Submillisecond بتكوين جزئي التغييرات في البروتينات حلها بواسطة شعاع ضوحراري الإمالة

Summary

نحن هنا الإبلاغ عن تطبيق تقنية انحراف شعاع حراري ضوئي؛ بالاشتراك مع مركب الكالسيوم في قفص، DM-nitrophen، لرصد ميكروثانية وميلي ثانية واحدة ديناميكية و طاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة ارتباط الكالسيوم إلى الخلايا العصبية جهاز استشعار الكالسيوم، العنصر التنظيمي المصب خصم المغير .

Abstract

ضوحراري شعاع انحراف معا مع الصورة الصوتية الكالوري وصريف الحرارية ينتمي إلى عائلة من أساليب حراري ضوئي؛ التي ترصد حجم والمحتوى الحراري تغييرات التوقيت الشخصى الضوء الناجم عن التغيرات متعلق بتكوين جزئي في البروتينات على ميكروثانية إلى ميلي ثانية واحدة وقت القشور التي لا يمكن الوصول إليها باستخدام محطة التقليدية أدوات التدفق. بالإضافة إلى ذلك، منذ يتم بحثها التغييرات الشاملة في حجم و / أو المحتوى الحراري، وهذه التقنيات يمكن تطبيقها على البروتينات والجزيئات الكبيرة الحيوية الأخرى التي تفتقر إلى fluorophore وأو تسمية حامل اللون. لرصد ديناميات وعلم الطاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة كا ^{2 +} ملزمة لمحولات الكالسيوم، مثل أجهزة الاستشعار الكالسيوم العصبية، وهو مركب الكالسيوم في قفص، DM-nitrophen، ويعمل على الصورة الزناد زيادة سريعة (τ <20 μsec) في الكالسيوم الحرة يتم بحثها تركيز وحجم والمحتوى الحراري المرتبطة التغييرات باستخدام شعاع حراري ضوئي؛ تقنية انحراف.

Introduction

أساليب الصورة الحرارية مثل الكالوري الضوئي، شعاع حراري ضوئي؛ انحراف (PDB)، وصريف عابرة إلى جانب الإثارة الليزر النانوسيكند تمثل بديلا قويا لعابرة spectroscopies البصرية للدراسات وقت حل وسيطة قصيرة الأجل ^1،2. وعلى النقيض من التقنيات البصرية، مثل امتصاص الأشعة تحت الحمراء الطيفي وعابرة، التي ترصد الشخصى الوقت من التغييرات في امتصاص حامل اللون المحيطة بها؛ تقنيات حراري ضوئي؛ كشف عن الاعتماد وقت التغييرات الحرارة / حجم، وبالتالي هي أدوات قيمة للتحقيق في وقت لمحات بصريا عمليات "الصامتة". حتى الآن، وقد تم تطبيق الكالوري الضوئي وصريف عابرة بنجاح لدراسة ديناميكية بتكوين جزئي للعمليات التي يسببها الصورة بما في ذلك الهجرة ثنائ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. عينة الاستعدادات

1. تنفيذ إعداد العينات وجميع التلاعب العينة في غرفة مظلمة لمنع حدوث uncaging غير المرغوب فيها.
2. ذوبان DM-nitrophen ((1 - (2-4-نيترو ،5-ديميثوكسي فنيل) - N، N، N '، N' tetrakis [(أوكسي كربونيل) الميثيل] -1،2-ethanediamine) في 50 ملي HEPES العازلة، 100 ملي بوكل، ودرجة الحموضة 7.0 إلى تركيز النهائي من 400 ميكرومتر (ε = _350nm 4330 M ^-1 سم ^{-1 9).}
3. إضافة و CaCl ₂ من محلول....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وهناك مثال ممثل PBD يتتبع لكا ^{2 +} الصور الإفراج عن كا ^{2 +} DM-nitrophen هو مبين في الشكل (3). المرحلة سريع يتوافق مع الصور الانقسام من كا ^{2 +} DM-nitrophen وكا ^{2 +} التحرر، في حين أن المرحلة بطيئة يعكس كا ^{2 +} ملزمة إلى القفص nonphotolysed. مؤامرة من PBD السعة العي?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

مبدأ المادية وراء أساليب حراري ضوئي؛ هو أن جزيء الصورة متحمس تبدد الطاقة الزائدة عن طريق الاسترخاء الذبذبات الى ارض الدولة، مما أدى إلى التسخين الحراري من ^1،12 المذيب المحيطة بها. للمذيبات مثل الماء، وهذا ينتج توسع حجم السريع (ΔV _عشر). جزيئات الحالة المثارة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300