إنشاء نموذج يسببها جراحيا في الفئران المعنية بالتحقيق في دور وقائي من Progranulin في هشاشة العظام

Summary

نحن تصف بروتوكول لزعزعة الاستقرار في الغضروف المفصلي الإنسي (DMM) نموذج في الفئران، أداة فعالة لالتهاب المفاصل (OA) البحوث. بالإضافة إلى ذلك، لقد أثبتنا أن نقص progranulincan المبالغة تطوير الزراعة العضوية والتقدم باستخدام هذا النموذج، مشيرا إلى أن progranulin يلعب دورا وقائيا في التسبب في الزراعة العضوية.

Abstract

زعزعة الاستقرار في الغضروف المفصلي الإنسي (DMM) النموذج هو أداة هامة لدراسة الأدوار المرضية في جسم المريض من التهاب المفاصل العديد من الجزيئات المرتبطة في التسبب في هشاشة العظام (OA) في الجسم الحي. ومع ذلك، فإن تفصيلية، وخاصة البروتوكول تصور لإنشاء هذا النموذج تعقيدا في الفئران، غير متوفر. نحن هنا استغل wildtype وprogranulin (PGRN) - / - الفئران كأمثلة لإدخال بروتوكول لإحداث DMM نموذج في الفئران، ومقارنة ظهور الزراعة العضوية التالية إنشاء هذا النموذج يسببها جراحيا. كانت العمليات التي تجرى على الفئران إما عملية صورية، والتي فتحت للتو كبسولة مشتركة، أو عملية DMM، والذي قطع في الرباط-menisco الظنبوب وتسببت في زعزعة الاستقرار في الغضروف المفصلي وسطي. تم تقييم شدة هشاشة العظام باستخدام الفحص النسيجي (على سبيل المثال Safranin O تلطيخ)، التعبير عن الجينات المرتبطة OA، تدهور الغضروف جزيئات المصفوفة خارج الخلية، وعظمية شكلأوجه. عملية DMM يسببها بنجاح بدء الزراعة العضوية والتقدم في كل من wildtype وPGRN / - الفئران، وفقدان عامل النمو PGNR أدى إلى النمط الظاهري OA أكثر شدة في هذا النموذج يسببها جراحيا.

Introduction

هشاشة العظام (OA)، المعروف أيضا باسم التهاب المفاصل التنكسية، ويؤثر على 15٪ من سكان العالم وأكثر من 46 مليون شخص في الولايات المتحدة، وتتميز الزليل، تنكس الغضروف، وتشكيل عظمية ^1. يمكن أن يكون نتيجة لتفاعل معقد بين العوامل الوراثية والتمثيل الغذائي، والنشاط الحيوي البيوكيميائية. الآليات الكامنة وراء OA مواصلة التهرب من المجتمع العلمي. وهناك حاليا العديد من النماذج الحيوانية التي يمكن أن تحاكي التسبب في الزراعة العضوية ^2،3. من المهم إنشاء نماذج حيوانية في الفئران بسبب كل من توافر مختلف الفئران المعدلة وراثيا وفعالية من حيث التكلفة من التجريب. من بين أنواع مختلفة من النماذج التجريبية الزراعة العضوية، وزعزعة الاستقرار التي يسببها جراحيا من الغضروف الأنسي (DMM) النموذج هو نموذج OA مقبولة تماما بسبب استنساخ جيدة وتطور أبطأ نسبيا خلال تطوير الزراعة العضوية. كل من هذه الصفات لديككان المفتاح لتقييم تطور الزراعة العضوية في العلاج أو الجينات المحورة ^3-8 مختلفة. ومع ذلك، يتأثر اتساق نموذج OA الجراحية بسبب عوامل مختلفة أثناء الجراحة، ونتيجة لذلك، فإن تطبيق نموذج الفأر الجراحية محدودة.

