监测改变膜极性，膜完整性和细胞内离子浓度<em&gt;肺炎链球菌</em&gt;使用荧光染料

摘要

不像见过的真核生物中，有研究贫乏，在细菌细节膜去极化和离子浓度的变化，主要是由于它们的小尺寸使得难以测量的常规方法。在这里，我们监测的显著革兰氏阳性病原体肺炎链球菌利用荧光技术这样的事件细节的协议。

摘要

膜去极化和离子通量是已被广泛地研究在生物系统中，由于他们的能力，深刻地影响细胞功能，包括能量和信号转导事件。虽然这两种荧光及电生理方法，包括使用电极和膜片钳，得到了很好的发展，用于测量在真核细胞中这些事件，方法用于测量微生物的类似事件已被证明更具挑战性的发展给它们的小尺寸与更复杂的组合细菌屏蔽膜的外表面。在我们的死亡引发的肺炎链球菌 （肺炎球菌）的研究，我们想阐明膜事件，包括改变极性，完整性和细胞内离子浓度的作用。检索文献，我们发现，很少有研究存在的。其他调查人员监控放射性同位素的吸收或平衡测量离子感XES和膜电位和研究，大多是在革兰氏阴性菌的数量有限，使用碳菁或氧杂菁染料的荧光来测量膜电位，或加载与细胞穿透物的乙酰氧甲基（AM）酯版本细菌已经看到了一些成功离子敏感荧光指示剂染料。因此，我们建立和优化的协议，用于测量在革兰氏阳性生物体S.膜电位，破裂，和离子转运肺炎 ， 我们开发了使用双-氧杂菁染料DIBAC _4（3）和小区浸透染料碘化丙啶来测量膜去极化和破裂，分别，以及方法，以最佳地加载肺炎球菌的比例染料的AM酯协议Fura-2的，PBFI，BCECF和变化来检测细胞内浓度的Ca ^{2 +，K +}和H分别⁺的，使用荧光检测用平板阅读器。这些协议是首个同类型的肺炎球菌与大多数这些染料没有被用在任何其他细菌物种。虽然我们的协议进行了优化，S。肺炎 ，我们相信这些方法应该形成一个很好的起点在其他细菌物种类似的研究。

引言

我们实验室已经确定了从名为哈姆雷特人乳（适用于人α-乳清蛋白制成致命的肿瘤细胞）诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白-脂质复合物，但也能杀死多种细菌种类^1,2。被发现是特别敏感的物种是那些靶向呼吸道， 肺炎链球菌 （肺炎球菌）显示的最大灵敏度和死亡^2,3的凋亡样表型。膜去极化和特定的离子迁移的事件是充分描述并在真核细胞中，特别是在线粒体中，其中放射性TPP ⁺离子和荧光染料包括JC-1和TMRE已被用于证明线粒体膜³的去极化的细胞凋亡过程中的关键事件^-5。因此，我们试图了解更多关于哈姆雷特对这些膜相关的功能在肺炎球菌的影响，因为我们集中我们的努力，开发更好地理解本凋亡样表型中的细菌，与用于识别的过程中新抗菌疗法或疫苗候选物的巨大潜力的机械部件。

在寻 ​​求建立的协议为我们机理研究，我们发现，相对于在真核系统的良好描述的方法，也有极少数已发表 ​​的研究详细介绍了细菌膜^6,7的电生理和离子传输机制。这主要归因于微生物的较小的尺寸和它们的表面架构，尤其是细胞壁的存在，这限制了薄膜的使用常规真核的方法，如膜片钳的可达性，尽管使用巨型原生质一些研究已经混合成功执行^8,9。作为与这些巨型原生质体的工作是不是大多数细菌物种的理想甚或实用的方法，因为它需要人ipulated细菌在一个不自然的和非生物的状态下，细菌细胞膜极性已经执行了有限的研究主要采用流式细胞术和使用花青和氧杂菁荧光染料^10-16。

