقلأوتوماتيكية معدات للكشف، ولكن هناك احتمال أكبر بكثير من ايجابيات كاذبة بين الميكروبات البيئية. في أيدينا، كان مستوى خلفية لاك ⁺ الكائنات بين الميكروبات في التربة باهظة عالية (>> كان 10٪ من الميكروبات في التربة الأزرق (لاك ⁺⁾ على لوحات X-غال؛ لا تظهر البيانات). فمن الممكن أنه من خلال المعايرة تركيز X-غال في المتوسط، يمكن أن يكون الأمثل لهذا تسمح باستخدام مراسل X-غال، على الرغم من أننا لم يحاول ذلك. يوفر luciferase المراسل حساسية عالية للكشف عن ومراسل معظم متعامد: هناك تقريبا أي فرصة من الميكروبات البيئية كونها الانارة بطبيعتها. ومع ذلك، وجدنا أنه من الصعب تحديد الأجهزة في مؤسستنا التي سمحت الكشف التلألؤ عبر لوحات بيتري بأكملها، كما تم تصميم معظم لمسح المناطق المترجمة فقط في لوحات متعددة جيدا. قد يكون هناك أيضا مضاعفات في تصور المستعمرات الانارة بطريقة تسمح أيضا الجسدية في وقت واحد هوolation الكائنات حمل. أثناء استخدام مؤتمنة قد جعلت هذا الأمر ممكنا، ونحن بدلا من ذلك انتخاب لاستخدام النسخي صحفيين الفلورسنت، والتي ثبت للعمل في B. الرقيقة، شريطة حساسية كافية للكشف وانخفاض معدلات إيجابية كاذبة بين الكائنات الحية في التربة، ويسمح لهم باستخدام الأجهزة المتوفرة بسهولة من كلا التصور وإجراءات العزل.

اختيار Fluorophore

سوف fluorophore محددة مختارة تعتمد على الأنواع البكتيرية الخاصة بك، والمتوسطة النمو أجار الذي تستخدمه، ومرشح مضان خاص يحدد المتاحة لديك. مع الأجهزة لدينا، وجدنا أن كلا من ب. الرقيقة مستعمرات أنفسهم وأجار كانوا نمت على معارضها أقل مضان الخلفية عندما استخدمت YFP (بروتين فلوري الصفراء) مرشحات، مما يجعل أن مراسل متفوقة على GFP (بروتين الفلورية الخضراء) في أيدينا. استخدام كودون من البروتينات الفلورية هيالأمثل في كثير من الأحيان لحقيقيات النوى، مما يجعل من المهم لاختيار fluorophore المعروفة إما من الأدب للعمل في الأنواع البكتيرية الخاصة بك، أو لاختباره بشكل صريح باستخدام المروج التأسيسية. وهناك عدد كبير من المتغيرات المتطورة باستمرار بروتين فلوري المتاحة حاليا ^6، والتي تم استعراضها في عدد من المصادر ^7،8، والبعض منها توفير التوجيه صراحة على اختيار بروتين فلوري المناسبة لتجربتك ^9.

اختيار المروج

فإن اختيار المروج تعتمد إلى حد كبير على نوع من الخلايا أو النمط الظاهري في المصالح. للكائنات مثل B. الرقيقة، وقد وضعت بعض الخلايا من نوع الجينات مراسل محددة في الأدب. لسلالات بكتيرية أخرى، ودراسة البيانات ميكروأري أو النسخي وسوف يكون من الضروري توفير المعلومات حول الجينات التي upregulated للغاية في ظل الظروف حيث نوع من الخلايا اهتمامك طو تجلى. المفهرسة دراسة حديثة نسخ من B. الرقيقة تحت 104 ظروف النمو المختلفة باستخدام ميكروأرس تبليط ^10. تقدم هذه الورقة معلومات شاملة عن الجينات التي upregulated للغاية في ظل ظروف مختلفة، والتي لا تقدر بثمن لأقل الظواهر تتميز جيدا.

بدلا من رسم خرائط دقيقة لمناطق المروج كل الجينات في المصالح، ونحن عادة ببساطة استخدام تسلسل غليان 200-500 المنبع من الجين كما المروج. طول التسلسل الدقيق يعتمد على السياق الجيني: وتستخدم المناطق أقصر عند الضرورة لتجنب بما في ذلك المناطق الترميز المنبع من إطارات القراءة المفتوحة المجاورة.

