رصد التغيرات في غشاء التقاطب، غشاء النزاهة، وبين الخلايا ايون التركيزات في<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; استخدام الأصباغ نيون

Summary

على عكس ما تشهده لحقيقيات النوى، وهناك ندرة في الدراسات التي الاستقطاب الغشاء التفاصيل وتركيز أيون التغييرات في البكتيريا، في المقام الأول وصغر حجمها يجعل الأساليب التقليدية لقياس صعوبة. هنا، ونحن البروتوكولات التفاصيل لرصد مثل هذه الأحداث في الغرام إيجابية هامة الممرض العقدية الرئوية باستخدام تقنيات مضان.

Abstract

الاستقطاب الغشاء والأيونات تدفقات هي الأحداث التي تمت دراستها على نطاق واسع في النظم البيولوجية بسبب قدرتها على التأثير بعمق الوظائف الخلوية، بما في ذلك علم الطاقة وtransductions الإشارة. في حين أن كلا أساليب الفلورسنت والكهربية، بما في ذلك استخدام القطب والتصحيح، لقط، تم متطورة لقياس هذه الأحداث في الخلايا حقيقية النواة، ومنهجية لقياس أحداث مماثلة في الكائنات الحية الدقيقة أثبتت أكثر تحديا لتطوير نظرا لحجمها الصغير في تركيبة مع أكثر تعقيدا السطح الخارجي للبكتيريا يحمي الغشاء. خلال دراساتنا من الموت الشروع في العقدية الرئوية (المكورات الرئوية)، أردنا توضيح دور الأحداث الغشاء، بما في ذلك التغيرات في قطبية، والنزاهة، وتركيزات أيون بين الخلايا. البحث في الأدب، وجدنا أن عدد قليل جدا من الدراسات وجود لها. وكان المحققون أخرى رصدها امتصاص النظائر المشعة أو التوازن لقياس انفلونزا أيونXES وغشاء المحتملة وعدد محدود من الدراسات، ومعظمها في الكائنات سالبة الجرام، قد شهدت بعض النجاح باستخدام carbocyanine أو oxonol الأصباغ الفلورية لقياس غشاء المحتملة، أو تحميل البكتيريا مع خلايا acetoxymethyl نفيذ (AM) إصدارات استر حساسة ليثيوم مؤشر الأصباغ الفلورية. لذا أنشأنا والبروتوكولات الأمثل لقياس غشاء المحتملة، وتمزق، وايون النقل في الحي إيجابية الجرام S. الرئوية. طورنا البروتوكولات باستخدام الصبغة مكرر oxonol DiBAC ₄ (3) وخلايا الصبغة impermeant يوديد propidium لقياس الاستقطاب الغشاء وتمزق، على التوالي، فضلا عن أساليب لتحميل أمثل المكورات الرئوية مع استرات AM من الأصباغ ratiometric FURA-2، PBFI، وBCECF للكشف عن تغيرات في تركيزات داخل الخلايا كا ^{2 +،} K ^+، وH ^+، على التوالي، وذلك باستخدام لوحة قارئ مضان الكشف. هذه البروتوكولات هي الأولى من نوعها لالمكورة الرئويةوغالبية هذه الأصباغ لم يتم استخدامها في أي نوع من الأنواع البكتيرية الأخرى. على الرغم وقد تم تحسين بروتوكولات لدينا S. الرئوية، ونحن نعتقد أن هذه الأساليب تشكل نقطة انطلاق ممتازة لدراسات مماثلة في الأنواع البكتيرية الأخرى.

Introduction

وقد حددت لدينا مختبر مجمع البروتين الدهني من الحليب البشري اسمه هاملت (لالإنسان ألفا ألبومين اللبن مصنوعة قاتلة للخلايا السرطانية) أن يستحث موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية، ولكن هي أيضا قادرة على قتل مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية ^1،2. وكانت الأنواع التي وجدت لتكون حساسة بشكل خاص تلك التي تستهدف الجهاز التنفسي، مع العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) عرض أعظم حساسية والنمط الظاهري مثل موت الخلايا المبرمج وفاة ^2،3. الأحداث النقل الاستقطاب الغشاء والأيونات محددة هي موصوفة وصفا جيدا والأحداث الحاسمة خلال موت الخلايا المبرمج في الخلايا حقيقية النواة، خاصة في الميتوكوندريا، حيث استخدمت TPP المشعة ⁺ الأيونات والأصباغ الفلورية بما JC-1 وTMRE لإثبات الاستقطاب للغشاء الميتوكوندريا ^{3 -5.} وبالتالي، سعينا لمعرفة المزيد حول تأثير هاملت على هذه الميزات ذات الصلة في غشاء الرئوية كما ركزنا جهودنا لتطوير فهم أفضل للمكونات الميكانيكية من النمط الظاهري مثل موت الخلايا المبرمج في البكتيريا، مع إمكانات كبيرة للعلاجات المضادة للبكتيريا تحديد رواية أو اللقاحات المرشحة في هذه العملية.