代替的流式细胞仪，其集个别荧光读数从一种细菌在单一时间点上，我们选择使用荧光检测板读取器来检测细菌悬浮液的荧光强度随时间的96孔板形式。这使我们能够把细菌人口在各时间点与更大的简便和易用性，并持续监测整个人口的荧光动力学的时间延长周期，这是很难实现的使用流式细胞仪。测试各种潜在的敏感的荧光染料（包括上述与线粒体利用提及）之后，我们实现了用最好的技术和实际成功双-氧杂菁染料称为DIBAC _4（3）（双- （1,3 - dibutylbarbituric酸）三甲氧杂菁）来监视改变极性。

我们还发现它有价值使用碘化丙啶（PI）的同时监测该膜的完整性的破坏。这种染料发出荧光结合后的核酸，但只能够这样做，当细菌细胞膜的完整性受到损害，使得它用于检测死细胞在活死染色法测定的流行成分。除了​​PI，SYTOX绿色和TO-PRO-1的荧光染料是在行动相似，先前已被用于细菌利用流式细胞仪检测方法¹⁷几个研究。我们选择使用PI由于其激发波长，使我们能够同时监测其荧光与DIBAC一个给定的样本。

在我们的研究中，我们已经观察到小村庄，以及另一个相关的蛋白 - 脂质复合物与杀菌活性通过增加两种染料的处理后的肺炎球菌^3,18,26的荧光所指示的被称为ELOA，诱发的去极化细菌细胞膜的破裂。对于这两种复合物中，我们观察到，DIBAC ₄的荧光强度（3）增加的PI的强度之前增加，表明破裂之前去极化发生的，因此，引起了杀菌蛋白质-类脂复合体的一个特定的事件兴趣。这种区别是重要的，以作为该膜的破裂本身可引起非特异性的去极化。测量和分析都DIBAC _4（3）和PI荧光动力学同时允许我们研究这两种膜的事件，这是用荧光代替流式细胞仪的一个附加的优点之间的这种关系。

为了监测细菌的离子流，出现了一些以前的成功使用放射性同位素，包括测量的摄取45的Ca ^{2 +}中的肺炎球菌^19,20，我们也用在我们最近的研究^18，21。然而，与这些放射性离子加工有几个缺点。它们可以是昂贵的，耗时的，并且杂乱，并且还可使本个体进行实验伤害，这取决于所感兴趣的同位素。此外，也很难随着时间的推移监视的快速变化。因此，我们转向测量的另一种方法，它采用的离子敏感的荧光指示剂染料乙酰氧甲基（AM）酯版本。由本身的指示剂染料被充电，并通过该膜不容易通过，但增加了亲脂性酯基团的，现在不带电荷的分子能够穿过细菌的膜。一旦进入室内，细菌酯酶裂解酯基，使染料自由在细胞内，并再次充电，显著减缓其能力，退出电池和使染料吨Ø内部积累随着时间的推移。然而，使用这些酯染料只被在几个细菌种类中描述的变化来检测细胞内Ca ^{2 + 22-24}和H ^{+ 16，}具有不同的负载，检测，和成功的方法。

用监视改变细胞内钙欲望^{2 +，}也K ⁺和H ⁺的水平在S.因肺炎与哈姆雷特和其他化合物的治疗，我们成功创建协议来高效地加载荧光指示剂染料进入细菌细胞。有效地加载到所需的两个丙磺舒，通过阻断阴离子转运和电力负荷，自Life Technologies专有的化合物，它提高了装载效率提高了染料滞留细菌。 Fura-2/AM荧光（检测的Ca ^{2 +），PBFI} / AM（检测K ^+），和BCECF / AM（检测H ^+）被成功地装入两个未封装和包封的肺炎球菌ST降雨使所得到的荧光图案的测定除了离子载体，例如离子霉素（Ca ^{2 +}的解偶联剂），缬氨霉素（K ⁺解偶联剂）和CCCP（H ⁺解偶联剂）使用荧光检测板阅读器^18，21的后。