مواضع محايدة والتكامل

كيفية الحفاظ على بناء مراسل في السلالة البكتيرية الخاصة بك يصبح السؤال النهائي في تصميم الفلورسنت سلالة مراسل النسخي. في البكتيريا، وكثيرا ما تحتفظ الجينات ذات الاهتمامعلى البلازميدات باستخدام اختيار المضادات الحيوية. ومع ذلك، فإنه قد لا يكون من الممكن استخدام المضادات الحيوية خلال coculture دون قتل الميكروبات البيئية. إذا تمسك البلازميدات ثابت في الأنواع البكتيرية الخاصة بك، قد يكون من الممكن تنمو البكتيريا الخاصة بك تحتوي على مراسل المنقولة البلازميد في وجود المضادات الحيوية لإعداد المراسل الخاص لفحص، ومن ثم القضاء على المضادات الحيوية خلال coculture نفسها على أمل أن البلازميد سوف يتم الاحتفاظ بما فيه الكفاية للسماح لمضان. ومع ذلك، إذا فقدت البلازميدات بسهولة في البكتيريا، أو تضيع في ظل ظروف الإجهاد، وهذا لن يكون خيارا قابلا للتطبيق. في كثير من الحالات، فإن أفضل حل هو دمج بناء على مراسل الكروموسوم البكتيري، والذي يسمح صيانة مستقرة لمراسل حتى في غياب التحديد. من أجل التكامل لعدم تعطيل التعبير العادي أو تنظيم الجينات اهتمامك، ونحن نوصي الاندماج في موقع خارج الرحم على الكروموسوم الذي كاليفورنيان بمثابة "مكان محايد". في B. الرقيقة هذه المواقع التكامل هي الجينات التي - عندما تحور - ينقل النمط الظاهري في بعض وسائل الاعلام الحد الأدنى (السماح الكشف عن هويته integrants دون اختيار المضادات الحيوية)، ولكن لا يغير النمو أو معدلات تبوغ في الوسائط الغنية، وتشمل مثل هذه الجينات كما amyE، هلال، thrC، pyrD، gltA، وساكا (نقل القدرة على الاستفادة من النشا، β-galactosides، ثريونين، اليوراسيل، الغلوتامات، والسكروز، على التوالي) ^11-13.

بينما التكامل في هذه الجينات قد استخدمت بشكل موثوق لسنوات عديدة في B. الرقيقة (وخاصة في amyE وهموم)، قد لا تكون متاحة للجينات في العديد من الأنواع البكتيرية الأخرى المعرفة مماثلة. استخدام مواقع الحجز فج هي البدائل كبيرة لمواقع التكامل الكروموسومات محايدة: لدينا العديد من أنواع محددة ^14-16، وكذلك المواقع تكامل العامة مثل موقع المرفق Tn7 (تى تى Tn7)تم تحديدها واستخدامها لالإدراج الجينات في العديد من الأنواع البكتيرية ^17،18.

الميكروبات البيئية

نستخدم التربة كمصدر مباشر من الميكروبات البيئية للشاشة coculture لدينا. يحتوي على التربة والتنوع عالية من الميكروبات، والعديد من هذه الكائنات الحية هي مصدر غني للمنتجات الطبيعية. باستخدام المعلقات السائلة وضعها مباشرة على لوحات لدينا الفلورسنت سلالة مراسل النسخي (دون العزلة مسبقة من البكتيريا من التربة)، ونحن تبسيط كبير في المنهج التجريبي. يمكن إما أن تستخدم التربة مباشرة بعد الحصاد، أو يتم تجميدها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. استخدام الفوري لديه ميزة أن تنوع أكبر من الميكروبات يمكن أن يحتمل زراعتها، بما في ذلك تلك التي لن تنجو تجميد جيدا. فمن لديه عيب أن تركيز الكائنات الحية في التربة الصالحة للزراعة من هذه العينات غير معروف، وزيادة عدد من لوحات الشاشة التي يجب استخدامها. ديلاستخدام عايد لديه ميزة أن وت م / مل لكل مصدر التربة يمكن تحديد مقدما، والسماح لعدد من المستعمرات الأمثل التي يمكن زراعتها على كل لوحة الشاشة. ومع ذلك، فإنه يتطلب أن تكون الكائنات الحية في التربة قادرة على البقاء التجمد.

نلاحظ أن تنويع تجمع محفز يجري بحثها (أي مصادر التربة) ويبدو أن يكون أكثر فعالية في تحديد التفاعلات بين الأنواع الجديدة من الفحص المتعمق على نفس التربة: لوحظ تنوع أكبر في النشوء والتطور الضربات المحددة في مصفوفة لدينا شاشة الحث على النحو تم فحص مصادر إضافية التربة بدلا من فحص مصادر التربة نفسها أكثر شمولا (EA شانك وR. Kolter، كلية الطب بجامعة هارفارد، نتائج غير منشورة).

