Einrichtung einer chirurgisch-induzierten Modell bei Mäusen, die Rolle der Schutz Progranulin in Osteoarthritis Untersuchen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM)-Modell bei Mäusen, ein wirksames Instrument für Osteoarthritis (OA) Forschung. Darüber hinaus haben wir diesen Mangel an progranulincan übertreiben OA Entwicklung und Progression von mit diesem Modell gezeigt, das anzeigt, dass progranulin spielt eine schützende Rolle in der Pathogenese der OA.

Zusammenfassung

Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) Modell ist ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der pathophysiologischen Rollen von zahlreichen Arthritis assoziierten Molekülen in der Pathogenese von Osteoarthritis (OA) in vivo. Allerdings ist die detaillierte, vor allem die visualisiert Protokoll für die Einrichtung dieses kompliziertes Modell bei Mäusen, ist nicht verfügbar. Dabei nutzten wir die Wildtyp-und progranulin (PGRN) - / - Mäuse als Beispiele ein Protokoll zur Induktion DMM Modell bei Mäusen, und verglichen das Auftreten von OA folgende Einrichtung dieser chirurgisch induzierten Modell einzuführen. Die an Mäusen durchgeführten Operationen waren entweder Schein-Operation, die gerade geöffnet Gelenkkapsel oder DMM-Operation, die die menisco-Schienbeinbandes geschnitten und verursachte Destabilisierung des medialen Meniskus. Schwere Arthrose wurde mit histologischen Test (z. B. Safranin-O-Färbung), Ausdrücke der OA-assoziierten Gene, Abbau von Knorpel extrazellulären Matrix-Moleküle und Osteophyten Form ausgewertetation. Mäuse, und der Verlust der PGNR Wachstumsfaktor führte zu einer schweren OA Phänotyp in dieser chirurgisch induzierten Modell - DMM Vorgang erfolgreich OA Initiierung und Progression sowohl in Wildtyp-und PGRN-/ induziert.

Einleitung

Osteoarthritis (OA), auch als degenerative Arthritis bekannt ist, betrifft 15% der Weltbevölkerung und mehr als 46 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und wird von Synovitis, Knorpeldegeneration und Osteophytenbildung ¹ gekennzeichnet. Es kann ein Ergebnis eines komplexen Zusammenspiels von genetischen, metabolischen, biomechanischen und biochemischen Faktoren. Die zugrunde liegenden Mechanismen der OA auch weiterhin die wissenschaftliche Gemeinschaft zu entziehen. Derzeit gibt es zahlreiche Tiermodelle, die die Pathogenese der OA ^2,3 nachahmen kann. Es ist wichtig zu Tiermodellen bei Mäusen, weil sowohl die Verfügbarkeit von verschiedenen genetisch veränderten Mäusen und die Wirtschaftlichkeit Experimentieren herzustellen. Unter den verschiedenen Arten von Versuchs OA Modellen ist die chirurgisch induzierten Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM)-Modell ein gut angenommen OA-Modell aufgrund seiner guten Reproduzierbarkeit und einem relativ langsamer Progression bei OA Entwicklung. Beide dieser Attributeder Schlüssel für die Bewertung der Progression OA in verschiedenen Behandlungen oder Transgene ^3-8. Jedoch wird die Konsistenz der chirurgischen OA Modell durch verschiedene Faktoren während der Operation und als Ergebnis beeinflusst, ist die Anwendung von chirurgischen Mausmodell beschränkt.