研究方案

1。准备细菌培养

1. 用于实验的生长培养
   1. 在37℃下加热块，解冻冷冻的储存小瓶的S。肺炎和其内容添加到9毫升新鲜，预热的托德-Hewitt肉汤0.5％酵母提取物（THY），用于在玻璃培养管10ml的总体积。
   2. 孵育静态地在37℃，直到培养物达到对数中期_（600nm的绝对值≈0.5-0.6）。

2。检测膜去极化和破裂

1. 试剂的准备
   1. 制备（3）在100％DMSO中的50μM的库存DIBAC ₄和2毫克/毫升的股票的PI在DDH ₂ O。该DIBAC _4（3）库存稳定在-20℃下至少6个月。 PI的股票是稳定在4℃下至少6个月。
   2. 个股包裹在铝箔从光保护。
2. 载入中菌
   1. 通过离心分离沉淀从步骤1.2.2细菌细胞在2400×g下在室温下10分钟，并除去上清液在2400×g离心洗涤两次，重悬沉淀在10ml的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并离心分离机的再持续10分钟。
   2. 去除上清，重悬沉淀在PBS到原来的体积。这将提供约10 ⁸个菌落形成每毫升细菌的单元。除去1毫升（足够用于5个样本）的洗涤细胞并置于微量离心管中。
   3. 到这些细胞中，为25mM的葡萄糖的终浓度添加25微升的葡萄糖的1M过滤灭菌的溶液（制备在DDH ₂ O，并通过0.45μm的过滤器过滤），并孵育在37℃的加热块十五分钟。注：提供的能量为所有依赖ATP的膜通道和细胞成分。需要这个步骤可能会有所不同，这取决于实验。
   4. 加入5微升的50微米DIBAC _4（3）股票和10μl的2毫克/毫升PI股票。这提供了为250nm的最终浓度和20微克/毫升。移液器向上和向下几次调匀。添加200μl的该细胞悬浮液，以明确的96孔板的每个样品孔。
3. 检测荧光
   1. 现浇板在预热（37℃）荧光检测酶标仪。
   2. 确保适当的过滤器，让本DIBAC _{4（3）（490} nm激发，516 nm发射）和PI（535 nm激发，617 nm发射）检测。
   3. 为了让（兼监察）DIBAC ₄的平衡（3）在膜，设置读者采取荧光测量每分钟约30-40分钟，或直至读数稳定，这作为一个“预处理”的阅读。
   4. 退出平板并添加选择的实验药物和立即数iately将板放回读者继续监测DIBAC _4（3）和PI荧光的时间所需要的长度。如果处理多个样品一次，用多通道移液器可以是有帮助的同时添加剂到所有孔中。
   5. 导出读数到一个数据分析程序，如Microsoft Excel中。情节荧光随着时间的推移，以评估膜去极化和破裂。 DIBAC和PI的荧光增加表明，除极和破裂正在发生。

