باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em&gt; الكلاميديا</em&gt; فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

Summary

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Abstract

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

الأمراض المعدية التي تسببها أنواع من البكتيريا المتدثرة الخلايا تثير عبئا كبيرا على الصحة العالمية، بما في ذلك الأمراض المنقولة جنسيا ومرض التهاب الحوض، والعمى، والالتهاب الرئوي، وربما تصلب الشرايين ^1-4. قدرة الكلاميديا ​​للتفاعل مع الخلية المضيفة، من خلال فجوة (وهو ما يسمى إدراج)، هو عامل حاسم للعدوى الناجح للخلايا والمضيف. إدراج هو حجرة المسببة للأمراض الجديدة التي تمكن النمو الناجمة عن المتدثرة ويتم تعديل حيوي طوال دورة كاملة 2-3 يوم التنموية المتدثرة ^5. طبيعة الخلايا تلزم من الكلاميديا ​​تقدم العديد من التحديات للمجتمع العلمي، ولا سيما لدراسة مباشرة بيولوجيا الفريد للإدراج. وثمة عائقا كبيرا في عدم القدرة على تصور بكفاءة إما الكلاميديا ​​داخل الخلايا أو إدراجها من قبل نهج الفلورسنتوفاق في الخلايا الحية. وقد كشفت الاكتشاف الأخير أخيرا وسيلة لتوليد GFP معربا عن C. الحثرية ^6؛ ومع ذلك، لم يؤد هذا الاستنتاج بعد أن وضع العلامات المحددة لإدراج. وقد وصفت بعض التقنيات لوضع العلامات من البكتيريا والادراج ^7،8، لكنها تعاني من قصور مثل عدم التحديد، transiency والقابلية للphotobleaching من. A اكتشاف رئيسي من قبل مجموعتنا إنشاء استراتيجية جديدة لإلقاء الضوء على إدراج باستخدام GFP معربا عن الخلايا المضيفة ^9. هذه الاستراتيجية يستغل بعقلانية الكتامة الجوهرية للغشاء إدراج جزيئات أكبر من 520 دا ^10. عندما صممت الخلايا للتعبير ثابت معين بروتين فلوري عصاري خلوي (على سبيل المثال، أو GFP mCherry)، شوائب الكلاميديا ​​واضحة مع وضوح ملحوظا من قبل استبعادهم كاملة من مضان. هذه الاستراتيجية التصوير العكسي تمكن التصور فوري من الادراج لجميع كلوروفيلالأنواع amydia ويمكن تكييفه بسهولة لمعظم الخلايا المضيفة من الفائدة. كدليل على فائدتها، وقد استخدمت هذه الطريقة سابقا للكشف وتحديد مسارات الخروج الخلوية لالكلاميديا ​​النيابة ^9.

هنا، علينا أن نظهر كذلك كيف يتم تنفيذ هذه الطريقة، ويمكن استغلاله لاستخلاص البيانات الكمية الرئيسية حول ديناميات النمو إدراج. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تحل محل فعال للطرق التعداد القائم على الضد مكلفة، ويمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع العلامات الفلورية الأخرى، مثل mKate2، معربا عن الكلاميديا ^​​11. هذه تركيبة قوية من الأدوات تتيح استكشاف الخصائص الفيزيائية للغشاء إدراج المتدثرة داخل الخلايا الحية المضيفة.

