Vaccinia Reporter virus per quantificare Funzione virale in tutte le fasi di espressione genica

Riepilogo

Descriviamo l'utilizzo di un virus vaccinia reporter fluorescente che consente la misurazione in tempo reale di infettività virale e l'espressione genica attraverso l'espressione specifica fase di fluorofori giornalista spettralmente distinti. Abbiamo dettaglio un metodo basato piastra per identificare con precisione la fase in cui la replicazione del virus è influenzato in risposta ad inibizione piccola molecola.

Abstract

Poxviruses sono una famiglia di virus a DNA doppio stranded che comprendono gli agenti patogeni attivi umani, come il vaiolo delle scimmie, mollusco contagiousum e virus Contagalo. La famiglia comprende anche il virus del vaiolo, Variola. A causa della complessità della replicazione poxvirus, molte domande rimangono ancora quanto alla strategia espressione genica. In questo articolo descriviamo la concettualizzazione e l'utilizzo di virus vaccinia ricombinanti che consentono la misurazione in tempo reale di fasi singole e multiple di espressione genica virale in un formato ad alta velocità. Ciò è reso possibile attraverso l'uso di proteine ​​fluorescenti spettralmente distinti come reporter per ciascuna delle tre fasi di replicazione virale. Questi virus forniscono un elevato rapporto segnale-rumore, pur mantenendo i modelli fase specifica espressione, consentendo analisi basate piastra-e osservazioni microscopiche di propagazione dei virus e replicazione. Questi strumenti hanno usi per la scoperta antivirale, studi di interazione virus-ospite, e bio evolutivalogia.

Introduzione

Tradizionalmente, l'espressione virus viene studiata utilizzando tecniche di biologia molecolare (ad esempio blotting settentrionale, occidentale blotting, ibridazione microarray, ecc) ^1. Mentre questi metodi sono in grado di fornire informazioni dettagliate riguardo al categorizzare cambiamenti di espressione di singoli mRNA o proteine, non sono in genere riconducibili a processi real-time e high-throughput. Approcci alternativi che utilizzano i giornalisti a base di fluorescenza sono state applicate in precedenza quando si lavora con poxviruses; tuttavia, il loro sviluppo e il loro utilizzo è stato motivato da finalità diverse. Diversi di questi metodi sono stati progettati per la selezione di virus ricombinanti ^2,3. Queste tecniche esprimono EGFP sulla corretta costituzione e l'espressione del DNA esogeno da cloni vaiolo vaccino ricombinanti. Analogamente, diversi ceppi vaccinia esprimono stabilmente EGFP solubile o proteine ​​GFP-tag espresse sotto un promotore nativo vaccinia sono stati ampiamente utilizzati. Questi sono tipcamente utilizzato per quantificare ingresso virus e replica durante test di neutralizzazione a base di anticorpi, inibizione chimica, o il confronto di efficacia antivirale ^4-6. Mentre questi virus si sono dimostrati utili, essi sono limitati nella loro capacità di fornire informazioni dettagliate sul punto di inibizione a causa del loro utilizzo di un unico promotore ambiguo anticipo / ritardo virale. Metodi precedenti hanno anche fatto uso di proteina EGFP con caratteristiche ottimali segnale-rumore.

A causa della complessità della replicazione poxvirus e la mancanza di strumenti disponibili per saggiare tempo reale i cambiamenti nell'espressione genica virale, abbiamo sviluppato una serie di virus singolo e multi giornalista fase ^7,8. Come descritto in precedenti pubblicazioni, questi virus esprimono uno, due, o tre proteine ​​fluorescenti spettralmente distinti da promotori vaiolo vaccino indigene durante le prime fasi, tappe intermedie, o tardive dell'infezione. Questi virus possono essere noied indicatori di progresso replicazione del virus utilizzando un microscopio a fluorescenza e sono ugualmente adatti per high-throughput piastra-e-reader basato saggi. Questi virus sono facili da usare al posto di tipo selvatico del virus, in crescita con cinetiche simili per raggiungere i titoli equivalenti ^7. Durante la progettazione e la realizzazione di questi virus, molta cura è stata posta nella scelta fluorofori che presentano elevate caratteristiche segnale-fondo con efficienza superiore pieghevole per facilitare la quantificazione affidabile con un feedback rapido ai cambiamenti di espressione (Venere, mCherry e TagBFP). Inoltre, le combinazioni di promotori virali sono stati scelti che producono alta fedeltà, espressione inequivocabile stadio-specifica, che fornisce informazioni sulla gamma completa di precoce (promotore C11R), intermedio (promotore G8R) e (promotore F17R) espressione genica tardi, in contrasto ambiguo promotori anticipo / ritardo.

