اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

Summary

وصفنا استخدام مراسل الفلورسنت فيروس اللقاحية التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من العدوى الفيروسية والتعبير الجيني من خلال التعبير مرحلة محددة من fluorophores مراسل متميزة طيفيا. نحن بالتفصيل طريقة القائمة على لوحة لتحديد بدقة المرحلة التي يتأثر تكاثر الفيروس ردا على تثبيط جزيء صغير.

Abstract

فيروسات الجدري هي عائلة من الفيروسات الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل التي تشمل مسببات الأمراض البشرية النشطة مثل جدري القرود، المليساء contagiousum، وفيروس Contagalo. ويشمل الأسرة أيضا فيروس الجدري، الجدري. نظرا لتعقيد تكرار الفيروسة الجدرية، العديد من الأسئلة لا تزال قائمة بشأن استراتيجيتهم التعبير الجيني. في هذه المادة ونحن تصف وضع تصور واستخدام الفيروسات اللقاحية المؤتلف التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من مراحل واحدة ومتعددة في التعبير الجيني الفيروسي في شكل عالية الإنتاجية. يتم تمكين هذا من خلال استخدام البروتينات الفلورية متميزة طيفيا كما صحفيين لكل من ثلاث مراحل من تكاثر الفيروس. توفر هذه الفيروسات على نسبة عالية إشارة إلى الضوضاء مع الحفاظ على أنماط محددة المرحلة التعبير، وتمكين المقايسات القائمة على لوحة والملاحظات المجهرية من انتشار الفيروسات والنسخ المتماثل. هذه الأدوات لها استخدامات لاكتشاف فيروسات، ودراسات للتفاعل الفيروس المضيف، والبيولوجية التطوريةبليد الحركة.

Introduction

تقليديا، يتم درس التعبير الفيروس باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية (مثل النشاف الشمالية، النشاف الغربية، ميكروأري التهجين، الخ) ^1. في حين أن هذه الأساليب هي قادرة على توفير معلومات مفصلة فيما يتعلق بتصنيف التغييرات التعبير عن mRNAs والفردية أو البروتينات، فإنها عادة ما تكون غير قابلة للعمليات في الوقت الحقيقي والإنتاجية العالية. وقد تم تطبيق النهج البديلة باستخدام صحفيين القائم على مضان سابقا عند العمل مع فيروسات الجدري؛ ومع ذلك، فقد كان الدافع تنميتها واستخدامها من قبل أهداف متنوعة. تم تصميم العديد من هذه الأساليب للاختيار من الفيروسات المؤتلف ^2،3. هذه التقنيات التعبير عن EGFP عند التأسيس السليم والتعبير من الحمض النووي من الحيوانات المستنسخة الخارجية اللقاحية المؤتلف. وبالمثل، عدة سلالات اللقاحية معربا عن ثابت للذوبان EGFP أو البروتينات GFP الموسومة أعرب تحت اللقاحية المروج الأصلي قد استخدمت على نطاق واسع. هذه هي الطباعically تستخدم لتحديد دخول الفيروس وتكرارها خلال فحوصات تحييد الأجسام المضادة على أساس، وتثبيط المواد الكيميائية، أو المقارنة بين فعالية المضادة للفيروسات ^4-6. في حين أثبتت هذه الفيروسات مفيدة، فهي محدودة في قدرتها على تقديم معلومات مفصلة عن وجهة تثبيط بسبب استخدامها لغامضة في وقت مبكر / متأخر المروج الفيروسية واحد. جعلت الطرق السابقة أيضا استخدام البروتين EGFP مع الإشارة إلى الضوضاء الخصائص الأمثل.