Protocol

1. جيل من خطوط الخلية المضيفة الفلورسنت

1. اليوم 1. لوحة الخلايا 293T (أو غيرها من خط التعبئة والتغليف فيروسات) على 6 لوحات جيدا في 2 × 10 ⁶ خلايا / جيد، لتكون ~ 75٪ متكدسة في اليوم التالي. إذا رغبت في ذلك، لوحة الآبار مكررة لكل الارتجاعي لاستخدامها.
2. 2. يوم الخلايا نضح وإضافة 2 مل متوسطة النمو الطازجة (DMEM + 10٪ FBS + 2 مم L-الجلوتامين). Transfect الخلايا مع 5-8 ميكروغرام لكل من ناقلات فيروسات (التي تحتوي على GFP) وناقلات التعبئة والتغليف (على سبيل المثال، pVSVg) باستخدام Lipofectamine 2000 أو كاشف مماثلة وبعد تعليمات الشركة الصانعة.
3. احتضان الخلايا مع الحمض النووي لمدة 4-6 ساعة في 37 ° C CO ₂ الحاضنة، وبعد ذلك استبدال المتوسطة مع 1 مل متوسطة النمو.
4. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في 37 ° C CO ₂ الحاضنة.
5. يوم الخلايا 3. لوحة الهدف (على سبيل المثال، هيلا) على 6 لوحات جيدة في كثافة التقريبية لل10 ^{5 خلايا} / جيد، لتكون ~ 50٪ متكدسة فياليوم التالي. تحقق ترنسفكأيشن إيجابيا في الخلايا 293T من خلال رصد GFP مضان على مجهر مقلوب.
6. اليوم 4. اجمع supernatants من الخلايا 293T باستخدام ماصة وتصفية طاف من خلال 0.45 ميكرون السليلوز مرشح خلات حقنة تحتوي على الفيروس الارتجاعي.
7. إزالة المتوسطة من خلايا هيلا والمتوسطة إضافة 0.5 مل نمو تحتوي على 16 ميكروغرام / مل polybrene. إضافة ~ 0.5 مل من الفيروس الارتجاعي تصفيتها إلى خلايا قطرة من الحكمة واحتضان خلايا في 37 ° C CO ₂ الحاضنة لمدة 24 ساعة. تخزين أي الارتجاعي المتبقية (أي من تكرار جيد) في 4 درجات مئوية.
8. اليوم 5. إذا قدمت الآبار مكررة لتوليد الارتجاعي إضافية، كرر الخطوة 1.7 لتصيب بشكل متسلسل مع الرجعية الجسيمات المتبقية.
9. اليوم 6. مرور transfected خلايا هيلا 1: 1 إلى 10 سم صحن يحتوي على اختيار المضادات الحيوية (على سبيل المثال، 500 ميكروغرام / مل النيومايسين).
10. انتظر وقتا كافيا للخلايا transduced لتنمو مرة أخرى في وجود اختيار المضاداتالتشنج، وبعد ذلك الخلايا يمكن تروجها التقنيات القياسية مع تركيز أقل من اختيار المضاد الحيوي (على سبيل المثال، 200 ميكروغرام / مل النيومايسين).
    ملاحظة: يمكن أيضا خلايا يتم اختيار متطابق بسلالة لسطوع المثالي في هذا الوقت، إذا لزم الأمر.

2. جيل، معربا عن GFP الكلاميديا

1. إعداد 2X CaCl ₂ العازلة (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 100 ملي CaCl ₂₎ و4SP العازلة (0.4 M السكروز، 16 ملي _نا 2 هبو _4).
2. اليوم 1. ذوبان المجمدة C. الأسهم الحثرية على الجليد وتمييع 10 ميكرولتر البكتيريا على الفور إلى 50 ميكرولتر 2X CaCl ₂ العازلة. إضافة 3 ميكروغرام DNA البلازميد (على سبيل المثال، باسك-GFP-mKate2-L2)، تخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
3. خلال هذه الخطوة، وإعداد الخلايا المضيفة التي كتبها trypsinizing قارورة T-75 من خلايا مكوي في أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي تعليق خلية في 50 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. Resuspenد بيليه الخلية في حجم مناسب من 1X CaCl ₂ العازلة لإعطاء تركيز النهائي من 4 × 10 ⁷ خلية / مل.
4. بعد حضانة 30 دقيقة (من الخطوة 2.2)، إضافة 100 ميكرولتر أعدت خلايا مكوي لأنبوب خليط التحول (الحجم الكلي 200 ميكرولتر) واحتضان لمدة 20 دقيقة إضافية عند 25 درجة مئوية. إضافة 100 ميكرولتر من هذا الخليط الخلية تتحول إلى بئر واحدة من لوحة 6 جيدا وتراكب مع 2 مل النمو المتوسطة. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO ₂ ل 2 أيام.
5. اليوم 3. الخلايا ليز مكوي المصابة مع C. الحثرية عن طريق استبدال المتوسطة مع 1 مل درهم _{2 O} وكشط الخلايا مع عازمة 1000 ميكرولتر طرف الماصة. إضافة 1 مل 4SP العازلة وتمرير تعليق من خلال إبرة 27.5 G ~ 5 مرات لتحلل الخلايا كفاءة وإطلاق C. الحثرية.
6. نقل 2 مل من المحللة الخلية التي تحتوي C. الحثرية إلى T-75 قارورة تحتوي على أحادي الطبقة متموجة من مطلي حديثا مؤسسة تحدي الألفيةخلايا أوي؛ إضافة 8 مل DMEM (بدون FBS)، واحتضان لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية للسماح C. الحثرية التمسك الخلايا.
7. الخلايا نضح وإضافة المتوسطة نمو جديدة تستكمل مع 10 U / مل G البنسلين و1 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد. احتضان قارورة لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية CO _2.
8. اليوم 4. التحقق من قبل المجهر الضوئي أن الخلايا يصاب والادراج يحتوي الكلاميديا ​​الشاذة. تحديد الادراج كما فجوات مشرقة في المجهر ضوء معيار، والهيئات الكلاميديا ​​الشاذة ككائنات مثل حلقة داخل الادراج التي هي أكبر من 2 ميكرون القطر.
9. اليوم 5. ليز الثقافة من خلال استبدال المتوسطة مع 2 مل درهم _{2 O} وتتخلص من الخلايا في التعليق. إضافة 2 مل 4SP العازلة وتمرير تعليق من خلال إبرة 27.5 G ~ 5 مرات.
10. استخدام 2 مل من المحللة الخلية لتصيب أحادي الطبقة جديدة من الخلايا مكوي في بئر واحدة في لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا مع المحللة لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية، ونضح وإضافة النمو العذبةالمتوسط ​​تحتوي على البنسلين G وسيكلوهيكسيميد.
11. احتضان الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية CO ₂ لمدة 3-5 أيام، وهذا يتوقف على الصحة العامة للخلايا.
12. كرر الخطوات من 2،9 حتي 2،10 مرة أو أكثر، حسب الاقتضاء، الثقافات الركض في آبار جديدة في لوحة 6 جيدا حتى ظهرت العادية الادراج تبحث (خالية من الهيئات الشاذة). في هذا الوقت استخدام المجهر مضان مقلوب للتأكد من أن C. الحثرية تعبير عن mKate2 (الحمراء).
13. توسيع نطاق الثقافات المصابة لتوليد الأسهم الناجمة عن المتدثرة عيار عالية، على سبيل المثال عن طريق حصاد transformants الكلاميديا ​​من المصابين مكوي أو هيلا الخلايا المزروعة في T-150 قوارير.

