化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

要約

細菌は、その微生物の隣人の生理機能に影響を及ぼす可能性があり、分泌された化合物を製造する。ここでは、固体培地上で枯草菌の蛍光転写レポーター株と土壌微生物を混合することにより、このような化学的に仲介される種間の相互作用の検出を可能にする共培養画面について説明します。

要約

自然界では、細菌はほとんど単独で存在していない、彼らは代わりに代謝物を分泌することにより、ローカル環境を変更他の微生物の多様な囲まれています。これらの代謝産物は、その微生物の隣人の生理学および分化を調節する可能性があると思わ複雑な微生物群集の確立と維持に重要な要素である。我々はそのような化学的媒介微生物の相互作用を同定するために蛍光ベースの共培養画面を開発しました。画面には、固形培地上での環境微生物に蛍光転写レポーター株を組み合わせて、コロニーが共培養で増殖させることが含まれます。それは、目的の特定の表現型発現されたときに選択された細菌株が蛍光を発するように蛍光体転写レポーターに設計され（ すなわち、バイオフィルム形成、胞子形成、毒性因子の産生、等 。）スクリーニングは成長条件の下で行われるWHEこの表現型を再発現（したがって、レポーター株は、典型的には非蛍光性である）されない 。環境微生物がこの表現型を活性化する代謝産物を分泌する場合には、寒天を通って拡散し、蛍光レポーター構築物を活性化する。これは誘導代謝産物を産生する微生物を検出することができます：彼らは蛍光コロニーに最も近い非蛍光コロニーである。このように、この画面には、レポーター株の特定の生理的応答を活性化拡散性代謝​​物を生産する環境微生物の同定を可能にする。 a）に示すように、適切な共培養スクリーニング条件を選択B）スクリーニングのためのレポーターや環境微生物を準備し、c）の共培養画面を行い、D）推定誘導する生物を分離し、そしてe）二次スクリーニングにおいてその活性を確認する：この資料には、どのように説明します。私たちは、 枯草菌におけるバイオフィルムマトリックスの生産を活性化する土壌生物をスクリーニングするためにこの方法を開発した

概要

私たちは、細菌が分泌する代謝物が隣接微生物の生理機能と発展にどのように影響するかを理解することに興味を持っています。多くの代謝物は、他の微生物に及ぼす生理活性効果のために特徴付けられている。 2つのよく記載の実施例は、他の微生物の全体的な遺伝子発現を変化させる他の微生物の増殖を阻害する抗生物質、およびクオラムセンシング分子が含まれる。しかし、細菌は既知の生物活性^1を持っていない他の多くの小分子の天然産物を生産する。私たちは、細菌が進化し、彼らは彼らがほとんどの細菌が存在し、その中の複雑な微生物群集での微生物の隣人の細胞生理を調節することができるため、これらの代謝物の一部を生産する能力を保っていると仮定した。

枯草菌細胞型

私たちは、Bacilを伴う化学的に媒介微生物の相互作用に関する我々の研究を集中してきたLUは枯草菌。これは、グラム陽性モデル細菌とその操作のために利用可能な結果の遺伝的なツールとしての地位を、だけでなく、ために特性の細胞種に分化する能力があるだけではありません。環境からDNAを取り込むことのできる、、堅牢なバイオフィルムの形成のために必要とされる細胞外マトリックスを産生する、水泳、その他²の中で、胞子形成：例としては、細胞が含まれる。これらの細胞型の各々は、それらの生理学的および/または物理的に別個のそれらの遺伝的に同一の兄弟からなる特徴的な転写レギュロンを発現する。多くの増殖条件下で、複数の細胞型は、B.の単一コロニー内のような種々の亜集団を共存枯草菌細胞 ^3。細菌の多くの種は、類似の細胞型の不均一性を示すことができるが、この現象は、特によくB.研究されている枯草菌 。

UPRであり、特に、遺伝子これらの特定のBの各々の中egulated 枯草菌細胞型が同定されている。興味のあるこれらの微生物の表現型の多くは、直接観察することが困難または不可能であるため、このようなアップレギュレートされた遺伝子を同定すること、ここで説明する研究に不可欠である。例えば、我々は、視覚的に、このような固体（1.5％）寒天プレート上で水泳など形質を検出できなくてもBの亜集団枯草菌細胞は、それらの条件の下で³鞭毛を生産する。別の例としては、バイオフィルムマトリックス生産です。行列の生産は（それが巨視的にしわコロニーになるように）コロニー形態により可視化だけ特定の増殖培地上、唯一の成長⁴の倍数日後にすることができます。しかし、分化の間にアップレギュレートされる遺伝子を知ることによって、私たちは、これらの細胞型への細胞分化のマーカーとして機能するの転写レポーターを構築することができます。