في السعي لوضع بروتوكولات للدراسات الآلية لدينا، اكتشفنا أنه خلافا للمنهجية موصوفة وصفا جيدا في أنظمة حقيقية النواة، وهناك عدد قليل جدا من الدراسات التي نشرت تفاصيل آليات الكهربية والنقل ايون من ^6،7 غشاء البكتيريا. ويعزى هذا أساسا إلى حجم أصغر من الكائنات الحية الدقيقة والهندسة المعمارية سطحها، وخصوصا وجود جدار الخلية، والتي تقيد الوصول للغشاء لاستخدام الأساليب التقليدية مثل حقيقية النواة لقط التصحيح، على الرغم من أن بعض الدراسات باستخدام protoplasts العملاقة وقد أجريت بدرجات متفاوتة من النجاح ^8،9. كما عمل مع هذه protoplasts العملاقة ليست طريقة مثالية أو حتى العملية لمعظم الأنواع البكتيرية لأنه يتطلب رجلالبكتيريا ipulated في حالة غير طبيعية وغير الحيوية، ودراسات محدودة من بكتيريا قطبية غشاء التي تم تنفيذها قد استخدمت في المقام الأول التدفق الخلوي واستخدام cyanine وoxonol الأصباغ الفلورية ^10-16.

بدلا من التدفق الخلوي، التي تجمع قراءات مضان الفردية من بكتيريا واحدة في كل نقطة زمنية واحدة، واخترنا لاستخدام قارئ لوحة مضان الكشف للكشف عن كثافة مضان من تعليق البكتيرية في شكل لوحة 96 جيدا مع مرور الوقت. هذا مكننا لعلاج السكان من البكتيريا في نقاط زمنية مختلفة مع أكبر بكثير البساطة وسهولة، وبشكل مستمر رصد حركية مضان من السكان لفترات طويلة من الزمن، وهو أمر صعب تحقيقه من خلال استخدام التدفق الخلوي. بعد اختبار مجموعة واسعة من الأصباغ الفلورية المحتملة تراعي (بما في ذلك تلك المذكورة أعلاه للاستخدام مع الميتوكوندريا)، حققنا أفضل نجاح التقنية والعملية باستخداممكرر oxonol صبغة تسمى DiBAC ₄ (3) (مكرر (حمض 1،3-dibutylbarbituric) trimethine oxonol) لرصد التغيرات في قطبية.

وجدنا أيضا أنه قيمة لرصد الاضطرابات في نفس الوقت على سلامة الغشاء باستخدام يوديد propidium (PI). هذه الصبغة تتفلور عليها ملزمة لالحمض النووي، ولكن هو فقط قادرة على القيام بذلك عندما يتم المساس سلامة غشاء البكتيريا، مما يجعلها عنصرا شعبية تستخدم للكشف عن الخلايا الميتة في المقايسات تلطيخ الحية ميتة. بالإضافة إلى PI، SYTOX الخضراء وTO-PRO-1 هي الأصباغ الفلورية التي تشبه في العمل، وقد سبق استخدامها للبكتيريا في عدد قليل من الدراسات التي تستخدم التدفق الخلوي طرق الكشف ^17. اخترنا لاستخدام PI بسبب الطول الموجي الإثارة لأنه سمح لنا لرصد مضان لها بالتزامن مع DiBAC في عينة معينة.