نظرا لتعقيد تكرار الفيروسة الجدرية وعدم وجود الأدوات المتوافرة لفحص التغييرات في الوقت الحقيقي في التعبير الجيني الفيروسي، وقد وضعنا مجموعة من الفيروسات واحد ومتعدد مراسل المرحلة ^7،8. كما هو موضح في المنشورات السابقة، هذه الفيروسات تعبير عن واحد أو اثنين أو ثلاثة البروتينات الفلورية متميزة طيفيا من المروجين اللقاحية الأم خلال وقت مبكر، ومراحل وسيطة، أو في وقت متأخر من العدوى. هذه الفيروسات يمكن أن يكون لناإد كمؤشرات للفيروس التقدم النسخ المتماثل باستخدام المجهر مضان وأنهم على قدم المساواة مناسبة تماما لوحة وقارئ مقرها المقايسات الإنتاجية العالية. هذه الفيروسات هي سهلة الاستخدام في مكان النوع البري الفيروس، وتزايد مع حركية مماثلة لتصل إلى ما يعادل ⁷ التتر. خلال تخطيط وإنشاء هذه الفيروسات، واتخذت الكثير من الرعاية في اختيار fluorophores التي لها خصائص عالية إشارة إلى خلفية قابلة للطي مع كفاءة متفوقة على تسهيل الكمي موثوق بها مع ردود الفعل السريعة للتغيرات في التعبير (فينوس، mCherry وTagBFP). بالإضافة إلى ذلك، تم اختيار مجموعات من المروجين الفيروسية التي تنتج الدقة العالية، لا لبس فيها التعبير مرحلة محددة، وتوفير المعلومات حول مجموعة كاملة من وقت مبكر (C11R المروج) والمتوسطة (G8R المروج) وأواخر (F17R المروج) التعبير الجيني، على النقيض من غامض المروجين المبكر / في وقت متأخر.

ويمكن لهذه الفيروسات أن تستخدم كأداة لإنفيتقصى دورة حياة تنميط الفيروسة الجدرية، فيروس اللقاحية. الكثير لا يزال غير معروف عن التفاعل المضيفة للفيروس على الرغم من تاريخها الطويل من الدراسة. اللقاحية معقدة، وتنتج أكثر من 200 بروتينات فريدة من نوعها، وكثير منها المناعية واستضافة عدائية. على العدوى، يبدأ الفيروس في وقت مبكر اللقاحية فورا مرنا النسخ. ومما يسهل هذا من قبل البلمرة الحمض النووي الريبي والنسخ العوامل التي تم تحميلها على الجينوم الفيروسي خلال التعبئة والتغليف الفيريون والذي عقد في دولة مؤقتا حتى عدوى لاحقة. هذا التعبير في وقت مبكر تنتج أساسا من البروتينات اللازمة لقمع نظام المناعة المضيف (مرنا decapping، عزل الرنا المزدوج الجديلة، والبروتينات مستقبلات شرك وكذلك مثبطات موت الخلايا المبرمج، استجابة الإجهاد، وتول، IL، وNF كيلوبايت إشارات) وتكرار الجينوم. التعبير المبكر تنتج أيضا عوامل النسخ اللازمة للتعبير وسيطة. ويشمل تعبير وسيطة للتعبير عن العوامل أواخر مرحلة النسخ. هذاالتعبير تتالي يؤدي إلى إنتاج بروتينات الفيروس الهيكلية والأنزيمية خلال المراحل المتأخرة من العدوى، والتي هي ضرورية لتجميع كامل للاللقاحية الفيريون ناضجة.

لدينا مجموعة من الفيروسات مراسل الفلورسنت يسمح للتقدم السريع الذي سيدلي في فهم علم الأحياء الفيروسة الجدرية. إحدى الطرق الأكثر شيوعا وتستغرق وقتا طويلا في مجال علم الفيروسات هو فحص النمو. هذا عادة ما ينطوي على اصابة الخلايا، بسن سلسلة من العلاجات، وفيروس الحصاد من قبل lysing الخلايا المصابة، وقياس عيار الفيروسية الناتجة عن طريق فحص اللوحة. باستخدام الفيروسات مراسل الموصوفة هنا يسمح قياس الوقت الحقيقي للنمو الفيروس الذي يمكن أن يعاير بسهولة ومقارنة بين العديد من العلاجات يقوم بالتوازي. نتوقع هذه المجموعة من الكواشف سيتم استخدامها في بروتوكولات مختلفة لتحديد التغيرات في التعبير الجيني الفيروسي في الاستجابة للعلاج بالعقاقير، رني كnockdown، أو تقييد نطاق المضيف.

