Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

Resumo

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Resumo

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introdução

Doenças infecciosas causadas por espécies da bactéria intracelular Chlamydia provocar um grande fardo para a saúde global, incluindo doença sexualmente transmissível, doença inflamatória pélvica, cegueira, pneumonia e possivelmente aterosclerose ^1-4. A capacidade de Chlamydia para interagir com a célula hospedeira, a partir de dentro de um vacúolo (denominado a inclusão), constitui um factor determinante para a sua infecção bem sucedida de células e o hospedeiro. A inclusão de um compartimento é patogénico romance que permite o crescimento e clamídia é dinamicamente modificada ao longo de todo o ciclo de desenvolvimento de 2-3 dias de Chlamydia ^5. A natureza intracelular obrigatório de clamídias apresenta inúmeros desafios para a comunidade de pesquisa, em especial para estudar diretamente a biologia única da inclusão. A grande desvantagem tem sido a incapacidade de visualizar de forma eficiente, quer intracelular Chlamydia ou a sua inclusão pela abordagem fluorescentees em células vivas. Uma descoberta recente revelou finalmente os meios de produção de GFP expressando C. trachomatis ^6; no entanto, esta constatação não conduziu ainda a rotulagem específica da inclusão. Algumas técnicas têm sido descritas para a rotulagem de bactérias e inclusões de ^7,8, mas eles sofrem de deficiências, como a não-especificidade, transitoriedade e susceptibilidade à fotodegradação. Uma descoberta chave do nosso grupo estabeleceu uma nova estratégia para iluminar a inclusão usando GFP expressando células hospedeiras ^9. Esta estratégia explora a impermeabilidade racionalmente intrínseca da membrana inclusão a moléculas maiores do que 520 Da ^10. Quando as células são manipuladas para expressar estavelmente uma proteína fluorescente cytosolic particular (por exemplo, ou GFP mCherry), inclusões de clamídia são visíveis com uma nitidez notável por sua exclusão completa de fluorescência. Esta estratégia de imagem inversa permite a visualização imediata das inclusões para todos Chlespécies amydia e pode ser facilmente adaptado para a maioria das células hospedeiras de interesse. Como uma demonstração da sua utilidade, este método foi utilizado anteriormente para revelar e definir as vias celulares de saída para Chlamydia spp ^9.

Aqui, nós ainda demonstrar como esse método é realizado, e pode ser explorado para obter dados quantitativos chave sobre dinâmica de crescimento inclusão. Além disso, pode substituir de forma eficaz para a enumeração métodos baseados em anticorpos dispendiosos e pode ser usado em conjunto com outros marcadores fluorescentes, tais como ^mKate2-11 expressando Chlamydia. Esta poderosa combinação de ferramentas permite a exploração das propriedades físicas da membrana de clamídia inclusão dentro das células hospedeiras de estar.

Protocolo

1. Geração de linhas celulares hospedeiras fluorescente

1. Dia 1. Placa células 293T (ou outra linha de empacotamento retroviral) em placas de 6 poços a 2 x 10 ⁶ células / poço, para ser ~ 75% confluentes no dia seguinte. Se desejado, placa de poços duplicados para cada um retrovírus para ser utilizado.
2. Dia 2. células Aspirar e adicionar 2 ml de meio de crescimento fresco (DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamina). Transfectar células com 5-8 ug de cada vector retroviral (contendo GFP) e vector de embalagem (por exemplo., PVSVg) usando Lipofectamine 2000 ou reagente semelhante, e seguindo as instruções do fabricante.
3. Incubar as células com ADN de 4-6 h num banho a 37 ° C _incubadora de CO 2, e subsequentemente substituir meio com 1 ml de meio de crescimento.
4. Incubar as células durante 48 h em 37 ° C _incubadora de CO 2.
5. Dia 3. Placa células alvo (por exemplo., HeLa) em placas de 6 poços a uma densidade aproximada de ⁵ a 10 células / poço, para ser ~ 50% confluentes apróximo dia. Verifique transfecção positiva em células 293T por monitorização de fluorescência de GFP em um microscópio invertido.
6. Dia 4. Recolher as células sobrenadantes 293T usando uma pipeta e filtrar o sobrenadante através de um filtro de celulose de 0,45 um seringa de etilo contendo retrovírus.
7. Remova o meio a partir de células HeLa e adicionar 0,5 ml de meio de crescimento contendo 16 ug / ml de polibreno. Adicionar ~ 0,5 ml de retrovírus filtrado às células gota a gota, e incuba-se as células num banho a 37 ° C _incubadora de CO 2 durante 24 horas. Armazenar quaisquer retrovírus restantes (isto é, a partir do duplicar poço) a 4 ° C.
8. Dia 5. Se poços duplicados foram feitas para gerar retrovírus extra, repita o passo 1.7 para infectar em série com os restantes partículas retrovirais.
9. Dia 6. Passagem transfectadas células HeLa 1: 1 num prato contendo selecção de antibiótico 10 cm (por exemplo, 500 ug / ml de neomicina).
10. Aguarde tempo suficiente para que as células transduzidas para voltar a crescer na presença de selecção antibiotlc, após o qual as células podem ser propagadas por técnicas padrão com uma concentração mais baixa de antibiótico de selecção (por exemplo., 200 ug / ml de neomicina).
    Nota: As células podem também ser seleccionadas por clonagem de brilho ideal neste momento, se necessário.