レポーター構築

これらの蛍光トンranscriptionalレポーターは、細胞型特異的遺伝子は、蛍光タンパク質、例えば、レポーター遺伝子の産生を駆動するためのプロモーターから成る。例としては、P _HAG-YFP（水泳細胞）、P _TAPA-YFP（バイオフィルムマトリックス産生細胞用）、およびP _xは遺伝子xのプロモーター領域を示すP _SSPB-YFP（細胞を胞子形成のための）が含まれる。表現型のネイティブ調節がそのまま残されているように、これらのレポーター構築物は、染色体上の中立座位（ 図1及び下記参照）に統合されています。細胞はこの表現型を発現しかし、今、それはまた、蛍光タンパク質を発現する。これは、私たちは、この生理学的応答を活性化する微生物をスクリーニングすることができ、特定の表現型の行動の活性化の容易に可視化読み出しを提供しています。このような記者は、一般的に微生物学で使用されているが、これらは広くidentifするスクリーニングに適用されていないこのメソッドの前に微生物間のY代謝相互作用は^5を説明した。

細胞型特異的レポーター株の設計と建設における重要な考慮事項がいくつかあります。構築物の他の種類は確かに可能であるが、我々は、排他的に転写蛍光レポーターを利用している。我々は2つ​​の理由のために、しかし、私たちの画面での細胞種分化のマーカーとして翻訳融合の使用を思いとどまら：非摂動天然の細胞型特異的タンパク質を残す1）意欲、および2）の認識、その拡散し、細胞広い蛍光は（翻訳融合と共通）、細胞内に局在涙点よりも検出が容易になります。

レポーター遺伝子の選択

読み出しなどの転写を使用することを決定した後、レポーター遺伝子（ 例えば LacZを、蛍光、またはルシフェラーゼ）を選択する必要があります。 lacZを少なくとも特別なを必要とするという利点がある検出するための設備を化されたが、環境微生物の中で偽陽性の非常に高い可能性がある。私たちの手では、土壌の微生物の中でラック⁺生物^のバックグラウンドレベルは、（;データは示していない>>土壌微生物の10％が、X-galプレート上で）ラック^+（青だった）法外に高かった。我々はこれをしようとしなかったが、それは、媒体中のX-galの濃度を滴定することによって、これはX-galをレポーターの使用を可能にするように最適化され得ることが可能である。ルシフェラーゼは、高い検出感度を提供し、最も直交レポーターである：環境微生物は、本質的に発光であることのほとんどない可能性があります。しかし、我々はそれが困難で大部分がマルチウェルプレートでのみ局所的な領域をスキャンするように設計されたように、全体のペトリプレートを横切って発光検出を可能にした我々の施設での器具類を同定することが見出さ。また、また、同時に、物理が許可された方法で、発光コロニーを可視化する合併症があるかもしれない誘導生物のオレーション。受託者を使用すると、これを可能にしたかもしれないが、我々は代わりにBで動作するように証明された蛍光の転写レポーターを使用することを選択枯草菌は 、検出と土壌生物の中で低い偽陽性率の十分な感度を提供し、可視化し、単離方法の両方で簡単に利用可能な機器の使用を許可。

蛍光団の選択

選択された特定のフルオロフォアは、あなたの細菌種は、使用している寒天増殖培地、および、利用可能な特定の蛍光フィルターセットに依存します。当社の計測機器では、我々が発見したBの両方枯草菌は自身とYFP（黄色蛍光タンパク質）フィルタが使用されたときには私たちの手の中にGFP（緑色蛍光タンパク質）へのレポーターは、優れた作り、展示少ないバックグラウンド蛍光上で増殖させた寒天コロニー。蛍光タンパク質のコドン使用頻度である頻繁にどちらかあなたの細菌種で機能するように、または構成的プロモーターを使用して明示的にテストするために文献から知られている蛍光体を選択することが重要に作り、真核生物のために最適化された。進化し続ける蛍光タンパク質変異体の大きな数は^6、現在利用可能であり、明示的に実験⁹の適切な蛍光タンパク質を選択するためのガイダンスを提供し、そのうちのいくつかのソース^7,8の数、で検討されている。