في دراستنا، لاحظنا أن هاملت، فضلا عن مجمع آخر البروتين الدهني ذات الصلة مع النشاط جراثيمالمعروفة باسم ELOA، الاستقطاب الناجم عن وتمزق الغشاء الجرثومي كما يتبين من زيادات في مضان من كل من الأصباغ على علاج المكورات الرئوية ^3،18،26. لكل من المجمعات، لاحظنا أن كثافة مضان من DiBAC ₄ (3) زيادة قبل الزيادة في كثافة PI، مشيرا إلى أن الاستقطاب وقعت قبل تمزق، وبالتالي، حدث معين الناجمة عن لدينا المجمعات البروتين الدهني جراثيم من الفائدة. هذا التمييز مهم لجعل، وتمزق الغشاء يمكن أن يسبب الاستقطاب نفسها غير محددة. يسمح حركية قياس وتحليل كل DiBAC ₄ (3) وPI مضان في وقت واحد منا لدراسة هذه العلاقة بين الحدثين الغشاء، وهي ميزة إضافية لاستخدام التألق بدلا من التدفق الخلوي.

لرصد بكتيريا تدفق أيون، كان هناك بعض النجاح السابق مع استخدام النظائر المشعة، بما في ذلك قياس امتصاص45 كا ^{2 +} في المكورة الرئوية ^19،20، ونحن قد استخدمت أيضا في دراساتنا الأخيرة ^{18 و 21.} ومع ذلك، والعمل مع هذه الأيونات المشعة لديها العديد من السلبيات. يمكن أن يكون مكلفا، وتستغرق وقتا طويلا، والفوضى، ويمكن أيضا أن تعرض الأفراد الذين يؤدون هذه التجربة لإلحاق الضرر، اعتمادا على النظائر من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من الصعب رصد التغيرات السريعة مع مرور الوقت. وبالتالي، لجأنا نحو طريقة بديلة القياس التي تستخدم إصدارات acetoxymethyl (AM) استر من الأصباغ الفلورية مؤشر الحساسة ليثيوم. في حد ذاته، وجهت للصبغ ومؤشر لا تمر عبر الغشاء بسهولة، ولكن مع إضافة مجموعة استر محبة للدهون، يمكن للجزيء الآن بدون تهمة تمر عبر غشاء البكتيريا. عند دخول المناطق الداخلية، والاسترات البكتيرية يلتصق مجموعة استر، وترك الصبغة حرة داخل الخلية واتهم مرة أخرى، وتباطؤ كبير قدرته على الخروج من الخلية والسماح للر صبغس تتراكم داخل بمرور الوقت. ومع ذلك، فقد وصفت فقط استخدام هذه الأصباغ استر في عدد قليل من الأنواع البكتيرية للكشف عن تغيرات في الخلايا كا ^{2 +} H ^{+ 22-24 و16،} مع أساليب مختلفة من التحميل، والكشف، والنجاح.

مع الرغبة في رصد التغيرات في الخلايا كا ^{2 +،} وكذلك ⁺ K ⁺ H والمستويات في S. الرئوية عند العلاج مع هاملت وغيرها من المركبات، أنشأنا بنجاح بروتوكولات لتحميل الأصباغ الفلورية مؤشر بكفاءة في الخلايا البكتيرية. التحميل فعالة في البكتيريا المطلوبة سواء البروبينسيد الذي يزيد احتباس الصبغة عن طريق منع أنيون النقل وPowerLoad، وهو مركب الملكية من تقنيات الحياة تؤدي إلى زيادة الكفاءة التحميل. Fura-2/AM (كشف كا ^{2 +)،} PBFI / AM (كشف K ^+)، وBCECF / AM (H ⁺ كشف) تم تحميلها بنجاح في كل من unencapsulated ومغلفة المكورات الرئوية الحادي والامطار تمكين قياس أنماط مضان الناتج بعد إضافة ionophores، مثل ionomycin (كا ^{2 +} uncoupler)، valinomycin (K ⁺ uncoupler) وCCCP (H ⁺ uncoupler) باستخدام قارئ لوحة مضان كشف ^{18 و 21.}

Protocol

1. إعداد الثقافات البكتيرية

1. تنامي ثقافة للاستخدام في التجارب
   1. في 37 ° C كتلة التدفئة، ذوبان الجليد المجمدة الأسهم قارورة من S. الرئوية وإضافة محتواه إلى 9 مل من الطازجة، prewarmed تود هيويت مرق مع 0.5٪ مستخلص الخميرة (THY) لمجموع حجم 10 مل في أنبوب الثقافة الزجاج.
   2. احتضان ثابت عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة ثقافة سجل منتصف (عبس _{ل 600Nm} ≈ 0.5-0.6).