نظرة عامة

النهج وصفنا هنا واضح وصريح من حيث المتطلبات التقنية. أنه ينطوي على: 1) بناء مراسل النسخي الفلورسنت في B. الرقيقة أوالأنواع البكتيرية الأخرى ذات الاهتمام، 2) تحديد الشروط التي لم يتم تنشيط هذا المراسل، 3) إعداد aliquots من هذه السلالة مراسل والكائنات ليتم عرضه (في التربة حالتنا، ولكن مصادر أخرى يمكن استخدامها بدلا من ذلك)، 4) خلط هذه مجموعتين من الميكروبات على وسائل الاعلام الصلبة، 5) تحديد وعزل المفترضة حمل الكائنات الحية، و6) مؤكدا أن هذه الكائنات لا بل تنشيط هذا النمط الظاهري في الشاشة الثانوية. مرة واحدة تم تحديدها، وهذه الكائنات الحية ونواتج تفاعلاتها تزويدنا بالأدوات الكيميائية لتعديل السلوك البكتيرية، لدراسة فسيولوجيا بكتيريا والتفاعلات الميكروبية، ويحتمل أن تكون للعمل السقالات الرواية بالنسبة للمركبات العلاجية في المستقبل.

Protocol

1. تحديد الجينات مراسل وبناء مراسل نيون الترانسكربتي

لB. الرقيقة:

1. راجع المقالة إن الرب في اشارة ¹⁹ لبروتوكول تصف بناء صحفيين الفلورسنت النسخي في العصوية الرقيقة.

الأنواع البكتيرية الأخرى:

1. تحديد الجين الذي تم upregulated خلال الاستجابة الفسيولوجية من الفائدة. وهذا يمكن أن تستند إلى تحليل الأدب القائمة أو النسخي للميكروب في ظل ظروف معينة.
2. بناء مراسل النسخي الفلورسنت لهذا الجين ليكون بمثابة وكيل للتغيير في النمط الظاهري. وينبغي أن يشمل هذا بناء المروج من هذا الجين upregulated القيادة إنتاج بروتين فلوري المناسب (انظر الشكل 1).
3. دمج هذه التركيبة في مكان محايد على الصبغي. هذا يضمن أن ريج الأملا تعطل ulation من الجينات في المصالح، ويتجنب الحاجة إلى آليات اختيار البلازميد (مثل المضادات الحيوية) التي قد تتداخل مع نمو الميكروبات البيئية.

2. تحديد شروط Coculture

لB. الرقيقة _P-تابا YFP مراسل:

1. استخدام 0.1X LB، لينوكس (1 ز تريبتون، 0.5 ز خلاصة الخميرة، 0.5 غرام لكل لتر كلوريد الصوديوم) المتوسطة لهذا المراسل، منذ B. الرقيقة مصفوفة الإنتاج هو الحد الأدنى لوريا على مرق ^20. هذه الوسيلة تسمح B. المستعمرات الرقيقة لتنمو إلى حجم يمكن ملاحظتها دون المليمتر ولكن، في الوقت الذي تسمح أصناف متنوعة من التربة لتنمو ^5.
2. تشمل 100 ملي اجتماعات الأطراف العازلة للحد من تغييرات درجة الحموضة المحتملة.

الأنواع البكتيرية الأخرى:

1. استخدام البيانات المنشورة النسخي أو تجريبيا اختبار الظروف الثقافة المختلفة لتحديد واحد حيث ينمو الميكروب ولكن activatioن لمراسل الفلورسنت لا يكاد يذكر (للسماح تفعيله ليتم الكشف عن عندما يزرع سلالة مراسل في coculture مع الميكروبات حمل.)
2. استخدام المتوسطة مع المحتوى الغذائي منخفض (نسبة إلى وسائل الإعلام الميكروبيولوجية الغنية تقليديا) عند فحص الميكروبات البيئية من البيئات الشحيحة (مثل التربة)، لأن العديد من البكتيريا الشحيحة التي لا تنمو عندما قدم مع ظروف غذائية عالية ^21. وسيط المغذيات منخفضة يقلل أيضا من حجم مستعمرة، وزيادة الإنتاجية من الشاشة.
3. تحديد المتوسطة مع انخفاض مضان الخلفية وضوح بصري جيد.
4. تحسين درجة حرارة النمو للسماح كلا من سلالة مراسل والميكروبات البيئية في النمو في وقت واحد.
5. النظر في إضافة وكيل التخزين المؤقت. فإن استخدام عازلة في لوحات الحد من إمكانية اكتشاف التغيرات في الرقم الهيدروجيني بوساطة الفيزيولوجيا ^22، ما لم يكن هذا التفاعل هي التي تهم.