Progranulin (PGRN) ist ein multifunktionales Wachstumsfaktor in verschiedenen Zellen exprimiert. Es ist bekannt, dass PGRN spielt eine entscheidende Rolle bei unterschiedlichen physiologischen und Krankheitsprozessen wie der Wundheilung ^9, Tumorgenese ^{10, 11-15} und Entzündungen. Studien auch gezeigt, dass unzureichende PGRN können degenerative Erkrankungen des Nervensystems bei Menschen und Mäusen ^16-18 führen. Es ist bekannt, dass PGRN in menschlichen Gelenkknorpel ausgedrückt, und der Wert ist signifikant im Knorpel des Patienten mit Arthrose und rheumatoide Arthritis ¹⁹ erhöht. Darüber hinaus spielt PGRN auch eine entscheidende Rolle in Chondrozytenproliferation ^20, Differenzierung und endochondralenVerknöcherung der Wachstumsfuge während der Entwicklung ^21,22. Vor kurzem berichteten wir, dass PGRN TNF-α antagonisiert durch Bindung an TNF-Rezeptoren und zeigten eine entzündungshemmende Funktion bei entzündlichen Arthritis-Modellen ^13,14,23,24. Jedoch ist die Rolle der PGRN in OA, insbesondere in vivo, bleibt ein Rätsel sein. Hier stellen wir das Verfahren zur chirurgischen DMM Modell zu induzieren, und untersuchen die Rolle der PGRN in OA Entwicklung durch Gründung DMM Modell in WT-und PGRN-/ - Mäusen.

Protokoll

Alle chirurgischen Verfahren in Bezug auf die Tiere sollten durch lokale Institution Tierpflege-und Ethik-Kommission, mit einer Anstrengung, um Schmerzen und Beschwerden durch die Operation zu minimieren genehmigt werden.

1. Vorbereitung

1. Wählen 8-12 Wochen alten männlichen C57BL / 6 Mäusen mit einem Körpergewicht von ca. 25 g für eine Operation.
2. Betäuben die Tiere durch intraperitoneale Injektion eines Cocktails, die sowohl Xylazin (5 mg / kg) und Ketamin (40 mg / kg).
3. Rasieren Sie die Knie mit Rasierer, dann chirurgisch drapieren das Tier sterilisieren und die Operationsstelle mit Betadine und Alkohol (3x) und decken die Augen mit der Maus Salbe.

2. Chirurgische Verfahren

1. Machen Sie eine 1 cm medial Längs para-Patella-Inzision Kniegelenk aus.
2. Öffnen Sie vorsichtig das Kniegelenk durch seitliche Luxation der Kniescheibe und Kniescheibenbandes.
   1. Schneiden Sie das Kniegelenk Kapsel längsdurch den medialen Kniescheiben para-Schnitt im Schritt 2.1.
   2. Dissect Knie Gelenkkapsel mit einer Pinzette.
   3. Nimm den distalen Teil des Hinterpfote mit der linken Hand und führen seitliche Verschiebung der Kniescheibe und Kniescheibenbandes mit einer Pinzette. Halten Sie die Hinterpfote vorsichtig und stellen Sie sicher, Trauma in der Pfote zu vermeiden. Je besser die Gelenkkapsel wird seziert, desto weniger Kraft erforderlich, um die Verschiebung zu machen.
3. Tropfen steriler Salz auf der Oberfläche des Gelenkknorpels im Betrieb Austrocknen Knorpeloberfläche zu vermeiden.
4. Messer durch die mediale meniskotibialen Band, das mediale Meniskus zum Tibiaplateau verankert. Nicht zu verletzen, den Knorpel unter der medialen Meniskus.
   1. Identifizieren Sie die Innenmeniskus, der zwischen medialen Kondylus des Oberschenkelknochens und des medialen Plateau der Tibia lokalisiert.
   2. Identifizieren Sie die meniskotibialen Band, das mit Eminentia intercondylaris der Tibia lateralen Seite des medialen Meniskus verbindet.
   3. Halten Sie die hallond Pfote sanft mit der Hand, und schneiden durch die mediale meniskotibialen Bänder vorsichtig mit einem Skalpell Nr. 10. Achten Sie darauf, nicht zu verletzen bewirken, Knorpel und andere Bänder des Gelenkknorpels. In vielen Fällen muss die Abdeckung Fettpolster zur Seite gezogen werden, jedoch nicht, um das Band zu identifizieren entfernt werden.
5. Schließen Sie das Kniegelenk Kapsel mit einem 6:0-resorbierbares Nahtmaterial.
6. Schließen Sie die Haut mit 6-0 Seidenfaden.

3. Postoperative Pflege

1. Einen Tropfen 0,25% Bupivacain in der Operationsstelle jeder Maus, um postoperative Schmerzen zu minimieren.
2. Lassen Sie die betrieben Mäusen frei, Wasser und Nahrung zu erhalten.