2. Geração de-expressando GFP Chlamydia trachomatis

1. Prepare 2x tampão de _CaCl2 (20 mM de Tris pH 7,4, 100 _mM CaCl2) e tampão 4SP (0,4 M de sacarose, 16 mM de Na ₂ HPO _4).
2. Dia 1. Descongele congelados C. estoque trachomatis no gelo e diluir imediatamente 10 bactérias ul em 50 ul 2x _CaCl2 buffer. Adiciona-se 3 ug de ADN de plasmídeo (por exemplo., PASK-GFP-mKate2-L2), misturar bem e incubar durante 30 min a 25 ° C.
3. Durante esta etapa, preparar células hospedeiras por trypsinizing um frasco T-75 de células McCoy em um tubo de centrífuga. Centrifugar a suspensão de células a 50 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Resuspend sedimento de células num volume apropriado de tampão 1x CaCl ₂ para dar uma concentração final de 4 x 10 ⁷ células / ml.
4. Após a incubação de 30 minutos (a partir do passo 2.2), adicionar 100 ul de células McCoy preparadas para transformação tubo de mistura (volume total de 200 uL) e incubar 20 min a 25 ° C. Adicionar 100 ul desta mistura de células transformadas para um único poço de uma placa de 6 poços e sobreposição com 2 ml de meio de crescimento. Incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ durante 2 dias.
5. Dia 3. lise de células infectadas com C. McCoy trachomatis, substituindo meio com 1 ml _de dH2O e raspar as células com uma inclinação de 1.000 ul pipeta de ponta. Adicione 1 ml de tampão 4SP e passar a suspensão através de uma agulha de 27,5 G ~ 5 vezes para a lise celular eficiente e liberação de C. trachomatis.
6. Transferir 2 ml do lisado celular contendo C. trachomatis para um frasco T-75 contendo uma monocamada confluente de recém-banhado McCcélulas oy; adicionar 8 mL de DMEM (sem FBS) e incubar durante 2 horas a 25 ° C para permitir C. trachomatis para aderir às células.
7. Aspirar as células e adicionar meio de crescimento fresco, suplementado com 10 U / ml de penicilina G e 1 ug / ml de ciclo-heximida. Incubar o balão durante 48 h numa incubadora a 37 ° C, CO _2.
8. Dia 4. Verifique por microscopia de luz que as células são infectadas e inclusões contêm Chlamydia aberrante. Identificar inclusões como vacúolos brilhantes em um microscópio de luz padrão e organismos Chlamydia aberrantes como objetos em forma de anel dentro inclusões que são maiores que 2 mm de diâmetro.
9. Dia 5. Lise de cultura por meio de substituição com 2 ml _de dH2O e raspar as células numa suspensão. Adicionar 2 ml de tampão 4SP e passar a suspensão através de uma agulha de 27,5 G ~ 5 vezes.
10. Utilizar 2 ml de lisado celular para infectar uma monocamada fresca de células McCoy em um único poço de uma placa de 6 poços. Incubar as células com lisado durante 2 horas a 25 ° C, aspirado e adicionar crescimento frescomeio contendo penicilina G e ciclo-heximida.
11. Incubar as células em uma incubadora a 37 ° C _de CO2 durante 3-5 dias, dependendo do estado de saúde geral das células.
12. Repita os passos 2.9-2.10 uma ou mais vezes, conforme necessário, culturas Passaging em poços frescas em uma placa de 6 poços até inclusões normais que procuram (desprovidos de corpos aberrantes) têm surgido. Neste momento usar um microscópio de fluorescência invertido para verificar se C. trachomatis expressar mKate2 (vermelho).
13. Intensificar as culturas infectadas para geração de stocks por clamídia título elevado, por exemplo colhendo transformantes Chlamydia partir de células de McCoy ou HeLa infectadas cultivadas em frascos T-150.

3. infectar as células com Chlamydia

1. Placa células GFP-HeLa no recipiente de cultura desejada, por exemplo pratos com fundo de vidro ou lâminas de câmara para a imagem latente de alta resolução, ou placas de 24 poços para determinação IFU e triagem com vários poços.
2. Descongele frozen tubo contendo C. trachomatis, C. muridarum, ou C. pneumoniae em gelo e diluído em HBSS a desejada multiplicidade de infecção (MOI), por exemplo MOI = 1.
3. Realizar infecções estáticos ou auxiliado por centrifugação, com base na estirpe de Chlamydia em particular que irá ser utilizado.
   1. Para as infecções com C. trachomatis serovar L2 LGV ou C. muridarum, lavar as células GFP-HeLa com HBSS e incubar com bactérias diluídas durante 2 horas a 25 ° C. Aspirar e lavar as células com HBSS, e incuba-se as células em meio de crescimento com 37 ° C _incubadora de CO 2.
   2. Para as infecções com C. trachomatis serovar D ou C. pneumoniae, lavar as células GFP-HeLa com HBSS e adicionar bactérias diluídas para as células. Coloque placa com múltiplas cavidades ou prato fundo de vidro (fixo por fita em uma placa da tampa com vários poços) em um suporte de placa com múltiplas cavidades de um anexo de rotor de caçamba móvel em uma centrífuga de bancada.
   3. Células centrifugar a 900 xg a 25 ° C durante 1 h.
   4. Remover os recipientes de cultura a partir de centrifugação e colocar numa incubadora a 37 ° C _de CO2 durante 1 hora.
   5. Aspirar células em uma cabine de segurança biológica, lave as células duas vezes com HBSS, e adicionar meio de crescimento fresco. Células lugar em um C _incubadora de CO 2 37 °.