3. التي تصيب الخلايا مع الكلاميديا

1. لوحة الخلايا GFP-هيلا على سفينة الثقافة المطلوبة، على سبيل المثال الأطباق أسفل الزجاج أو الشرائح غرفة لارتفاع القرار التصوير، أو 24 لوحات جيدا لتحديد IFU وفحص multiwell.
2. ذوبان الجليد جيئة وذهاباأنبوب زن تحتوي على C. الحثرية، C. muridarum، أو C. الرئوية على الجليد وتمييع في HBSS إلى تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية)، على سبيل المثال وزارة الداخلية = 1.
3. أداء العدوى إما ثابتة أو بمساعدة الطرد المركزي بناء على سلالة معينة الكلاميديا ​​التي سيتم استخدامها.
   1. للعدوى مع C. الحثرية LGV ضرب مصلي L2 أو C. muridarum، وغسل الخلايا GFP-هيلا مع HBSS واحتضان مع البكتيريا المخفف لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية. نضح وغسل الخلايا مع HBSS، واحتضان الخلايا في النمو المتوسطة في 37 ° C CO ₂ الحاضنة.
   2. للعدوى مع C. الحثرية ضرب مصلي D أو C. الرئوية، وغسل الخلايا GFP-هيلا مع HBSS وإضافة البكتيريا المخفف للخلايا. وضع لوحة multiwell أو الزجاج طبق أسفل (المضمون الشريط في لوحة غطاء multiwell) في حامل لوحة multiwell من الدوار المرفق الدلو المتأرجح في جهاز للطرد المركزي الفوق.
   3. خلايا الطرد المركزي في 900 x ج عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   4. إزالة السفن الثقافة من أجهزة الطرد المركزي ووضعه في الحاضنة 37 درجة مئوية CO ₂ لمدة 1 ساعة.
   5. الخلايا نضح في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، وغسل الخلايا مرتين مع HBSS، وإضافة متوسطة النمو الطازجة. خلايا مكان في 37 ° C CO ₂ الحاضنة.