3. إعداد مراسل مأخوذة

لB. الرقيقة _P-تابا YFP مراسل:

1. خط مراسل سلالة من -80 ° C الأسهم المجمدة على طبق من ذهب LB الطازجة باستخدام مسواك العقيمة أو قضيب عصا.
2. تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
3. أداء التخفيفات التسلسلي في الثقافة السائل لتقليل مضان الخلفية الناشئة عن النمو على وسيط الصلبة:
   1. تطعيم ثقافة السائل 5 مل من LB وتنمو مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية.
   2. عندما تصل الثقافة إلى OD ₆₀₀ ~ 0.6، يخفف إلى 5 مل LB الطازجة إلى OD ₆₀₀ من 0.02.
   3. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية مع اهتزاز مرة أخرى حتى يصل الثقافات OD ₆₀₀ ~ 0.6.
   4. تكرار التخفيفات النمو المسلسل مجموعه 3X.
   5. دعونا الثقافة التخفيف المتسلسل النهائي تنمو إلى OD ₆₀₀ ~ 0.4.
4. إضافة الجلسرين إلى 15-20٪.
5. قسامة 50-200 ميكرولتر إلى 0.5 مل أنابيب microfuge وتجميد في -80 درجة مئوية.
6. أماهكه مأخوذة يعادل لسلالة الأم nonfluorescent لمراسل (وسوف تكون هناك حاجة خلال الفحص الثانوي).

الأنواع البكتيرية الأخرى:

1. استخدام الخلايا التي تحتوي على مضان خلفية منخفضة (أي تزرع في ظل ظروف حيث هناك القليل من التعبير المروج المستخدمة في المراسل).
2. جعل وتجميد مأخوذة تحتوي المعروف وت م / مل (مستعمرة تشكيل وحدة في مل) من سلالة مراسل بحيث يمكن زراعتها عدد مناسب من المستعمرات على كل لوحة الشاشة coculture (انظر المقطع أعلاه للحصول على التفاصيل).
3. جعل مأخوذة يعادل لسلالة nonfluorescent الأم (أنها سوف تكون مطلوبة أثناء الفحص الثانوي).

4. الحصول على عينات التربة

1. جمع التربة إلى أنابيب مخروطية معقمة أو أكياس معقمة باستخدام ملعقة، ونبذ أعلى 0.5 سم من التربة السطحية المكشوفة.
2. إضافة ملحي معقم (0.85٪ كلوريد الصوديوم) بنسبة 10 مل لكل 1 غراممن التربة لجعل الطين التربة.
3. حدد طريقة لطرد البكتيريا من جزيئات التربة: أ) استخدام الفوري من عينة طازجة أو ب) استخدام تأخير بعد تجميد العينة.
   1. للاستخدام الفوري، الطين دوامة لمدة 1 دقيقة.
   2. للاستخدام المتأخر، مزج الطين التربة في الخلاط لمدة ثلاث دورات 1 دقيقة، ووضع جرة خلاط على الجليد لمدة 1 دقيقة بين مساند دورات مزج.
4. دعونا الطين التربة تسوية ل~ 1 دقيقة.
5. نقل الطبقة المائية العليا لأنبوب جديد.
6. إضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 15-20٪.
7. قسامة 50-200 ميكرولتر إلى 0.5 مل أنابيب microfuge وتجميد في -80 درجة مئوية.

5. تحديد وت م / مل من اللبن مراسل ومأخوذة التربة

1. ذوبان الجليد والتربة ومراسل قسامة المجمدة. يمكن إذابة الميكروبات في التربة على الجليد. لأن B. الرقيقة lyses في 4 درجات مئوية، يجب إذابة تلك مأخوذة بسرعة في RT لتقليل الوقت الذي يقضيه في درجة حرارة منخفضة.
2. جعل اثنين من تكرار الدوري الايطاليالتخفيفات لتر (10 ^-8) في 0.1X LB أو غيرها العازلة متساوي التوتر.
3. لوحة 5 البقع ميكرولتر من كل تخفيف المسلسل على لوحات أجار من نفس المتوسطة التي سيتم استخدامها لفحص coculture.
4. تنمو في RT (أو درجة الحرارة التي سوف تستخدم لفحص).
5. في اليوم التالي، عد عدد من المستعمرات في كل بقعة وحساب وت م / مل من كل من مأخوذة المجمدة.