プロモーターの選択

プロモーターの選択は、主に携帯型または関心対象の表現型に依存するであろう。このようなBと生物の枯草菌 、いくつかの細胞型特異的レポーター遺伝子は、文献において確立されている。他の細菌株については、マイクロアレイまたは転写データを調べることは、関心iの携帯型遺伝子は高度な条件下でアップレギュレートされているかについての情報を提供することが必要であるSは明らか。最近の研究では、Bの転写をカタログ化タイリングマイクロアレイ^10を使用して、104の異なる増殖条件下ズブチリス 。本論文では、遺伝子は、高度にあまりよく特徴付けられた表現型のための非常に貴重である、異なる条件下でアップレギュレートされているかについての包括的な情報を提供します。

むしろ関心のある全ての遺伝子のための正確なプロモーター領域をマッピングするよりも、我々は一般的に、単純に、プロモーターとしての遺伝子の上流配列200〜500塩基対を使用しています。正確な配列の長さは、ゲノムの文脈に依存する：必要なオープンリーディングフレームの上流に隣接するコード領域を含む回避するときに短い領域が使用される。

中立座と統合

どのような細菌株においてレポーター構築物を維持するために蛍光転写レポーター株を設計する際の最後の質問になります。細菌では、関心対象の遺伝子が頻繁に維持される抗生物質の選択を使用してプラスミド上。しかしながら、環境微生物を殺すことなく共存時に抗生物質を使用できないことがあり得る。プラスミドを安定的にお使いの細菌種で維持している場合は、スクリーニングのために、あなたのレポーターを準備するための抗生物質の存在下でプラスミド由来のレポーターを含むあなたの細菌を成長した後、プラスミドは思いますが、共培養自体の間に、抗生物質を排除することが可能である十分な蛍光を可能にするために維持される。プラスミドは簡単に細菌中で失われているか、ストレス条件下で失われた場合は、これは実行可能な選択肢ではありません。多くの場合、最善の解決策であっても、選択の非存在下でのレポーターの安定な維持を可能にする細菌染色体上にレポーター構築物を統合することであろう。目的の遺伝子の正常な発現や規制を混乱しないようにする統合のためには、我々はカリフォルニア染色体上の異所性部位の中に統合することをお勧めしますNとして機能する「中立座。 " Bの枯草菌 、これらの組み込み部位が遺伝子であることを-変異したとき- （組込み体が抗生物質選択することなしに同定することができるように）特定の最小培地での表現型を伝え、まだリッチメディアの成長や胞子形成率を変更しない、とのamyE、LACAなどの遺伝子が含まれる、 thrC遺伝子、pyrD、gltA遺伝子、およびSACA（デンプンを利用する能力を搬送する、β-ガラクトシド、トレオニン、ウラシル、グルタミン酸塩、及びスクロース、それぞれ^）11-13。

これらの遺伝子における統合はB.に長年にわたって確実に使用されてきたが枯草菌 （特にのamyEとLACA時）、同じような知識は、他の多くの細菌種の遺伝子のために利用できない場合があります。ファージ結合部位の使用は、中立的な染色体組み込み部位に最適の選択肢である：多くの種特異的^14〜16、ならびにそのようなのTn7接着部位などの一般的な組み込み部位（ATTの Tn7転移）が持っている多くの細菌種^17,18で同定した遺伝子の挿入のために利用されて。

環境微生物

私達は私達の共培養画面の環境微生物の直接のソースとして土を使用しています。土壌微生物の高い多様性を含有し、これらの生物の多くは、天然物の豊富な供給源である。 （土壌からの細菌の事前の単離することなく）私たちの蛍光転写レポーター株にプレート上に直接置かれた土壌の液体懸濁液を使用することにより、我々は非常に実験的なアプローチを簡素化します。土壌は、収穫後直ちに使用することができる、又は将来の使用のために-80℃で凍結する。即時の使用は、微生物の大きな多様性は、潜在的にうまく凍結生存しないであろうものを含めて、成長させることができるという利点を有する。これは、使用しなければならないスクリーン板の数を増加させる、これらのサンプルから培養可能な土壌生物の濃度が不明であるという欠点を有する。デルayed使用が最適化されたコロニーの数は、各スクリーン版上に成長させることができるように、各土壌のソースcfu / mlでは、事前に決定することができるという利点を有する。しかし、土壌生物が凍結を存続できることが必要です。