هذه الطريقة تمكن أيضا تحليل عالية المحتوى على نطاق أوسع مما كان متاحا في السابق، مما يسمح للشاشات العقاقير المضادة للفيروسات الإنتاجية العالية لمراحل محددة تحديدا الهدف من الفائدة. في حين تم التعرف على العديد من العلاجات المحتملة لمكافحة عدوى الفيروسة الجدرية، وافقت ادارة الاغذية والعقاقير فقط علاجات فعالة لعلاج عدوى الفيروسة الجدرية هي نوكليوزيد اللاحلقية فسفونات، السيدوفير، والعلاج المناعي مع اللقاحية الجلوبيولين ^9،10. على الرغم من القضاء على الجدري في عام 1977 ^11، تظل فيروسات الجدري خطرا كبيرا على صحة الإنسان ^12. وقد أدى وقف انتشار التطعيم ضد فيروس الجدري إلى زيادة التعرض لفيروسات الجدري الأخرى ^13. على سبيل المثال، مناطق وسط أفريقيا محمية من قبل التطعيم تشهد طفرة في فيروس جدري القردة الإصابات ^14. وكان مصدر قلق كبير أيضاالمثارة بشأن قابلية كامنة لإطلاق المتعمد للفيروس الجدري. ويرجع ذلك إلى العلاجات المتاحة حاليا محدودة، وهناك حاجة ملحة لتطوير علاجات جديدة. هذه الفيروسات مراسل تسمح فحص جزيء صغير المانع السريع والإنتاجية العالية لتثبيط مرحلة معينة من تكاثر الفيروس. سوف تحديد مثبطات التي تستهدف المراحل التعبير الفيروسية حاليا لا هدف تثبيط تسهيل تطوير علاجات تركيبة مع زيادة رجولية.

الكثير يمكن استخلاصها حول اللقاحية بيولوجيا الخلية من خلال مراقبة التغيرات في التعبير الجيني في كل مرحلة. وعادة ما يتم التعبير عن التوهين بواسطة مادة كيميائية أو التلاعب الجيني للخلية المضيفة المصابة من حيث انخفاض التتر الفيروسية. ومع ذلك، من خلال مقارنة التغيرات في كل مرحلة من مراحل سلسلة التعبير الفيروسية، يمكن للمرء الحصول على فهم أكثر اكتمالا لكيفية تأثير الفيروس هو اللياقة البدنيةإد عن طريق علاج خاص. وقد تبين أن هذه البيانات أنها تتطابق جيدا مع الإخراج عيار الفيروس التقليدية، ولكن تقديم معلومات أكثر تفصيلا الآلية فضلا عن قدرات إنتاجية عالية ^7.

Protocol

1. خلايا بلايت

1. فصل خلايا هيلا من لوحة وتمييع في وسائط النمو (DMEM، 2 مم L-تخمة، و 10٪ FBS) إلى ما يقرب من 2.0 × 10 ⁵ خلية / مل. الاستغناء 100 ميكرولتر / جيد في وواضحة لوحة 96 جيدا مسطحة القاع الأسود الجدران (20،000 خلية / جيد).
2. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة حتى متكدسة في حاضنة 37 درجة مئوية + 5٪ CO _2.