4. لايف التصور خلية من الكلاميديا ​​الادراج

1. إزالة الكلاميديا ​​الخلايا المصابة GFP-هيلا من CO ₂ الحاضنة واستبدال المتوسطة مع RPMI دون الفينول الحمراء + 5٪ FBS.
2. خلايا جبل على مضان المجهر المقلوب (نيكون الكسوف تي-E أو ما شابه ذلك) باستخدام الهدف 20X أو ارتفاع أسعار النفط.
3. باستخدام برامج التصوير (Volocity 6 أو ما شابه ذلك)، والتركيز على تحديد والكلاميديا ​​الخلايا المصابة GFP-هيلا: الخلايا الخضراء التي تحتوي على ثقوب سوداء كبيرة (الادراج الكلاميديا).
4. كافة المواقع XYZ المناطق التي تحتوي على خلايا الكلاميديا ​​-infected الاهتمام باستخدام برامج التصوير (المجلدocity 6 أو ما شابه). تنفيذ هذا يدويا "إضافة نقاط" أثناء وجوده في وضع العرض XY المرحلة. في هذه الطريقة، يتم حفظ إحداثيات XYZ لكل موقع ملحوظ.
5. في مربع الحوار إعداد الاستحواذ وتكوين برنامج للحصول على الأخضر (GFP، هيلا العصارة الخلوية) والأحمر (mKate2، C. الحثرية) القنوات، وبمعدل إطارات جديدة لكل قناة كل 5 دقائق.
6. الحصول على تسلسل الصور باستخدام اكتساب دخل بروتوكول أعلاه من خلال النقر على "لقطة / سجل" زر.

5. الكميات من معلمات النمو إدراج في الخلايا الحية

1. في بعض الأحيان المرجوة بعد الإصابة (على سبيل المثال، 24، 48 HPI) إزالة الكلاميديا ​​الخلايا المصابة GFP-هيلا من الحاضنة وجبل على مجهر مضان مقلوب. ملاحظة: A الهدف 20X 40X أو الهواء مع ارتفاع NA هو أفضل مناسبة ل24 لوحات جيدة، وينصح هدف النفط 40X الشرائح للغرفة. تنمو الخلايا على أي ركيزة لهذا الحمارعبد المنعم يوسف.
2. التركيز على midplanes من الخلايا، حيث شوائب في أقصى قطر وتسفر عن حواف حادة.
3. الحصول على صور للعديد من المجالات في كل بئر (لا يقل عن 10 لكل بئر)؛ الآبار تمثل عادة مكررات أو المتغيرات التجريبية.
4. تعداد عدد من شوائب يدويا، من خلال العين (شوائب مقصورات سوداء في الخلايا GFP-هيلا) أو استخدام خوارزميات برامج التصوير لتحديد تلقائيا والاعتماد الادراج.
   1. البحث عن خلايا GFP-هيلا بواسطة كثافة مضان ('البحث عن كائنات "الأوامر) وضبط شدة عتبة مضان على أساس كثافة نسبية من الخلايا.
   2. مرشح الكائنات المحددة باستخدام المبادئ التوجيهية حجم حفظ تلك فقط أكبر من 5 ميكرون ^2. هذا هو "السكان 1.
   3. تطبيق 'ملء ثقوب في كائنات "الأوامر باستخدام' السكان 1 'كإدخال. هذه الخطوة بإنشاء "السكان 2.
   4. طرح "السكان 1 'من' صopulation 2 "لانتاج علامة إيجابيا الادراج الكلاميديا، تسمى" السكان 3.
   5. تطبيق فلتر حجم "السكان 3 '(' تصفية سكان" الأوامر)، على سبيل المثال الأجسام حفظ أكبر من 25 ميكرون ² للشوائب في الخلايا المصابة لمدة 24 ساعة أو أكثر. للمرة العدوى المبكرة، مثل قبل 18 ساعة، تعيين مرشح حجم للحفاظ على الأشياء أكبر من 4 ميكرون ^2، وهذه الادراج هي أصغر من ذلك بكثير. النتائج حجم تصفية في عدد الأجسام تسمى "شوائب".
   6. حساب البيانات الكمية من الصور، على سبيل المثال، عدد إدراج، حجم إدراج، ومحيط إدراج، وذلك باستخدام برامج التصوير.

النتائج

خلايا الثدييات التعبير عن البروتينات الفلورية عصاري خلوي (على سبيل المثال، GFP) يمكن هندستها لتمكين إضاءة الادراج الكلاميديا ​​في الحي، مزارع الخلايا المصابة. على العدوى مع الكلاميديا، شوائب مرئية بسهولة على شكل بقع سوداء في الخلايا المضيفة (الشك...

Discussion

نحن هنا تصف استراتيجية تجريبية لتوليد الخلايا المضيفة الفلورسنت التصور في الوقت الحقيقي وتحليل الادراج الكلاميديا. هذا النهج فجوة التصور يمنح القدرة القوية لإلقاء الضوء، تتبع وكميا قياس الخصائص الديناميكية للشوائب المتدثرة عبر السكان من الخلايا أو في زنازين ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534