3。检测改变细胞内的Ca ^{2 +}或K ⁺浓度

1. 准备试剂和上样缓冲液
   1. 制备以下试剂：对离子敏感的荧光染料的5mM储备（Fura-2/AM荧光或PBFI / AM;加DMSO的适量含50μg染料的管），“100X”丙磺舒（加1毫升的PBS到77毫克小瓶）。溶解的染料可在-20℃一次冻结并稳定在3个月的溶液，而丙磺舒是稳定的溶液在-20℃下6个月。
   2. 准备加入1ml 2×上样缓冲液如下：在一个15毫升的塑料锥形管的底部，取20μl的100倍型电力浓缩物（稳定在2-8℃下进行6个月），随后加入2微升的5mM的离子的敏感染料直接插入型电力。轻轻振荡混匀。添加960微升PBS接着20μl的100倍丙磺舒。旋涡混合，最后一次。包装在铝箔避光。
2. 中的细菌与染料
   1. 沉淀并如2.2.1中所述洗涤中对数期细菌培养。除去上清，重悬沉淀在5ml PBS中，使一“2×”细胞悬浮液。
   2. 加入1 ml的2倍的细胞悬浮于2×上样缓冲液。这将提供2毫升的最终体积，并最终concentr1X型电力，5微米的荧光染料，和1x丙磺舒ations。注：此悬挂提供了足够的容量为10的样本，因为每个样品以及测量将包含200微升。
   3. 孵育在37℃水浴75分钟，避光。注：该染料被加载到细菌细胞中不存在任何糖基片和在丙磺舒，以尽量减少染料的流出的存在。
   4. 洗1：颗粒的细胞通过离心在2400×g离心10分钟，除去上清液，并含有1x丙磺舒重新悬浮于2ml的PBS中。洗2，3：重复步骤3.2.4 2倍。在37℃下30分钟。这将允许时间为细菌酯酶水解的AM酯基团远离内在荧光染料。
   5. WASH 4：颗粒细胞离心在2400×g离心10分钟，弃上清，重悬在2毫升的PBS中含有1x丙磺舒。注：根据不同的experimeNT，葡萄糖可以加回到这里重新注入活力的细菌。
3. 检测荧光
   1. Prewarm荧光检测板阅读器读板器至37℃。
   2. 对于每个所需的样品，加入200微升的负载细胞（来自步骤3.2.8）的一个96孔板的孔中。 （请执行下列步骤来完成一个井/采样一次）。
   3. 为了建立基线的荧光检测板阅读器测量荧光（340 nm激发/ 510 nm发射的“值1”和380 nm的激发/ 510 nm发射的“值2”）在读的很好，地方板每一秒为1分钟。
   4. 弹出板，加选择的治疗那么好（在小体积的约5微升），迅速吹吸几次混合，并立即放回在荧光检测板阅读器读取每个秒的期望长的时间。 （如果在可与平板阅读器相关联的jectors，这些也可以用于无缝地添加所希望的处理，从而无需停止读和弹出该盘）。
   5. 导出读数到一个数据分析程序，如Microsoft Excel中。计算每个时间点的荧光值的比率除以值1由值2，并绘制在图上的比例值。