4. Die histologische Bewertung der chirurgischen DMM Modell

1. Opfere die Mäuse zu den angegebenen Zeitpunkten (zB 4 Wochen, 8 Wochen und 12 Wochen. Hier zeigten wir Ergebnisse von 8 Wochen Vertreter) nach der Operation.
2. Die gesamte Kniegelenk fixiert, entkalkt, embevon Paraffin dded und dann seriell auf 5 um Intervall geschnitten.
   1. Schneiden Sie die ganze Hinterbeine mit der Nr. 10 Klingen.
   2. Präparieren Sie die Haut und die Muskeln der Hinterbeine vorsichtig, und fixieren Sie die Proben mit 4% PFA für 3 Tage in der RT.
   3. Entfernen Sie die PFA, und reinigen Sie die Proben mit Wasser. Danach entkalken die Proben in EDTA bei 4 ° C für 2 Wochen.
   4. Entwässern der Proben in einem Ethanol-Gradienten. Im Einzelnen halten die Proben in 70% Ethanol für 1 Stunde, dann ändern Sie das Ethanol und halten Sie die Proben in einem neuen Satz von 70% Ethanol für O / N. Danach setzen Sie die Proben in 80% und 90% Ethanol daher und halten sie für 1 Stunde, jeweils gefolgt von 100% Ethanol für O / N.
   5. Entfernen Sie das Ethanol. Bewahren Sie die Proben in o-Xylol 1 h, und wechseln Sie in einer neuen Reihe von o-Xylol. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
   6. Betten Sie die Proben in einem Paraffin Form mit der Leica Einbettung Zentrum. Anschließend werden die Proben bei 5 &mgr; m unter Verwendung eines Rotations Mikrotom (Leica RM225 Schnitt5, Deutschland) und anschließend auf Glasobjektträgern gesammelt.
   7. Serien Sagittalschnitte werden für jede Probe überspannt einen Bereich von der Mitte der lateralen Kondylus an der Mitte des medialen Kondylus geschnitten.
3. Safranin-O-Färbung durchgeführt wird, gefolgt von Ritzen und statistische Analysen durch OARSI Scoring-System ^25, wie vorher beschrieben.
   1. Zunächst entparaffinieren Folien in o-Xylol, und Hydrat sie in einem Ethanol-Gradienten zu destilliertem Wasser. Danach werden die Folien durch Weigert Eisenhämatoxylin Lösung, 0,05% Fast Green (FCF) Lösung, 1% Essigsäure-Lösung und 0,1% Safranin O Lösung gefärbt. Montieren Sie die Folien mit harzigen Medium.
   2. Ergebnis der Safranin O gefärbten Objektträger, basierend auf Verlust von Proteoglykan (rote Farbe) im Knorpel und den Prozentsatz der Zerstörung im Knorpelstruktur, tun statistischen Analyse für die histologische Score.

Ergebnisse

DMM Modell wurde erfolgreich an Mäusen etabliert und Mangel an PGRN übertrieben chirurgisch-induzierten OA Entwicklung.

Mäuse - Sham und DMM-Operationen (Abbildung 1) wurden in WT-und PGRN / durchgeführt. 8 Wochen nach der Operation wurden die Mäuse getötet, und Safranin-O-Färbung wurde in den Kniegelenken von Abschnitten durchgeführt wird, gefolgt von einer statistischen Analyse der Arthritis-Score auf Basis der Histologie. Wie in 2A

Diskussion

Es wird berichtet, dass der Stamm von Mäusen ist sehr wichtig für DMM Modell Induktion, als verschiedene Stämme von Mäusen haben unterschiedliche Schwere der OA nach DMM, mit höchstem Niveau in der 129/SvEv Stamm, gefolgt von C57BL6, 129/SvInJ und dann FVB / n ^26. Mäuse, die wir in der vorliegenden Studie eingesetzt, die relativ anfällig für DMM sind - Ein großer Teil der Transgene in C57BL/6-Mäuse, wie PGRN-/ etabliert. Wenn das Transgen auf Stamm unempfindlich wie FVB / N-Mäusen basiert, ist es j...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
No. 10 Surgical blades	Feather	25-2976#10
6-0 suture	Applied Dental	WG-N53133