6. تأكيد قسامة تركيزات لوحات شاشة انتشار

1. ذوبان الجليد قسامة المجمدة كما في الخطوة 5.1.
2. تمييع إلى 1 × 10 ^5، 2.5 × 10 ^5، 5 × 10 ^5، 1 × 10 ^6، و 2.5 × 10 ⁷ خلية / مل.
3. إضافة 50 ميكرولتر من كل بقعة التخفيف إلى مركز لوحات فردية. وينبغي لهذه الغلة لوحات مع الأمثل المحسوب ل25،000 المستعمرات في لوحة، وكذلك 2 - و 5 - أضعاف أكثر وأقل، مما يتيح أفضل التخفيف الفعلي يحدد لاحقا.
4. إضافة حوالي 20 زجاجية معقمة (3 مم) حبات من قبل التنصت بلطف لهم على طبق من ذهب. توفير مزيد من الخرز حتى توزيع المستعمرات عبر لوحة من الزجاج رش عازمة لا.
5. تنتشر الخلايا عن طريق الحفاظ على لوحات الفوق ويهز لهم ذهابا وإيابا، وتناوب عليها أثناء العمل، حتى يتم امتصاص السائل. لا تستمر يهز حبات مرة واحدة لوحة جافة، وإلا فإنه سوف تبدأ لقتل البكتيريا.
6. الوجه وحات مرارا وتجاهل حبات في كوب النفايات المحتوية على الإيثانول.
7. السماح لوحات تنمو في هذا الوقت من فحص الخاص بك (على سبيل المثال 24 ساعة) في درجة الحرارة الصحيحة للفحص الخاص بك (على سبيل المثال 24 ° C / RT).
8. باستخدام المجسام تشريح، حساب عدد المستعمرات في اثنين أو أكثر من حقول نظر.
9. حساب عدد المستعمرات في المنطقة، وتحديد كيفية العديد من المستعمرات هي على كل لوحة.
10. ضبط التخفيفات في المستقبل عند الضرورة. العدد الفعلي للمستعمرات ليس مهما مثل وجود نفس العدد في كل لوحة شاشة قابلة للمقارنة.

= "jove_title"> 7. إعداد لوحات Coculture

1. ذوبان الجليد قسامة مراسل (وقسامة التربة إذا جمدت) كما في الخطوة 5.1.
2. تمييع مراسل (لتركيزات الأمثل في القسم 6) في 0.1X LB أو غيرها من المواد الغذائية المنخفضة، حل متساوي التوتر.
   1. لالتربة المجمدة: تمييع لتركيز الأمثل في الفرع 6 في 0.1X LB أو غيرها من المواد الغذائية المنخفضة، حل متساوي التوتر.
   2. لتربة جديدة: جعل التخفيفات من الطين التربة جديدة، استنادا إلى التنبؤ بأن وت م / مل من الطين التربة يمكن أن تتراوح بين 10 ^-4 إلى 10 ^-9 وت م / مل.
3. بقعة 50 ميكرولتر من التربة ومراسل التخفيفات على المركز من لوحة الشاشة coculture. أيضا، لوحة التربة وحده وحده ومراسل والضوابط.
4. انتشر استخدام الخرز الزجاجي كما هو موضح في الخطوة 6،4-6،6.
5. إذا كانت هناك ظروف النمو المعروفة التي تنشط الخاص الفلورسنت المراسل، أو لوحة خط مراسل الخاص في ظل هذه الظروف وتنمو لاستخدام كعنصر تحكم إيجابية خلال الفرز.
6. احتضان عند 24 درجة مئوية لمدة 24 - 28 ساعة (أو حسب الاقتضاء لجهودكم مراسل / الفحص)