4。检测改变细胞内pH值

1. 准备试剂和校准缓冲液
   1. 准备下列试剂：BCECF / AM 5毫米的股票（。添加二甲基亚砜适量含50微克染料的管这个股票是稳定在-20°C为3个月）; 100X丙磺舒（加入1毫升PBS为77毫克小瓶）; 1毫米的股票在乙醇制备尼日利亚菌素的细胞周围的缓冲液的pH为（以平衡细胞内pH值（pH值_我需要的）这个股票是S表在-20℃下6个月）;。羰基氰-3 - 氯苯（CCCP）在DMSO（protonophore，以便拆开质子动力的0.5毫米的股票该股票是稳定在-20℃下6个月）
   2. 准备好10毫升以下含钾高的缓冲液：135 mM的KH ₂ PO _4/20毫米氢氧化钠（一元）和110毫米的K ₂ HPO _4/20毫米氢氧化钠（二元）。过滤消毒用0.45微米的过滤器。 （这些缓冲区可以被保存在4℃直至使用）。
   3. 混合高钾缓冲在必要的比例来创建高钾缓冲至少有5-6的pH值范围为6.5〜8.0。
   4. 准备加入1ml 2×上样缓冲液如下：在一个15毫升的塑料锥形管的底部，取40微升100倍型电力，接着将20μl的5mM离子敏感染料直接插入型电力。轻轻振荡混匀。添加900微升PBS随后加入40μl的100倍丙磺舒。 Vort恩，最后一次混合物。包装在铝箔避光。
2. 中的细菌与染料
   1. 沉淀和洗涤8毫升的半对数期细菌培养物如在2.2.1中描述。去除上清，重悬沉淀在2毫升的PBS做一个“4倍”细胞悬液。
   2. 加入1 ml的4倍的细胞悬浮于2×上样缓冲液。这将提供2毫升的最终体积，并终浓度2倍的细胞，2型电力，50μM的荧光染料，和2x丙磺舒。
   3. 孵育在30℃水浴40分钟，避光。注：染料被装入细菌细胞在30℃的较低温度，并在没有任何糖酵解底物，以减少染料的流出。
   4. WASH 1：颗粒细胞离心在2400×g离心10分钟，弃上清除掉多余的染料，以及含有2倍丙磺舒一个重悬在4毫升的PBSND 1毫米的葡萄糖（恢复活力的细菌）。洗2，3：重复步骤4.2.7两次，在4毫升PBS中再悬浮最终（用于1X细胞的最终浓度）含有2个丙磺舒和10mM葡萄糖。
   5. 在37℃下5分钟。这将允许在细胞充分激励和时间让细菌酯酶裂解AM酯基离内在BCECF。
3. 建立背景荧光和体内的校准曲线
   1. Prewarm荧光检测板阅读器读板器至37℃。
   2. 以确定背景荧光，过滤灭菌约500微升的加载和通电细菌悬浮液（来自步骤4.2.7）以除去细菌，并添加200μl的滤液到96孔板的孔中。
   3. 将板在荧光检测板阅读器测量荧光（490 nm激发/ 530 nm发射的“值1”和1分钟440 nm激发/ 530 nm发射的“值2”）。此背景荧光应为校准曲线和实验样品的比率的计算之前被减去。
   4. 为了获得在体内校准曲线，在高钾缓冲一次，重悬洗加载的，充满活力的细胞500μL分装步骤4.2.7在不同pH值（范围从6.5-8.0）。
   5. 添加20μM的尼日利亚菌素对样品平衡的细胞的细胞内pH值到周围的缓冲液的pH和孵育在37℃下5分钟。加入200μl的细菌/ pH缓冲组合到一个96孔板的孔中。
   6. 将板在荧光检测板阅读器测量荧光几分钟来建立一个稳定的读数为每口井。导出读数到一个数据分析程序，如Microsoft Excel中。
   7. 减去BA后ckground荧光值，除以价值1由Value 2计算出荧光值的比值。绘制每个pH缓冲剂的比例值来创建校正曲线。 （应为每一批新加载的细胞中产生的校正曲线，作为被装入细菌荧光染料的量可以变化，每次）。
4. 在细胞内pH测量的变化
   1. 对于每个所需的样品，加入200微升的加载和通电细胞（来自步骤4.2.7）的一个96孔板的孔中。
   2. 放置板中的荧光检测板阅读器，并测量样品的荧光，每隔5秒5分钟。
   3. 喷射板，并添加10μMCCCP到一个阱（作为阳性对照，以减少细胞内pH）和感兴趣的其它井的试验剂（次）。为了准确地比较不同时间的效果，添加了CCCP和选用的药物同时使用时ultichannel吸管。
   4. 立即将板返回到板阅读器，并继续测量荧光每5秒10分钟。作为一个额外的控制，喷射板，并添加20μM尼日利亚菌素对所有样品达到平衡，细菌的pH值_i到周围的缓冲液的pH，并读5分钟。
   5. 减去背景荧光值后，计算荧光各样品的比率。插pH值_i表示每个读数从校正曲线。

结果

对于所有的实验中，有一个样品和一组存在于每个孔中的条件。因此，每个跟踪指细菌随着时间的整个群体的荧光强度。结果应该是容易解释的，用处理后的样品和未处理对照的荧光有明显区别。在荧光的观察到的变化的动力学和程度可提供约被监视的事件的可能机制及程度。

当探索膜的极性，细菌必须孵育DIBAC约40分钟，以允许染料的平衡过的膜，通过在处理之前的?...

讨论

尽管该大小呈现为使用传统电生理学方法来检测变化的极性和膜和变化在细菌内的离子浓度的完整性的限制，我们已经描述了一种方法来测量在S.这些事件肺炎用荧光染料。我们的协议是首个同类型的肺炎球菌和几个一般描述为细菌的物种之一描述。通过使用荧光检测板读数器，这些事件可以在小的，200微升体积的细菌的样品进行测量，以从细菌随时间的个体群中检测到的荧光。动?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100x concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
NaOH	JT Baker	5565-01
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml Plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software