2. تصيب الخلايا

1. تمييع الفيروسات وتصيب الخلايا.
   1. ذوبان الجليد TrpV (الفيروس الثلاثي؛ فينوس المبكر والمتوسط ​​mCherry، في وقت متأخر TagBFP) وPLV (المروج أقل فينوس) فيروس الفلورسنت وتفصيل باستخدام صوتنة لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، مخزونات فيروس الخام يمكن أن تكون مختلطة مع 01:01 0.25 ملغ / مل التربسين في وسائل الإعلام العدوى والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. تمييع مخزونات فيروس الخام في 37 ° C وسائل الإعلام العدوى (DMEM، 2 مم L-تخمة، 2٪ FBS). لالتهابات وزارة الداخلية عالية (10 PFU / خلية)، وتمييع الأسهم الفيروس إلى 1.0 × 10 ⁷ PFU / مل على افتراض 5 × 10 ⁴خلايا / جيد وحجم اللقاح من 50 ميكرولتر. الخطة على اصابة 3 آبار تكرار لكل معاملة مع TrpV و 3 آبار أخرى لتكرار نفس المعاملة مع PLV لحساب مضان الخلفية محددة لكل معاملة.
   3. تصيب الآبار وذلك بإضافة 50 ميكرولتر / المخفف جيدا الفيروس في وسائل الإعلام العدوى. ويعرف هذا باسم عدوى الوقت = 0 ساعة آخر (0 HPI).
2. تمييع المركبات العلاج المطلوب في وسائل الإعلام العدوى. لجميع العلاجات وينبغي بذل واحد 2X سيد مزيج التخفيف وتطبيقها لتكرار الآبار (مثلا 350 ميكرولتر اجمالى حجم 96 لمدة ستة آبار مع 50 ميكرولتر لكل منهما).
   1. تمييع المركبات التجريبية في وسائل الإعلام العدوى.
   2. تمييع للسيطرة على السيارة المذيبات (مثل برنامج تلفزيوني، DMSO) في وسائل الإعلام العدوى. ملاحظة: تركيزات النهائي مماثلة المذيبات السيطرة على السيارة وينبغي أن تستخدم على النحو المطبق للمركبات التجريبية (على سبيل المثال إذا تم IBT الأسهم الخاصة بك مع DMSO وتستخدم في concentratio النهائينانوثانية من 1 ميكرولتر / مل، ثم استخدم وحده في DMSO 1 ميكرولتر / مل كما السيطرة على السيارة).
   3. تمييع مركبات التحكم في وسائل الإعلام العدوى. وتشمل المركبات المكافحة الموصى بها: 3.6 ميكرومتر (1 ميكروغرام / مل) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (أراك)، و 50 ميكرومتر (11.7 ميكروغرام / مل) إيزاتين β-thiosemicarbazone (IBT)، 60 ميكرومتر (50 ميكروغرام / مل) ريفامبيسين، أو 5 ميكرومتر (1.9 ميكروغرام / مل) ST-246 ^8،15،16. رؤية النتائج الممثل للآثار المتوقعة. ملاحظة: جعل هذا التخفيف في مرتين (2X) على التركيز النهائي المطلوب لأن هذا يضاف إلى نسبة 1:1 لحجم بالفعل في البئر.
3. مباشرة بعد إضافة الفيروس، إضافة 50 ميكرولتر التي تحتوي على وسائل الاعلام العدوى العلاجات المطلوبة والضوابط المخففة كما في الخطوة 2.2. ملاحظة: لمقايسة لتثبيط قبل مرحلة مبكرة التعبير، مجمع (ق) يمكن أن تكون إما إضافتها مباشرة إلى اللقاح الفيروس المخفف (الخطوة 2.1.2) أو لاستضافة الخلايا قبل عدوى (قبل الخطوة 2.1.3).
4. احتضان 6-24 ساعة في 37 & #176؛ C + حاضنة 5٪ CO _2.

3. إصلاح خلايا

1. إصلاح الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر 8٪ بارافورمالدهيد إلى وسائل الإعلام العدوى بالفعل في كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. ملاحظة: من المستحسن لإضافة 2X PFA (8٪) مباشرة إلى وسائل الإعلام لمنع العدوى هباء من اللقاحية المعدية التي يمكن أن تحدث إذا تم مقلوب وسائل الإعلام عالية عيار مباشرة في طبق النفايات قبل التثبيت.
2. إزالة تثبيتي التي كتبها قلب لوحة في طبق النفايات.
3. إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني درجة حرارة الغرفة.
4. ختم لوحة مع فيلم لاصق واضحة بصريا. ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في 4 درجات مئوية إذا لم يقرأ على الفور. ومن المؤكد أن عودة وحات مختوم إلى درجة حرارة الغرفة قبل قراءة لمنع التكثيف من تشويه قياسات معمل.