8. لوحات الشاشة CoCulture لالإسفار

1. باستخدام إضاءة brightfield، والتركيز المجسام بحيث المستعمرات حادة.
2. ننظر إلى لوحات التربة فقط لتحديد ما إذا كان عينة التربة الخاصة بك قد autofluorescent المستعمرات. إذا كان الأمر كذلك، قد تؤدي هذه التربة في نسبة عالية من ايجابيات كاذبة (مع زيادة مصاحبة في الفحص الثاني).
   1. استخدام نسبة عالية من مراسل: التربة في لوحات coculture لزيادة فرصة أن محفز سوف تكون محاطة المستعمرات مراسل متعددة، مما يقلل من فرصة وسوف يتم الكشف عن ايجابيات كاذبة كما هو و(الشكل 2).
   2. استخدام بروتين فلوري مختلفة (واحد التي تنبعث في قناة مختلفة).
3. تحديد توقيت الفحص. بالنسبة لمعظم الصحفيين جديدة، توقيت الاستقراء المحتملة غير معروف، وبالتالي يجب أن تحدد تجريبيا.
   1. بدء الكشف عن مضان في أقرب وقت أصبحت المستعمرات واضحة للعيان مع المجسام تشريح (التكبير 30X ~) ومواصلة النظر في لوحات بشكل دوري حتى توقف النمو و / أو يصبح مضان الخلفية عالية جدا.
   2. مرة واحدة يتم تحديد النافذة وقت الحث المحتملة لمراسل وجه الخصوص، ينبغي أن تكون مماثلة لجميع لوحات تحتوي على coculture أن المراسل، وتبسيط رصد لوحات الشاشة. لB. مراسل الرقيقة _P-تابا YFP، والوقت المناسب للنظر في لوحات ما بين 24-28 ساعة بعد طلاء الخلايا، وبالنسبة للB. P الرقيقة مراسل _sspB-YFP، فمن بين 26-32 ساعة من النمو.
4. تعظيم حساسية مضان الخاصة بك:
   1. ضمان مضان الخاص تشريح نطاق هو في غرفة مظلمة أو محاطة ستائر التعتيم. سوف تحريض من المرجح أن تكون أقل كثافة من FP أنتجت جوهري ويتطلب سينسي أكبرtivity للكشف.
   2. إتاحة الوقت للمصباح مضان لتحقيق الاستقرار وعينيك على التكيف مع الظلام قبل محاولة للكشف عن مضان من لوحات coculture الخاص بك (على الأقل 1-2 دقيقة).
5. باستخدام مراقبة إيجابية (إذا كان لديك واحدة)، تأكد من أن التكبير الذي تستخدمه يسمح لك لاكتشاف مضان. التكبير هو عادة أفضل إذا مجال نظرك ما يقرب من 30-50X الخاص قطر مستعمرة نموذجية (200-400X).
6. إيقاف الضوء الساطع وفتح مصراع لمضان الخاص بك.
7. بعد عينيك عدلت إلى الظلام، التحرك ببطء لوحة ذهابا وإيابا عبر حقل نظرك، وتبحث عن النقاط المضيئة.
   1. تبدأ من أعلى لوحة واستخدام نمط متعرج لنقل جنبا إلى جنب لوحة وأنت تتحرك نحو الجزء السفلي من اللوحة.
   2. الممارسة تتحرك لوحة في brightfield للحصول على شعور لكيفية ببطء للانتقال إلى لوحة، والتأكد من أنك تغطي سور بأكملهاتواجه المنطقة.
   3. نقل لوحة ببطء يكفي أن المستعمرات لا تصبح ضبابية. فمن الأفضل أن oversample السطح بدلا من المناطق تفوت.
   4. بعد الاجتياح الكامل واحد، وتحويل لوحة 90 ° وتكرار. العين البشرية هي جيدة بشكل ملحوظ في الكشف عن مضان خافت حتى من خلال هذا الأسلوب.
8. إذا كنت الكشف عن مضان، يتوقف عن الحركة لوحة والعودة والعثور على منطقة الفلورسنت.
9. تحويل brightfield على ببطء، تحديد ما إذا كان يرتبط مضان مع مستعمرة بكتيرية (وليس المخلفات التربة autofluorescent أو مكونات وسائل الإعلام). إذا كان الأمر كذلك، المستعمرات nonfluorescent الأقرب إلى مستعمرة الفلورسنت هي كائنات حمل المفترضة.