Progranulin (PGRN) هو عامل نمو متعددة الوظائف التي أعرب عنها في خلايا مختلفة. فمن المعروف أن PGRN يلعب دورا حاسما في مختلف العمليات الفسيولوجية والأمراض مثل التئام الجروح ^{9، 10} تكون الأورام، والالتهابات ^11-15. أظهرت الدراسات أيضا أن عدم كفاية PGRN يمكن أن يسبب الأمراض التنكسية من الجهاز العصبي في كل من البشر والفئران ^16-18. فمن المعروف أن يعبر عن PGRN في الغضروف المفصلي الإنسان، وارتقى مستواه بشكل كبير في الغضروف من المرضى الذين يعانون من التهاب المفاصل الروماتويدي والزراعة العضوية ^19. بالإضافة إلى ذلك، PGRN أيضا يلعب دورا حاسما في انتشار خلية غضروفية ^20، والتمايز وغضروفيتعظم من لوحة النمو خلال تطوير ^21،22. في الآونة الأخيرة، وذكرت لنا أن PGRN استعداء TNF-α من خلال ملزم لمستقبلات TNF وعرضت وظيفة مضادة للالتهابات في نماذج التهاب المفاصل ^{13،14،23،24.} ومع ذلك، فإن دور PGRN في الزراعة العضوية، وخاصة في الجسم الحي، لا يزال يتعين لغزا. هنا، نقدم الإجراء للحث على نموذج DMM الجراحية، والتحقيق في دور PGRN في تطوير الزراعة العضوية من خلال إنشاء نموذج DMM في WT وPGRN / - الفئران.

Protocol

جميع العمليات الجراحية المتعلقة الحيوانات ينبغي الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان وأخلاقيات المؤسسة المحلية، مع الجهد المبذول للحد من الألم وعدم الراحة التي تسببها الجراحة.

1. إعداد

1. حدد 8-12 أسابيع من العمر من الذكور C57BL / 6 الفئران مع وزن الجسم حوالي 25 غراما لعملية جراحية.
2. تخدير الحيوانات من خلال حقن داخل الصفاق من كوكتيل تحتوي على كل زيلازين (5 ملغ / كلغ) والكيتامين (40 ملغ / كلغ).
3. يحلق الركبة مع شفرات الحلاقة، ثم ثنى الحيوان جراحيا وتعقيم موقع الجراحة مع بتدين والكحول (3X) وتغطية عيون الماوس مع مرهم.

2. عملية جراحية

1. جعل 1 سم طولية وسطي شبه الرضفي شق لفضح مفصل الركبة.
2. فتح مفصل الركبة بلطف من خلال خلع الجانبي من الرضفة والرباط الرضفي.
   1. قطع كبسولة مفصل الركبة طوليامن خلال شق وسطي شبه الرضفي في الخطوة 2.1.
   2. تشريح الركبة كبسولة مشتركة مع ملقط.
   3. الاستيلاء على الجزء الأعلى من الخلفيتين مخلب مع اليد اليسرى، وأداء خلع الجانبي من الرضفة والرباط الرضفي بالملقط. عقد مخلب الخلفيتين بلطف وتأكد لتجنب الصدمة في مخلب. أفضل يتم تشريح الكبسولة المشتركة، وسوف تكون هناك حاجة أقل قوة لجعل التفكك.
3. بالتنقيط ملحي معقم على سطح الغضروف المفصلي أثناء التشغيل لتجنب جفاف سطح الغضروف.
4. قطع طريق الرباط الإنسي الذي meniscotibial المراسي الغضروف المفصلي الإنسي إلى الهضبة الظنبوب. تجنب اصابة الغضروف تحت الغضروف المفصلي وسطي.
   1. تحديد الغضروف المفصلي الإنسي الذي يقع بين اللقمة وسطي من عظم الفخذ والظنبوب الإنسي الهضبة.
   2. تحديد meniscotibial الرباط الذي يربط الجانب الوحشي من الغضروف الأنسي مع سماحة بين لقمتي الظنبوب.
   3. عقد مرحباالثانية مخلب بلطف مع اليد، وقطع طريق الرباط الإنسي meniscotibial بعناية باستخدام رقم 10 شفرة جراحية. تأكد من عدم تسبب تجرح إلى الغضروف المفصلي والأربطة الأخرى. في كثير من الحالات، لوحة الدهون التي تغطي يحتاج ليتم سحبها إلى الجانب ولكن لا يمكن إزالتها من أجل التعرف على الرباط.
5. إغلاق كبسولة مفصل الركبة مع 6-0 خياطة للامتصاص.
6. إغلاق الجلد مع خياطة الحرير 6-0.

3. الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية

1. تطبيق قطرة واحدة من 0.25٪ بوبيفاكايين في موقع العمليات الجراحية في كل فأر لتقليل الألم بعد الجراحة.
2. ترك الفئران تعمل تتردد في الحصول على الماء والغذاء.

4. التهديف النسيجي للDMM الجراحية النموذجي

1. التضحية الفئران عند نقاط المشار الوقت (على سبيل المثال 4 أسابيع و 8 أسابيع و 12 أسبوعا. هنا أظهرنا نتائج 8 أسابيع كممثل) بعد الجراحة.
2. يتم إصلاح مفاصل الركبة بالكامل، مخلص من الكالسيوم، EMBEdded بواسطة البارافين ثم مقطوع متسلسل في 5 فاصل ميكرون.
   1. قطع أطرافه الخلفية كامل مع رقم 10 ريش.
   2. تشريح الجلد وعضلات الأطراف الخلفية بعناية، وتحديد العينات مع PFA 4٪ لمدة 3 أيام في RT.
   3. إزالة PFA، وتنظيف العينات بالماء. بعد ذلك، يزيل الكلس في EDTA العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 2 اسابيع.
   4. يذوى العينات في التدرج الايثانول. في التفاصيل، والحفاظ على العينات في الايثانول 70٪ لمدة 1 ساعة، ثم تغيير الإيثانول والحفاظ على العينات في مجموعة جديدة من الايثانول 70٪ لO / N. بعد ذلك، ووضع العينات في 80٪ و 90٪ من الإيثانول بالتالي، والاحتفاظ بها لمدة 1 ساعة، على التوالي، تليها الإيثانول بنسبة 100٪ لO / N.
   5. إزالة الايثانول. الحفاظ على العينات في oxylene لمدة 1 ساعة، وتغيير مجموعة جديدة من oxylene. كرر هذه الخطوة 3X.
   6. تضمين العينات في قالب البارافين باستخدام مركز التضمين لايكا. بعد ذلك، يتم مقطوع العينات في 5 ميكرون باستخدام مشراح الدوارة (لايكا RM2255، ألمانيا) ثم جمعت على الشرائح الزجاجية.
   7. يتم قطع المقاطع السهمي المسلسل لكل عينة والتي تمتد من منطقة وسط اللقمة الجانبية لمركز اللقمة الإنسية.
3. يتم تنفيذ Safranin O تلطيخ، تليها التهديف والتحليل الإحصائي من خلال نظام التسجيل OARSI كما هو موضح سابقا ^25.
   1. الأولى، deparaffinize الشرائح في oxylene، وهيدرات لهم في التدرج الإيثانول إلى الماء المقطر. بعد ذلك، هي ملطخة الشرائح من خلال الحديد الهيماتوكسيلين الحل بحسب فايغرت، 0.05٪ الأخضر السريع (FCF) محلول، 1٪ حمض الخليك الحل، و 0.1٪ Safranin O الحل. جبل الشرائح المتوسطة باستخدام راتنجية.
   2. يسجل الشرائح ملطخة Safranin O على أساس فقدان بروتيوغليكان (اللون الأحمر) في الغضروف ونسبة الدمار في بنية الغضروف، القيام بتحليل إحصائي لدرجة النسيجي.

النتائج

تأسست DMM النموذج بنجاح في الفئران، ونقص PGRN المبالغة تطوير الزراعة العضوية التي يسببها جراحيا.

وأجريت عمليات صورية وDMM (الشكل 1) في WT وPGRN / - الفئران. بعد 8 أسابيع العملية، تم التضحية الفئران، وأجريت Safranin O تلطيخ على ...

Discussion

وتفيد التقارير بأن سلالة من الفئران من المهم جدا لنموذج DMM الاستقراء، كما سلالات مختلفة من الفئران متفاوتة شدة OA بعد DMM، مع أعلى مستوى في سلالة 129/SvEv، تليها C57BL6، 129/SvInJ ثم FVB / ن ^26. يتم إنشاء جزء كبير من الجينات المحورة في الفئران C57BL6، مثل PGRN / - الفئران استخدمنا في هذ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
No. 10 Surgical blades	Feather	25-2976#10
6-0 suture	Applied Dental	WG-N53133