2. الكشف عن غشاء الاستقطاب وتمزق

1. الكواشف إعداد
   1. إعداد المخزون 50 ميكرومتر من DiBAC ₄ (3) في 100٪ DMSO، و 2 ملغ / مل من الأسهم PI في DDH ₂ O. وDiBAC ₄ (3) السهم مستقرا عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل. الأسهم PI مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.
   2. التفاف أسهم في احباط للحماية من ضوء.
2. تحميلبكتيريا
   1. بيليه الخلايا البكتيرية من الخطوة 1.2.2 بواسطة الطرد المركزي في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرتين عن طريق إزالة طاف، إعادة التعليق على بيليه في 10 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة.
   2. إزالة طاف و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني لحجم الأصلي. هذا وسوف توفر ما يقرب من 10 ⁸ وحدات تشكيل مستعمرة من البكتيريا لكل مل. إزالة 1 مل (ما يكفي لمدة 5 عينات) من خلايا غسلها ووضعها في أنبوب microcentrifuge.
   3. لهذه الخلايا، إضافة 25 ميكرولتر من فلتر تعقيم محلول المخزون 1 M من الجلوكوز (أعدت في DDH ₂ O وتصفيتها من خلال مرشح 0.45 ميكرون) لتركيز النهائي من 25 ملي الجلوكوز، واحتضان في كتلة التدفئة 37 ° C لمدة خمس عشرة دقيقة. ملاحظة: هذا يوفر الطاقة لجميع القنوات غشاء ATP التي تعتمد على والمكونات الخلوية. قد تختلف الحاجة لهذه الخطوة، اعتمادا على التجربة.
   4. إضافة 5 ميكرولتر من (3) 50 ميكرومتر الأسهم DiBAC ₄ و 10 ميكرولتر من الأوراق المالية 2 ملغ / مل PI. وهذا يوفر لتركيزات النهائي من 250 نانومتر و 20 ميكروغرام / لتر، على التوالي. مزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. إضافة 200 ميكرولتر من هذا التعليق الخلية لكل عينة بئر من لوحة واضحة 96 جيدا.
3. الكشف عن مضان
   1. المكان في لوحة prewarmed (37 درجة مئوية) لوحة الكشف مضان القارئ.
   2. تأكد من أن الفلاتر المناسبة في المكان المناسب DiBAC ₄ (3) (490 نانومتر الإثارة، 516 الانبعاثات نانومتر) وPI (535 نانومتر الإثارة، 617 الانبعاثات نانومتر) الكشف.
   3. للسماح ل(ومراقبة في نفس الوقت) من موازنة DiBAC ₄ (3) على الغشاء، تعيين القارئ لأخذ القياسات مضان كل دقيقة لمدة 30-40 دقيقة، أو حتى تستقر القراءة، وهذا بمثابة القراءة "المعالجة".
   4. إخراج لوحة وإضافة عامل التجريبية الاختيار وimmedوضع iately لوحة مرة أخرى في القارئ إلى مواصلة رصد DiBAC ₄ (3) ومضان PI لمدة من الوقت المطلوب. إذا علاج العديد من العينات في وقت واحد، وذلك باستخدام ماصة الأقنية يمكن أن تكون مفيدة لإضافة عامل في وقت واحد لجميع الآبار.
   5. تصدير قراءات لبرنامج تحليل البيانات مثل Microsoft Excel. مؤامرة مضان بمرور الوقت لتقييم الاستقطاب الغشاء وتمزق. زيادة مضان من PI DiBAC ويشير إلى أن الاستقطاب والتمزق التي تحدث.