9. عزل المزعومين الإقناع الكائنات

1. وقد تم تحديد مرة واحدة بفعل (الفلورسنت) المستعمرات، وعزل تلك المستعمرات إفراز مركبات حمل.
   1. إذا كان تركيز عال بما فيه الكفاية من المستعمرات مراسل تتزايد على لوحة(> 0.5:1 مراسل: وت التربة)، وسوف يكون محاطا المستعمرات على حث المفترضة من قبل المستعمرات الفلورسنت متعددة (مرة أخرى، انظر الشكل 2).
   2. في الحالات التي يكون فيها تعقيد النمو coculture يجعلها غامضة والتي هي مستعمرة محفز، عزل عدة مستعمرات على حث المحتملة لاختبار لاحقة في الشاشة الثانوية.
2. توطين المستعمرات كنت ترغب في اختيار في مركز مجال الرؤية.
   1. إذا كانت قريبة إلى حافة اللوحة، وتناوب لوحة بحيث الشفة من لوحة بعيدا عن يدك المهيمنة (أي إذا كنت اليد اليمنى، ووضع الشفة من لوحة على اليسار). هذا يسمح لك الاقتراب من المستعمرات في زاوية منخفضة، مما يحسن من دقة التقاط الخاصة بك.
3. وضع لوحات جديدة لخط الكائنات حمل المفترضة إلى مكان قريب، وكذلك كوب النفايات لتجاهل نصائح المستخدمة في.
4. مغادرة مصباح مضان على، وتحويل الضوء الساطع ببطءعلى، حتى يتسنى لك أن تكون قادرة على تحديد (عن طريق الشكل والموقف)، ومستعمرة الفلورسنت والكائنات المحيطة حمل المفترضة. قد تحتاج إلى الانتقال ذهابا وإيابا مع ضوء عدة مرات لتكون قادرة على التعرف على مستعمرات كنت ترغب في اختيار عندما لا يكون هناك مضان والضوء الساطع فقط.
5. استخدام قضيب الزجاج (200 ملم طولا × 5 مم قطر) لالتقاط العقيمة، على مدار 200 ميكرولتر طرف جل التحميل والاحتفاظ بها مثل قلم رصاص. هذا هو أداة قطف سوف تستخدم لعزل المستعمرات الفردية.
6. بقية النخيل الخارجي الخاص بك ضد المرحلة لتحقيق الاستقرار على سطح العمل. وضع يدك الأخرى على الداخلية، الجانب إبهام يدك لتحقيق الاستقرار أداة قطف الخاص بك.
7. إذا لزم الأمر، والوجه مرة أخرى بين وجهات النظر ومضان brightfield لتحديد المستعمرات كنت ترغب في اختيار.
8. حفظ غيض ماصة فوق سطح لوحة، وتحريكه في مجال نظرك وتركز ذلك فوق مستعمرة كنت ترغب في اختيار. وسوف يكون غيض من التركيز.
9. باستخدام الحافة الخارجية من يدك (والذي يستريح على المسرح المجهر أو سطح العمل)، الإرتكاز غيض ماصة ببطء وصولا الى مستعمرة ويمكن الحصول عليها. مسها طفيفة جدا، في محاولة للحد من كيفية العديد من المستعمرات الأخرى الاتصالات غيض.
10. دون تناوب أداة قطف، خط على جزء من لوحة جديدة. تنتشر مع لمسة ناعمة لتجنب تلاعب آغار. لأن عدد الخلايا نقلها بواسطة هذه الطريقة هي صغيرة جدا (المستعمرات هي أصغر بكثير من التلاعب عادة)، سوف يشكل حلقة في سلسلة متواصلة واحد يؤدي إلى مستعمرات معزولة.
11. كرر هذه العملية مع غيرها من الكائنات الحية على حث المفترضة.
12. احتضان لوحات عند 24 درجة مئوية (أو درجة حرارة الفحص الخاص بك).

10. خط المزعومين الإقناع الكائنات الحصول المستعمرات المعزولة واحدة

1. باستخدام المجسام، وتحديد - على أساس هيكل مستعمرة أو التشكل - ما إذا كانت هناك أنواع مختلفة مستعمرة الواردة في كل من دائرة الهجرة والجنسية الخاصة بك التقطت المفترضةucing الكائنات الحية.
   1. ننظر المستعمرات باستخدام المرحلة حيث يمكنك إلقاء الضوء على المستعمرات من كل من أعلاه، وكذلك من الأسفل للكشف عن الاختلافات مستعمرة المحتملة.
2. Restreak كل نمط شكلي مختلفة على لوحة جديدة واحتضان حتى نمت.
3. Restreak احد مزيد من الوقت والسماح النمو. إذا استمرت morphotypes مختلفة، والاستمرار في restreak إلى النقاء.