4. Ao vivo Visualization celular de clamídia Inclusões

1. Remover Chlamydia infectadas células GFP-HeLa de _incubadora de CO 2 e substituir meio com RPMI sem vermelho de fenol + 5% FBS.
2. Células montar em um microscópio de fluorescência invertido (Nikon Eclipse Ti-E ou similar) usando uma objectiva 20X ou superior petróleo.
3. Usando o software de imagem (Volocity 6 ou similar), o foco em identificar e Chlamydia infectados células GFP-HeLa: verde células que contêm grandes buracos negros (inclusões de clamídia).
4. Marque os locais xyz de regiões que contêm células infectados por clamídia de interesse usando software de imagem (Volocity 6 ou semelhante). Realizar isso manualmente "Adicionando Points 'enquanto no modo de exibição XY Stage. Deste modo, as coordenadas XYZ são guardadas para cada local marcado.
5. Na caixa de diálogo Configuração de Aquisição, configurar o software para adquirir verde (GFP, HeLa citosol) e vermelho (mKate2, C. trachomatis) canais, e em uma taxa de novos quadros por canal a cada 5 min.
6. Adquirir a sequência de imagens utilizando a aquisição protocolo estabelecido acima, clicando no botão "Capture / Record".

5. A quantificação da inclusão parâmetros de crescimento em células vivas

1. Às vezes desejadas pós-infecção (ex., 24, 48 hpi) Chlamydia remover células infectadas GFP-HeLa da incubadora e montar em um microscópio de fluorescência invertido. Nota: Um dos objectivos 20X ou 40X ar com uma NA elevada é melhor adequada para placas de 24 poços, e uma objectiva de 40X óleo é recomendado para lâminas de câmara. Cultivar células em qualquer substrato para este burroay.
2. Concentre-se em midplanes de células, onde inclusões estão em seu diâmetro máximo e produzir bordas nítidas.
3. Aquisição de imagens para muitos campos em cada poço (pelo menos 10 por poço); poços normalmente representam repetições ou variáveis ​​experimentais.
4. Enumerar o número de inclusões manualmente, por olho (inclusões são compartimentos negros em células HeLa-GFP) ou usar algoritmos de software de imagem para identificar e contar automaticamente inclusões.
   1. Encontre células GFP-HeLa por intensidade de fluorescência ('encontrar' Objetos de comando) e ajustar a intensidade limiar de fluorescência baseada em intensidades relativas de células.
   2. Filtro de objetos selecionados usando diretrizes de tamanho de manter somente aqueles superior a 5 m ^2. Esta é a população 1 '.
   3. Aplicar 'tapar buracos em objetos' de comando usando "população 1 'como a entrada. Esta etapa gera 'população 2'.
   4. Subtrair 'população 1' de 'pOPULAÇÃO 2 'para produzir marcado positivamente inclusões de clamídia, designadas por "população 3'.
   5. Aplicar filtro de tamanho de 'população 3' ('Filtro População' comando), por exemplo, tratar de objectos maiores do que 25 um para ² inclusões nas células infectadas durante 24 horas ou mais. Para tempos de início da infecção, tais como antes de 18 horas, conjunto de filtros de tamanho para manter objectos maiores do que 4 mm ^2, uma vez que estas inclusões são muito menores. Tamanho de filtragem resulta numa população de objectos designados como inclusões ''.
   6. Calcular dados quantitativas de imagens, por exemplo, o número de inclusão, inclusão tamanho e circunferência inclusão, usando software de imagem.

Resultados

As células de mamífero que expressam as proteínas citosólicas fluorescentes (por exemplo, GFP) pode ser modificado para permitir a iluminação de inclusões de clamídia em células infectadas, culturas vivas. Após a infecção com clamídia, as inclusões são facilmente visíveis como pontos negros nas células hospedeiras (Figura 1). A clareza das inclusões-falta de fluorescência pode ser explorada para a identificação automática de inclusões em numerosos campos...

Discussão

Aqui nós descrevemos a estratégia experimental para a geração de células hospedeiras fluorescentes para visualização em tempo real e análise de inclusões de clamídia. Esta abordagem visualização vacúolo confere a poderosa capacidade de iluminar, controlar e medir quantitativamente as propriedades dinâmicas de inclusões por clamídia entre as populações de células ou em células isoladas ao longo do tempo. Inclusões de clamídia em células proteína marcada fluorescentes são notavel...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534