デューサプールの多様化が検討されていることに注意してください（ すなわち土壌源）は、同じ土壌に関する詳細なスクリーニングよりも新しい種間相互作用を同定するのにより効果的であるように思われる。大きな系統発生多様性としてのマトリックスの誘導画面で同定されたヒットで観察された追加の土壌のソースは、（EAシャンクとR. Kolter、ハーバード大学医学部、未発表の結果）を調べたのではなく、より徹底的に、同じ土壌のソースをスクリーニングされた。

概要

我々はここで説明するアプローチは、その技術的要件の面で簡単です。それが含まれます。1）Bの蛍光転写レポーターを構築する枯草菌や関心のある他の細菌種、2）4）、これらを混合、）我々の場合の土壌中の（3）スクリーニングされるこのレポーター株と生物のアリコートを調製し、この記者が活性化されていない条件を特定したが、他のソースではなく、利用することができる固体培地上の微生物の二組、5）を同定および単離推定上の生物を誘導する、および6）これらの生物が実際に二次スクリーニングにおいて、この表現型を活性化しないことを確認した。一旦同定、これらの生物とその代謝物は、細菌の挙動を調節するために、細菌の生理学および微生物の相互作用を研究するために、潜在的に将来の治療用化合物のための新規な足場として作用する化学物質のツールを提供してくれる。

プロトコル

1。レポーター遺伝子を選択し、蛍光転写レポーターを構築

枯草菌の場合：

1. 枯草菌における蛍光の転写レポーターの構成を説明するプロトコルのためのリファレンス¹⁹ Joveの記事を参照してください。

他の細菌種の場合：

1. 関心のある生理学的応答の間にアップレギュレートされる遺伝子を特定します。これは、特定の条件下で、微生物の既存の文献又は転写解析に基づくこ​​とができる。
2. この遺伝子は表現型の変化のプロキシとして動作させるための蛍光転写レポーターを構築します。この構築物は、適切な蛍光タンパク質（ 図1参照）の産生を駆動し、このアップレギュレートされた遺伝子のプロモーターを含むべきである。
3. 染色体上の中立的な遺伝子座に、この構築物を統合します。これは、確実にその天然でREG目的の遺伝子の破壊はulation、環境微生物の増殖を妨害し得るプラスミド選択機構（ 例えば 、抗生物質）の必要性が回避されない。

2。共培養条件を決定

枯草菌のためのP _TAPA-YFPレポーター：

1. 使用0.1X LB、レノックス（1グラムトリプトン、0.5グラムの酵母エキス、リットル当たり0.5グラムの食塩）B.以来、この記者のための媒体としては、 菌マトリックス生産はルリアブロス²⁰が最小である。この培地は、B.を可能にする^5を成長させる土壌からの多様な分類群を可能にしながら枯草菌のコロニーは、サブミリが、観察可能な大きさに成長する。
2. 潜在的なpH変化を最小限に抑えるために100 mMのMOPS緩衝液が含まれる。

他の細菌種の場合：

1. 公開された転写データを使用するか、または経験的に微生物が成長つを除くactivati​​oを識別するために、さまざまな培養条件をテストする蛍光レポーターのnは（レポーター株を誘導する微生物との共培養で増殖されるとき、その活性化を検出することができるようにする。）無視できる
2. （土壌など）貧栄養環境からの環境微生物をスクリーニングする場合、高い栄養条件²¹で提示されたとき、多くの貧栄養細菌が成長しないので、（伝統的に豊かな微生物学的メディアと比較して）低栄養含有量のメディアを使用してください。低栄養培地はまた、スクリーンのスループットを向上させる、コロニーサイズを減少させる。
3. 低バックグラウンド蛍光と良好な光学的透明性を有する媒体を選択します。
4. レポーター株と環境微生物の両方を同時に成長させるために、成長温度を最適化します。
5. 緩衝剤を添加することを検討してください。このような相互作用に関心がある場合を除き、プレート内のバッファの使用は、生理学²²のpH媒介性の変化を検出する可能性を低減する。