4. القياس الكمي الفيروسات النمو

1. قياس مضان نقطة النهاية في 515:530 لفينوس، 587:610 لmCherry، و415:457 وأو TagBFP (الإثارة: الانبعاثات الطول الموجي في نانومتر). ينبغي أن متوسط ​​أربعة قياسات لكل بئر باستخدام إعدادات مكاسب الأمثل لكل قناة. ملاحظة: قد يكون الطول الموجي الانبعاثات الملائمة مختلفة اعتمادا على نموذج وتصفية الخصائص المحددة للقارئ لوحة الخاص بك. وهذا يمكن أن تحدد تجريبيا عن طريق إجراء فحص الانبعاثات الطول الموجي لتحديد نقطة حيث هناك أعظم الفرق بين TrpV وPLV لكل قناة.
2. تطبيع البيانات الخام لتسهيل المقارنة بين التجارب.
   1. لكل قناة، وتحديد متوسط ​​TrpV تكرار والآبار PLV.
   2. طرح متوسط ​​قياسات الخلفية PLV المصابة من القياسات التجريبية متوسط ​​TrpV المصابة عن كل معاملة.
   3. تطبيع البيانات عن طريق قسمة قيمة كل خلفية طرح من قبل قيمة السيارة فقط أيضا.
   4. مرة واحدة وقد تكرر تجربة عدة مرات، وتحليل التباين في اتجاه واحد (في اتجاه واحد أنوفا) واختبار متعددة جomparison يمكن إجراء اختبار آخر لتحديد ما إذا كان أي من العلاجات يعكس فروق ذات دلالة إحصائية من العلاج للمركبات فقط لكل قناة.

5 بروتوكول بديل: فحوصات لوحة الحركية

1. تنفيذ جميع الخطوات من خلال إضافة العلاجات (الخطوة 2.3).
2. ختم لوحة مع فيلم لاصقة وضعها في غرفة قارئ لوحة معايرتها إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: يجب أن يتم إيلاء عناية خاصة للحفاظ على لوحات باستمرار عند 37 درجة مئوية لمنع الإجهاد الخلية لا مبرر له والتكثيف. لفحوصات الحركية، من المهم بشكل خاص لاستخدام وسيلة مخزنة (بيكربونات الصوديوم وHEPES) للحفاظ على درجة الحموضة المناسبة دون إضافة 5٪ CO _2.
3. مجموعة كسب قارئ لوحة يدويا لمنع تشبع نقاط وقت لاحق. ملاحظة: يمكن الحصول على دقة مكاسب الأمثل عن طريق إجراء فحوصات نقطة النهاية في ظل ظروف مماثلة.
4. الحصول على قراءات للساعة 8-24 HPI وتطبيع باستخدام سيميلار الإجراء كما هو الحال في نقطة النهاية مقايسة (الخطوة 4.2).
5. نقاط زمنية الفردية يمكن تحليلها إحصائيا باستخدام أساليب مماثلة لفحص نقطة النهاية هو موضح سابقا.

النتائج

كمثال على استخدام نموذجي من هذه الفيروسات، وكان يستخدم الفيروس الثلاثي مضان مراسل لمقارنة وجهة تثبيط العديد من الفيروسة الجدرية مثبطات محددة جيدا.

كانت مطلية خلايا هيلا في زراعة الأنسجة المعالجة واضحة لوحات 96 جيدا مسطحة القاع ا...

Discussion

هنا، لقد وصف الاستخدام العملي لمرحلة متعددة مراسل اللقاحية الفيروس (TrpV)، والذي يوفر، في الوقت الحقيقي التدابير ردود فعل استنساخه من تكاثر الفيروس. باستخدام الفيروسة الجدرية مثبطات محددة جيدا، وكنا قادرين على إظهار أن TrpV يستجيب بطريقة متسقة مع آلية عمل ليفهم كل مثبط....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070