3. الكشف عن التغييرات في داخل الخلايا كا ^{2 +} K ⁺ أو تركيزات

1. إعداد الكواشف والعازلة تحميل
   1. إعداد الكواشف التالية: 5 ملي الأسهم الصبغة الحساسة ليثيوم الفلورسنت (Fura-2/AM أو PBFI / AM، إضافة كمية مناسبة من DMSO إلى أنبوب يحتوي على 50 ميكروغرام من الصبغة)، "100X" البروبينسيد (إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني لقارورة 77 ملغ). وsolubilizedالأصباغ يمكن تجميد في -20 درجة مئوية مرة واحدة ومستقرة في حل لمدة 3 أشهر، في حين أن البروبينسيد هو مستقر في الحل في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
   2. إعداد 1 مل من 2X تحميل العازلة كما يلي: في الجزء السفلي من البلاستيك 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، تستغني 20 ميكرولتر من 100X PowerLoad التركيز (مستقرة عند 2-8 درجة مئوية لمدة 6 أشهر)، تليها 2 ميكرولتر من أيون 5 ملي تراعي صبغة مباشرة في PowerLoad. دوامة لفترة وجيزة إلى المزيج. إضافة 960 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تليها 20 ميكرولتر من 100X البروبينسيد. دوامة الخليط مرة واحدة نهائية. التفاف في احباط للحماية من ضوء.
2. تحميل البكتيريا مع صبغة
   1. بيليه ويغسل ثقافة مرحلة منتصف سجل للبكتيريا كما هو موضح في 2.2.1. إزالة طاف و resuspend بيليه في 5 مل من برنامج تلفزيوني لتقديم "2X" التعليق الخلية.
   2. إضافة 1 مل من تعليق خلية 2X إلى 2X تحميل العازلة. هذا وسوف توفر عن الحجم النهائي من 2 مل، وconcentr النهائيations من 1X PowerLoad، 5 ميكرومتر صبغة الفلورسنت، و 1X البروبينسيد. ملاحظة: يقدم هذا التعليق ما يكفي من حجم العينات لمدة 10 لأن كل عينة بشكل جيد لقياس سيحتوي 200 ميكرولتر.
   3. احتضان في 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 75 دقيقة، ومحمية من الضوء. ملاحظة: يتم تحميل الصبغة في الخلايا البكتيرية في غياب أي ركائز حال السكر وبحضور البروبينسيد للحد من هروب رأس المال من الصبغة.
   4. المياه والصرف الصحي 1: بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف، و resuspend في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 مل 1X البروبينسيد. المياه والصرف الصحي 2، 3: كرر الخطوة 3.2.4 2X. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. وهذا سوف يسمح الوقت لالاسترات البكتيرية ليتحلل وAM استر مجموعة بعيدا عن الأصباغ الفلورية المنضوية.
   5. المياه والصرف الصحي 4: بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف، و resuspend في 2 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1X البروبينسيد. ملاحظة: اعتمادا على experimeالإقليم الشمالي، والجلوكوز يمكن أن تضاف إلى هنا لإعادة تنشيط البكتيريا.
3. الكشف عن مضان
   1. Prewarm كشف مضان لوحة قارئ لوحة القارئ إلى 37 درجة مئوية.
   2. لكل عينة المطلوب، إضافة 200 ميكرولتر من الخلايا تحميل (من الخطوة 3.2.8) إلى آبار لوحة 96 جيدا. (نفذ الخطوات التالية لإنجاز واحد بشكل جيد / عينة في وقت واحد).
   3. لإنشاء خط الأساس القراءة للبئر، لوحة مكان في الكشف عن مضان لوحة قارئ لقياس مضان (340 نانومتر الإثارة / الانبعاثات نانومتر 510 ل "القيمة 1" و 380 نانومتر الإثارة / الانبعاثات نانومتر 510 ل "القيمة 2") في كل ثانية لمدة دقيقة.
   4. إخراج لوحة، إضافة العلاج الأمثل لذلك جيدا (في حجم صغير من حوالي 5 ميكرولتر)، ماصة بسرعة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط، ووضع على الفور مرة أخرى في الكشف عن مضان لوحة القارئ لقراءة كل ثانية لالمرجوة طول الوقت. (إذا كان فيهي jectors المرتبطة قارئ لوحة المتاحة، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه لإضافة بسلاسة العلاج المطلوب، مما يلغي الحاجة لوقف القراءة وإخراج لوحة).
   5. تصدير قراءات لبرنامج تحليل البيانات مثل Microsoft Excel. حساب نسبة القيم مضان لكل نقطة في الوقت بقسمة القيمة 1 بالقيمة 2، ورسم القيم نسبة على الرسم البياني.