3。レポーターアリコートを準備します

枯草菌のためのP _TAPA-YFPレポーター：

1. 無菌爪楊枝またはアプリケータースティックを使用して新しいLBプレート上に-80℃で凍結ストックからのストリークレポーター株。
2. 30℃で一晩増殖
3. 固形培地上での増殖に起因するバックグラウンド蛍光を最小限にするために液体培地で段階希釈を行います。
   1. 5ミリリットルのLB液体培地に接種し、37℃で振とうしながら成長する
   2. 培養物がOD _600〜0.6に達したときに、0.02のOD ₆₀₀は5 mlの新しいLB中に希釈する。
   3. 培養物がOD _600〜0.6に達するまで振盪しながら、再び37℃で成長する。
   4. 連続成長希釈液を3倍の合計を繰り返します。
   5. 最終的な段階希釈培養がOD _600〜0.4に成長しましょう。
4. 百分の15から20にグリセロールを追加します。
5. 分量50〜200 0.5ミリリットルマイクロチューブへμLおよび-80℃で凍結
6. マレポーターの非蛍光親株のためのKE相当の分量（これらは二次スクリーニングの際に必要となります）。

他の細菌種の場合：

1. 低バックグラウンド蛍光を有する細胞を使用する（ すなわちレポーターで用いられるプロモーターから少し式がある条件下で増殖されています）。
2. （詳細については、上記のセクションを参照）を確認し、コロニーの適切な数は、各画面の共培養プレート上で成長させることができるように、レポーター株の公知のcfu /ミリリットル（ml当たりのコロニー形成単位）を含有するアリコートを凍結する。
3. 非蛍光親株と同等の分量を作る（これらは二次スクリーニングの際に必要となります）。

4。土壌サンプルを入手

1. 露出面の土の上0.5cmに廃棄、スパチュラを用いて、滅菌コニカルチューブまたは滅菌袋に土を集める。
2. 1グラム当たり10ミリリットルの割合で滅菌生理食塩水（0.85％塩化ナトリウム）を追加土壌スラリーを作るために土の。
3. 土壌粒子から細菌を取り除くために、この方法を選択します。a）新鮮なサンプルまたはB）をすぐに使用するには、サンプルの凍結後使用を延期した。
   1. すぐに使用するための、1分間ボルテックススラリー。
   2. 遅延の使用の​​ために、1分間氷上でブレンダージャーを配置する混合サイクルの間に置か三1分間のサイクルをブレンダーで土壌スラリーをブレンド。
4. 土壌スラリーを約1分間沈降してみましょう。
5. 新しいチューブに上層の水層を移動します。
6. 15から20パーセントの最終濃度にグリセロールを追加します。
7. 分量50〜200 0.5ミリリットルマイクロチューブへμLおよび-80℃で凍結

5。冷凍レポーターや土壌分量のCFU / mlのを決定

1. 凍土およびレポーターアリコートを解凍。土壌微生物を氷上で解凍することができる。 B.理由4℃で枯草菌が溶解は、それらのアリコートを低温で費やされる時間を最小限に抑えるために、室温で急速に解凍されるべきである。
2. 2複製のセリアを作る0.1×LBまたは他の等張緩衝液中のLの希釈液（10 ^-8）。
3. 共培養スクリーニングのために使用される同じ培地の寒天プレート上に各連続希釈のプレートを5μlスポット。
4. RT（またはスクリーニングのために使用する温度）で成長する。
5. 翌日、各スポット内でコロニー数をカウントし、凍結アリコートの各々のcfu / mlで計算する。

6。スプレッドスクリーンプレート用小分け濃度を確認してください

1. ステップ5.1のように凍結したアリコートを解凍。
2. 1×10 ^{5、×10 5} 2.5、5×10 ^{5、1×10 6、}および2.5×10 ⁷ CFU / mlに希釈します。
3. 個々のプレートの中央に各希釈液50μlスポットを追加します。これらは、計算されたプレート当たり25,000個のコロニーの最適なだけでなく、2でプレートが得られるはず - と5 - 最高の実際の希釈を決定することができるように、より少ない倍。
4. 約20滅菌ガラス（3ミリメートル）ビーズによるの追加優しくプレート上にそれらをタップする。ビーズは、曲げガラススプレッダーが何よりもプレート間でのコロニーのより均一な分布を提供する。
5. 液体が吸収されるまで、ベンチトップ上でプレートを維持し、前後にそれらを振る、作業中に、それらを回転させて細胞を広げる。プレートが乾燥したら、ビーズを振ら続行しないでください、それ以外の場合には、細菌を殺すために開始されます。
6. 上でプレートを反転し、エタノールを含有する廃棄物のビーカーにビーズを捨てる。
7. プレート（ 例えば 24℃/ RT）あなたの分析のために適切な温度でお使いのアッセイ（ 例えば 24時間）の時間で成長しましょう。
8. 解剖ステレオスコープを使用して、ビューの二つ以上のフィールドにコロニー数を数える。
9. 面積あたりのコロニー数を計算し、各プレート上でどのように多くの植民地を決定する。
10. 必要に応じて将来の希釈液を調整します。コロニーの実際の数は、各匹敵するスクリーンプレート上の同じ数を有するほど重要ではない。