11. إعادة اختبار المزعومين الإقناع الكائنات في الشاشة الثانوية

1. إعادة اختبار جميع الكائنات الحية حمل المفترضة في الشاشة الثانوية لتحديد ما يتم تفعيل النسخي مراسل الفلورسنت. تتكون الشاشة الثانوية حشيش microcolonies من الفلورسنت سلالة مراسل النسخي، جنبا إلى جنب مع لوحات التحكم، والتي يتم تصحيحها على الكائنات الحية حمل المفترضة أو رصدت.
2. تشكيل ثلاث لوحات مماثلة: واحدة تحتوي على العشب مستعمرة مجهرية من الفلورسنت سلالة مراسل النسخي (في نفس التركيز وكان يستخدم خلال الفحص coculture ق)، واحدة تحتوي على العشب مستعمرة مجهرية من نوع السلالة البرية الوالدين دون مراسل مضان، واحدة لا تحتوي على الحشيش.
   1. بمناسبة قمة الجزء الخلفي من كل لوحة لتحديد اتجاه اللوحة.
   2. إضافة علامات الموضعية للبقع / البقع، ويمكن اختبار ما يصل إلى عشرة الكائنات حمل المفترضة على كل مجموعة من لوحات (الشكل 3).
   3. مأخوذة العشب ذوبان الجليد (مراسل وسلالة الأم nonfluorescent) كما في الخطوة 5.1.
   4. نشر 50 ميكرولتر من التخفيف 5 × 10 ⁵ خلية / مل على لوحات في الحديقة (أو التخفيفات الأمثل غيرها) باستخدام الخرز العقيمة كما في الخطوة 6.4.
   5. السماح لوحات الجافة.
3. التصحيح أو بقعة المفترضة حمل الكائنات الحية:
   1. حدد الترقيع إذا كان المطلوب اتباع نهج أسهل وأسرع، وكان مقبولا لديها عدد أقل دقة من الخلايا المودعة. لرأب الصدع:
      1. لمس مسواك العقيمة إلى المستعمرة لاختبار - لا تلتقط كل الخلايا.
      2. التصحيح (جعل خط صغير) على لوحة فارغة.
      3. كرر التصحيح مع مسواك جديدة على لوحة المراسل.
      4. كرر التصحيح مع مسواك جديدة على لوحة التحكم.
   2. حدد اكتشاف إذا كان المطلوب نهج الكمي وقابلة للتكرار. اكتشاف يسمح عدد الخلايا المودعة إلى أن تطبيع (أنظر المرجع 5 للحصول على تفاصيل كاملة)، ويسمح للقوة النسبية للكائنات الحية على حث مختلفة ليتم مقارنتها. على الفور:
      1. في resuspend المفترضة حمل الكائنات الحية في 1 مل من السائل في وسائل الإعلام كفيت بلاستيكية معقمة.
      2. اتخاذ OD ₆₀₀ من resuspensions.
      3. باستخدام الصيغة X = 250 ÷ (OD _600-،5)، إضافة X حجم إعادة تعليق لكل 500 ميكرولتر من السائل المتوسطة للحصول على حل مع OD ₆₀₀ من 0.5. هذه الطريقة يبسط الخطوات المطلوبة عند تنفيذ pipetting لالتخفيفات متعددة لتطبيع OD في أنه يمكنك استخدام نفس حجم (500 ميكرولتر) لجميع dilutants الخاص بك.
      4. بقعة 1 ميكرولتر من كل إعادة تعليق OD-تطبيع إلى كل من لوحات الثلاثة.
4. اسمحوا ينمو بمعدل 24 درجة مئوية لمدة 24-28 ساعة (أو حسب الاقتضاء لجهودكم مراسل / الفحص).
5. استخدام المجهر الفلورسنت تشريح لتحديد الكائنات حمل المفترضة التي تنشط الخاصة بك سلالة مراسل الفلورسنت ولكن ليس لديك سلالة الرقابة الأبوية. هذه العزلات هي الفعالية إيجابية الخاص - الميكروبات البيئية التي تفرز مركبات التي تحفز على النمط الظاهري اهتمامك.

النتائج

تم استخدام هذه الشاشة لتحديد الكائنات الحية في التربة إفراز مركبات التي تغير فسيولوجيا B. الرقيقة. نتائج وصفها هنا التركيز على نوع من الخلايا المنتجة للمصفوفة B. الرقيقة، التي تنتج البروتين وexopolysaccharide التي مطلوبة من أجل تشكيل بيوفيلم قوية في هذه البكتيريا. ا...

Discussion

واحدة من القيود المتأصلة في هذا البروتوكول هو أنه يعتمد على cultivability الكائنات الميكروبية. كما تم توثيقه جيدا ^24، معظم الحياة الميكروبية على هذا الكوكب لا يمكن (حتى الآن) يمكن زراعتها تحت ظروف زراعة استكشافها حتى الآن. وبالتالي، فإن عددا كبيرا من التفاعلات بين الأ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.