4. الكشف عن التغيرات في درجة الحموضة بين الخلايا

1. إعداد الكواشف ومخازن المعايرة
   1. إعداد الكواشف التالية: 5 ملي الأسهم من BCECF / AM (. إضافة كمية مناسبة من DMSO إلى أنبوب يحتوي على 50 ميكروغرام من الصبغة هذا المخزون هو مستقر في -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر)؛ 100X البروبينسيد (إضافة 1 مل من PBS إلى قارورة 77 ملغ)، 1 ملم من إعداد الأسهم nigericin في الإيثانول (مطلوب للتوازن درجة الحموضة داخل الخلايا (درجة الحموضة _ط) من الخلايا إلى الرقم الهيدروجيني للالعازلة المحيطة هذا المخزون هو قالجدول في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر)؛ 0.5 ملي الأسهم من الكربونيل سيانيد 3 chlorophenylhydrazone (CCCP) في DMSO (protonophore إلى فك الارتباط بين قوة الدافع بروتون هذا المخزون هو مستقر في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر)
   2. تحضير 10 مل من مخازن البوتاسيوم عالية التالية: 135 ملي KH ₂ PO _4/20 ملي هيدروكسيد الصوديوم (أحادى) و 110 ملي K ₂ هبو _4/20 ملي هيدروكسيد الصوديوم (ثنائي القاعدة). فلتر تعقيم باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. (هذه المخازن المؤقتة يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام).
   3. مزيج من مخازن البوتاسيوم عالية في نسب اللازمة لإنشاء مخازن البوتاسيوم عالية مع ما لا يقل عن 5-6 قيم درجة الحموضة تتراوح 6،5-8،0.
   4. إعداد 1 مل من 2X تحميل العازلة كما يلي: في الجزء السفلي من البلاستيك 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، تستغني 40 ميكرولتر من 100X PowerLoad، تليها 20 ميكرولتر من 5 ملم الحساسة ليثيوم صبغة مباشرة في PowerLoad. دوامة لفترة وجيزة إلى المزيج. إضافة 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تليها 40 ميكرولتر من 100X البروبينسيد. Vortبحكم الخليط مرة واحدة نهائية. التفاف في احباط للحماية من ضوء.
2. تحميل البكتيريا مع صبغة
   1. بيليه ويغسل 8 مل من ثقافة مرحلة منتصف سجل للبكتيريا كما هو موضح في 2.2.1. إزالة طاف، بيليه resuspend في 2 مل من برنامج تلفزيوني لتقديم "4x و" التعليق الخلية.
   2. إضافة 1 مل من تعليق خلية 4X 2X إلى تحميل العازلة. هذا وسوف توفر عن الحجم النهائي من 2 مل، وتركيزات النهائي من الخلايا 2X، 2X PowerLoad، 50 ميكرومتر صبغة الفلورسنت، و 2x البروبينسيد.
   3. احتضان في 30 ° C حمام الماء لمدة 40 دقيقة، محمية من الضوء. ملاحظة: يتم تحميل الصبغة في الخلايا البكتيرية في درجة حرارة أقل من 30 درجة مئوية و في غياب أي ركائز حال السكر للحد من هروب رأس المال من الصبغة.
   4. المياه والصرف الصحي 1: بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2400 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف للتخلص من الصبغة الزائدة، وresuspend في برنامج تلفزيوني يحتوي على 4 مل 2X البروبينسيد لالثاني 1 ملي الجلوكوز (لإعادة تنشيط البكتيريا). المياه والصرف الصحي 2، 3: كرر الخطوة 4.2.7 مرتين، مع إعادة تعليق النهائية في 4 مل PBS (لتركيز النهائي من الخلايا 1X) التي تحتوي على البروبينسيد 2X و 10 ملي الجلوكوز.
   5. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وسوف تسمح هذه الخلايا لتنشيط بالكامل وإتاحة الوقت لالاسترات البكتيرية ليلتصق AM استر مجموعة بعيدا عن BCECF المنضوية.
3. إنشاء مضان الخلفية والجسم الحي في منحنى المعايرة
   1. Prewarm كشف مضان لوحة قارئ لوحة القارئ إلى 37 درجة مئوية.