7。共培養プレートを準備します

1. ステップ5.1のように、雪解けのレポーター分量（凍結した場合、土壌​​分量）。
2. 0.1×LBまたは他の低栄養、等張液中で（セクション6に最適化された濃度に）レポーターを希釈。
   1. 凍土の場合：0.1×LBや他の低栄養、等張液中のセクション6に最適化された濃度に希釈します。
   2. 新鮮な土壌：土壌スラリーのCFU / mlのは、10 ^{-4〜10 -9} CFU / mlに及ぶ可能性があることを予測に基づいて、新鮮な土壌スラリーの希釈液を作る。
3. スポット共培養スクリーンプレートの中心に土壌やレポーター希釈液50μlの。また、プレートだけでは土壌や単独のコントロールとしてレポーター。
4. ステップ6.4〜6.6に記載のようにガラスビーズを用いて広げた。
5. あなたの蛍光レポーターを活性化する既知の成長条件がある場合は、スジやスクリーニングの間、ポジティブコントロールとして使用するために、これらの条件の下にレポーターをプレートと成長する。
6. 28時間（またはレポーター/アッセイに応じて） - 24 24℃でインキュベート

8。蛍光の画面共培養プレート

1. コロニーがシャープになるように明視野照明を使用して、ステレオスコープを当てる。
2. あなたの土壌サンプルがコロニーを自家蛍光しているかどうかを判断するために土壌専用のプレートを見てください。もしそうなら、この土壌は（二次スクリーニングの同時増加に）偽陽性率の高さになることがあります。
   1. デューサは、彼らが偽陽性（ 図2）として検出されます可能性が小さく、複数のレポーターコロニーに囲まれたされる可能性を高めるために、共培養プレート内の土壌：レポーターの比率が高いを使用してください。
   2. 異なる蛍光タンパク質（異なるチャンネルで発光するもの）を使用してください。
3. 検定のタイミングを決定します。最も新しいの記者については、潜在的な誘導のタイミングが不明であるため、経験的に決定されなければならない。
   1. とすぐにコロニーは解剖ステレオスコープ（倍率〜30X）ではっきりと見えるようになり、成長が止まっている、および/またはバックグラウンドの蛍光が高すぎるようになるまで、定期的にプレートを調べる続けている蛍光のスクリーニングを開始します。
   2. 誘導電位の時間ウィンドウが特定のレポーターに対して決定されると、スクリーンプレートのモニタリングを簡素化すると、そのレポーターを含むすべての共培養プレートについて類似していなければならない。 Bの枯草菌のP _TAPA-YFP記者は、プレートを検討する適切な時間は、細胞を播種後24〜28時間の間にあり、Bの枯草菌のP _SSPB-YFPレポーター、それが成長の26〜32時間の間にある。
4. あなたの蛍光感度を最大化：
   1. あなたの蛍光解剖スコープが暗い部屋にいるか、遮光カーテンに囲まれていることを確認します。誘導は可能性が高い構成的に生産FPよりもあまり強くなり、より大きな感度を必要とします検出するtivity。
   2. 蛍光ランプが安定すると、あなたの目はあなたの共培養プレート（少なくとも1〜2分）からの蛍光を検出しようとする前に、暗闇に適応するための時間を与える。
5. （持っていれば）ポジティブコントロールを使用すると、使用している倍率はあなたが蛍光を検出することを可能にすることを確認してください。あなたの視野は約30-50Xあなたの典型的なコロニーの直径（200-400X）の場合、倍率は一般的に最高です。
6. 明るい光をオフにして、蛍光のためのシャッターを開いてください。
7. あなたの目は暗闇に調整した後、徐々に明るいスポットを探して、あなたの視野全体にプレートを前後に移動させる。
   1. プレートの上から起動して、プレートの底部に向かって移動すると、プレート左右に移動するには、ジグザグパターンを使用しています。
   2. 練習をプレートに移動する方法ゆっくり感を出すために、あなたが全体のシュールをカバーしていることを確認するために明視野でプレートを移動顔領域。
   3. ゆっくりと十分なコロニーがぼやけにならないことを、プレートを移動します。むしろミス領域より表面をオーバーサンプリングすることをお勧めします。
   4. 1完全なスキャンした後、プレートを90°とリピートをオンにします。人間の目には、このメソッドを介しても、かすかな蛍光を検出することで著しく優れている。
8. あなたが蛍光を検出した場合、プレートの移動を停止し、戻って蛍光面積を見つける。
9. ゆっくりで明を参照すると、蛍光が細菌コロニー（としない​​自己蛍光土壌残骸やメディアコンポーネント）に関連付けられているかどうかを決定します。もしそうであれば、蛍光コロニーの近位に非蛍光コロニーは、推定誘導生物である。

9。推定を誘引生物を分離

1. 一度誘発される（蛍光）コロニーが同定されており、誘導化合物を分泌するこれらのコロニーを分離します。
   1. リポーターコロニーの十分に高い濃度がプレート上で生育している場合（> 0.5:1レポーター：土壌CFU）、推定誘導コロニーは（再び、 図2を参照）、複数の蛍光コロニーに囲まれています。
   2. 共培養の成長の複雑さはインデューサーであるコロニーそれがあいまいになるケースでは、二次スクリーニングにおいて、その後のテストのための複数の潜在的な誘導コロニーを分離します。
2. あなたは、視野の中心にピックアップするコロニーをローカライズ。
   1. 彼らはプレートの端に近い場合は、プレートのリップが離れてあなたの利き手（右利きであれば、 すなわち左のプレートのリップを入れて）からのものであるように、プレートを回転させます。これは、あなたのピッキングの精度が向上、低角度でコロニーにアプローチすることができます。
3. 使用のヒントをに廃棄するように、近くに上のスジの推定誘導生物だけでなく、廃棄物のビーカーに新鮮なプレートを配置します。
4. 上の蛍光灯を残して、徐々に明るい光を回すあなたは、（形状や位置によって）蛍光コロニーと周囲の推定の誘発生物を特定することができるようになりますように、上。あなたは何の蛍光だけ明るい光が存在しない場合にピックアップするコロニーを同定することができるように光を前後に数回行く必要があります。
5. 無菌の丸い200μlのゲルローディングチップをピックアップし、鉛筆のようにそれを保持するために、ガラス棒（長さ200mm×5mmの直径）を使用します。これは、個々のコロニーを分離するために使用するピッキングツールです。
6. 作業台の上にそれを安定させるために、ステージと照らし合わせて、外側の手のひらを置きます。ピッキングツールを安定させるためにあなたの手の内側、親指側にもう一方の手を置きます。
7. 必要に応じて、ピックアップするコロニーを同定するために、蛍光と明視野ビュー間を再び反転させます。
8. プレート表面上にピペットチップを保ち、あなたの視野に移動し、あなたが選ぶ希望コロニーの上に、それを中央に配置します。先端はピントが合いません。
9. （顕微鏡ステージや作業台の上に載っている）あなたの手の外縁を使用して、ゆっくりと選んだ対象のコロニーをピペットチップを回転させます。どのように多くの他のコロニーの先端が接触を最小限にしようとしている、非常に軽くタッチします。
10. 新しいプレートのセクションにピッキングツール、連勝を回転させずに。ガウジングの寒天を避けるために、ソフトタッチで拡散。この方法によって導入細胞数（コロニーは、典型的には、操作よりもはるかに小さい）非常に小さいので、単一の連続ストリークは、単離されたコロニーをもたらすであろう。
11. 他の推定誘導する生物で、このプロセスを繰り返します。
12. 24℃（またはアッセイの温度）で培養する。