   2. لتحديد مضان الخلفية، فلتر تعقيم حوالي 500 ميكرولتر من تعليق البكتيرية تحميل وتنشيط (من الخطوة 4.2.7) لإزالة البكتيريا، وإضافة 200 ميكرولتر من الترشيح للبئر من لوحة 96 جيدا.
   3. وضع لوحة في الكشف عن مضان لوحة قارئ لقياس مضان (490 نانومتر الإثارة / الانبعاثات 530 نانومتر ل"القيمة 1" و 440 نانومتر الإثارة / الانبعاثات نانومتر 530 ل "القيمة 2") لمدة 1 دقيقة. ينبغي طرح هذا مضان الخلفية قبل احتساب النسب لكل من منحنى المعايرة والعينات التجريبية.
   4. للحصول على منحنى المعايرة في الجسم الحي، وغسل 500 ميكرولتر مأخوذة من خلايا محملة وتنشيط 4.2.7 من الخطوة مرة واحدة وresuspend في مخازن البوتاسيوم عالية في قيم درجة الحموضة مختلفة (تتراوح 6،5-8،0).
   5. إضافة 20 ميكرومتر nigericin للعينات للتوازن درجة الحموضة داخل الخلايا من الخلايا إلى الرقم الهيدروجيني للالعازلة المحيطة بها، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة مجموعات البكتيريا / درجة الحموضة إلى آبار لوحة 96 جيدا.
   6. وضع لوحة في الكشف عن مضان لوحة قارئ لقياس مضان لبضع دقائق لتأسيس القراءة ثابتة لكل بئر. تصدير قراءات لبرنامج تحليل البيانات مثل Microsoft Excel.
   7. بعد طرح باالقيم مضان ckground، وحساب نسبة القيم مضان بقسمة القيمة 1 التي كتبها القيمة 2. رسم القيم نسبة لكل درجة الحموضة عازلة لإنشاء منحنى المعايرة. (يجب أن يتم إنشاء منحنى المعايرة لكل دفعة جديدة من الخلايا تحميل، وكمية من صبغة الفلورسنت التي يتم تحميلها إلى البكتيريا يمكن أن تختلف في كل مرة).
4. قياس التغيرات في درجة الحموضة داخل الخلايا
   1. لكل عينة المطلوب، إضافة 200 ميكرولتر من الخلايا وتنشيط تحميلها (من الخطوة 4.2.7) إلى آبار لوحة 96 جيدا.
   2. وضع لوحة في الكشف عن مضان لوحة قارئ وقياس مضان من العينات كل 5 ثانية لمدة 5 دقائق.
   3. إخراج لوحة وإضافة 10 ميكرومتر CCCP لبئر واحدة (بمثابة مراقبة إيجابية لخفض درجة الحموضة داخل الخلايا) وكيل التجريبية (ق) من الفائدة إلى الآبار الأخرى. لمقارنة بدقة آثارها بمرور الوقت، إضافة CCCP وكلاء من خيار في نفس الوقت باستخدام صباحاultichannel ماصة.
   4. العودة فورا لوحة إلى لوحة قارئ ومواصلة قياس مضان كل 5 ثانية لمدة 10 دقيقة. كعنصر تحكم إضافية، إخراج لوحة وإضافة 20 ميكرومتر Nigericin لجميع العينات للتوازن درجة الحموضة _ط من البكتيريا إلى الرقم الهيدروجيني للالعازلة المحيطة بها، وقراءة لمدة 5 دقائق.
   5. بعد طرح القيم مضان الخلفية، وحساب نسب مضان لكل عينة. أقحم _ط الأس الهيدروجيني لكل القراءة من منحنى المعايرة.

النتائج

لجميع التجارب، وهناك عينة واحدة ومجموعة من الشروط موجودة في كل بئر. وبالتالي، يمثل كل تتبع كثافة مضان من السكان من البكتيريا مع مرور الوقت. ينبغي أن تكون النتائج للتفسير بسهولة، مع تمييز واضح بين مضان من العينات المعالجة وذلك من ضوابط غير المعالجة. يمكن أن حركية ...

Discussion

على الرغم من القيد الذي يطرح حجم واستخدام أساليب الكهربية الكلاسيكية للكشف عن تغيرات في الاستقطاب وسلامة الغشاء والتغيرات في تركيز أيون داخل البكتيريا، التي وصفناها وسيلة لقياس هذه الأحداث في S. الرئوية باستخدام الأصباغ الفلورية. بروتوكولات لدينا هي الأولى من ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100x concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
NaOH	JT Baker	5565-01
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml Plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software