10。ストリーク推定を誘引する生物絶縁型シングルコロニーを得

1. ステレオスコープを使用して、決定 - コロニー構造又は形態に基づい - あなたの推定上の撮像インドールの各々に含まれている異なるタイプのコロニーが存在するかどうか生物をucing。
   1. あなたが潜在的なコロニーの違いを検出するために、上記と同様に下からの両方からコロニーを照らすことができるステージを用いてコロニーを見てください。
2. 新しいプレート上にそれぞれ異なる形態型をRestreakと成長するまでインキュベートする。
3. 1より多くの時間をRestreakし、成長してみましょう。異なる形態型が解決しない場合は、純度restreakし続けています。

11。二次スクリーニングにおける推定を誘引生物を再テスト

1. 蛍光転写レポーターを活性化するかを決定するために二次スクリーニングにおける推定誘導生物のすべてを再テストします。二次スクリーニングは、推定誘導生物にパッチまたはスポットされ、その上にコントロールプレートと一緒に蛍光転写レポーター株の微小コロニーの芝生、、で構成されています。
2. 同じ濃度Aの蛍光転写レポーター株の微小コロニーの芝生を（含む1：3つの同一のプレートを設定s）は共培養スクリーニングの間に使用した;ず、芝生を含有しないオン;一方は微小コロニー蛍光レポーターない野生型の親菌株の菌叢を含む。
   1. プレートの向きを決定するために、各プレートの背面の上部をマークします。
   2. パッチ/スポットについて、位置マーカーを追加、最大10の推定誘導生物は、プレートの各セット（ 図3）上でテストすることができます。
   3. 解凍芝生ずつステップ5.1のように、（レポーターおよび非蛍光親株）。
   4. ステップ6.4のように無菌ビーズを使用した芝生のプレート（またはその他の最適化された希釈液）に5×10 ⁵ CFU / mLの希釈液50μlを広げた。
   5. プレートを乾燥させます。
3. パッチまたは推定誘発生物スポット：
   1. 簡単かつ迅速なアプローチが望まれる場合、パッチを選択し、それが堆積された細胞の少ない正確​​な数を有することが許容される。修正パッチを適用する。
      1. テストに植民地に無菌爪楊枝をタッチ - すべてのセルを選択しないでください。
      2. 空白のプレート上にパッチ（小連勝を作る）。
      3. リポータープレートに新鮮な爪楊枝でパッチを繰り返します。
      4. 制御板の上に新鮮な爪楊枝でパッチを繰り返します。
   2. 定量的で再現性のあるアプローチが望まれる場合にスポッティングを選択します。スポッティングは、（完全な詳細については、参考文献5を参照されたい）堆積細胞数を正規化することを可能にし、比較対象の異なる誘導する生物の相対的効力​​を可能にする。スポットに：
      1. 推定上の再懸濁は、無菌のプラスチックキュベット中の液体培地1ml中に生物を誘導する。
      2. ODを再懸濁の_600を取る。
      3. 式X = 250÷（OD ₆₀₀から0.5）を使用して、0.5のOD ₆₀₀で解決策を得るために、液体培地500μlに再懸濁ごとのボリュームXを追加します。あなたは同じボリューム（50を使用することができますので、外径のを正常化するために、複数の希釈を行う場合は、この方法が必要なピペット操作を簡素化あなたの希釈剤のすべてのための0）を加えた。
      4. 3枚のそれぞれに、各OD-正規化された再懸濁のスポット1μL。
4. 24〜28時間（またはレポーター/アッセイに応じて）24℃で成長しましょう​​。
5. あなたの蛍光レポーター株ではなく、あなたの親のコントロール株を有効に推定される誘導生物を識別するために、蛍光解剖顕微鏡を使用してください。興味のある表現型を誘導する化合物を分泌する環境微生物 - これらの分離株はあなたの肯定的なヒットである。

結果

この画面は、B.の生理機能を変化させる化合物を分泌する土壌生物を同定するために使用した枯草菌 。ここに記載の結果は、B.のマトリックス産生細胞型に焦点を当てるこの細菌における強固なバイオフィルムの形成のために必要とされるタンパク質とエキソポリサッカライドを生産菌 、。私たちは、蛍光レポーター構築物（P _TAPA-YFP）のためTAPA-s...

ディスカッション

このプロトコルの固有の制限の一つは、微生物のcultivabilityに依存することである。よく^24を文書化してきたように、地球上で最も微生物の人生は（まだ）これまでに検討さ培養条件下で増殖させることができません。これにより、自然環境で発生している微生物種間の相互作用の膨大な数は、このアプローチを用いて検出されないであろう。私たちの願いは、このような相互作用の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.