Questi virus possono essere usati come strumento per investigating il ciclo di vita del poxvirus prototipo, virus del vaiolo vaccino. Molto non è ancora noto circa l'interazione ospite-virus nonostante la sua lunga storia di studio. Vaccinia è complesso, producendo oltre 200 proteine ​​uniche, molte delle quali sono immunomodulante ospitano antagonista. Dopo l'infezione, il virus del vaiolo vaccino comincia subito all'inizio del mRNA di trascrizione. Ciò è facilitato da una RNA polimerasi e fattori di trascrizione che sono stati caricati sul genoma virale durante il confezionamento virione e tenuti in uno stato di pausa fino a successiva infezione. Questo primo espressione produce principalmente proteine ​​necessarie per la soppressione del sistema immunitario dell'ospite (mRNA decapping, dsRNA sequestro, e proteine ​​recettori decoy così come inibitori di apoptosi, risposta allo stress, e Toll, IL, e segnalazione NF-kB) e la replicazione del genoma. Espressione precoce produce anche fattori di trascrizione necessari per l'espressione intermedio. Espressione intermedio comprende l'espressione di fattori di trascrizione fase tardiva. Questoespressione cascata porta alla produzione di proteine ​​virali strutturali ed enzimatiche durante ultimi stadi di infezione, che sono necessarie per completare l'assemblaggio del virione maturo vaccinia.

La nostra serie di virus reporter fluorescente consente la rapida compiere progressi nella comprensione della biologia poxvirus. Uno dei metodi più comuni e che richiede tempo nel campo della virologia è il saggio di crescita. Ciò comporta tipicamente infettare le cellule, che introduce una serie di trattamenti, virus raccolta mediante lisi cellule infettate, e quantificare il titolo virale risultante da saggio di placca. Usando i virus giornalista qui descritti consente la misurazione in tempo reale della crescita virale che può essere facilmente dosato e confrontata tra numerosi trattamenti eseguiti in parallelo. Prevediamo questa serie di reagenti sarà utilizzato in vari protocolli per identificare alterazioni dell'espressione genica virale in risposta al trattamento farmacologico, RNAi knockdown, o la restrizione campo ospite.

Questo metodo consente anche l'analisi ad alto contenuto su scala più ampia rispetto al passato, consentendo di high-throughput schermi di farmaci anti-virali per le fasi di destinazione specificamente definite di interesse. Mentre sono stati identificati numerosi potenziali trattamenti per combattere l'infezione da poxvirus, l'unico approvato dalla FDA terapie efficaci per il trattamento delle infezioni da poxvirus sono il nucleoside aciclico fosfonato, cidofovir, ed il trattamento con vaccino immunitario globulina ^9,10. Nonostante l'eradicazione del vaiolo nel 1977 ^11, poxviruses rimangono una grave minaccia per la salute umana ^12. Cessazione della vaccinazione diffusa contro il virus del vaiolo ha portato ad un aumento della suscettibilità alle altre poxviruses ^13. Ad esempio, regioni dell'Africa centrale precedentemente protetti dalla vaccinazione stanno vivendo un aumento di infezioni da virus vaiolo delle scimmie ^14. Preoccupazione significativa è stata anchesollevato in merito alla predisposizione latente di rilascio intenzionale di virus Variola. A causa delle limitate terapie attualmente disponibili, vi è una necessità urgente per lo sviluppo di nuovi trattamenti. Questi virus giornalista consentono una rapida e high-throughput di screening piccolo inibitore della molecola per l'inibizione di una determinata fase di replicazione virale. Identificazione di inibitori che mirano fasi di espressione virali attualmente l'obiettivo di inibizione faciliterà lo sviluppo di terapie combinate con una maggiore potenza.

Molto può essere spigolato su vaccino biologia cellulare osservando i cambiamenti nell'espressione genica di ogni fase. Attenuazione da chimica o manipolazione genetica di una cellula ospite infettata è solitamente espressa in termini di titoli virali ridotte. Tuttavia, comparando le variazioni di ogni fase della cascata di espressione virale, si può ottenere una comprensione più completa di come idoneità virus è impattoEd da un particolare trattamento. Questi dati hanno dimostrato di correlare bene con la tradizionale uscita titolo virale, ma fornire informazioni più dettagliate meccanicistica nonché capacità high throughput ^7.

Protocollo

1. Cellule piastra

1. Dissociare cellule HeLa dalla piastra e diluire in terreni di crescita (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) a circa 2,0 x 10 ⁵ cellule / ml. Dispensare 100 microlitri / pozzetto in una, chiara piastra a 96 pozzetti a fondo piatto nero parete (20.000 cellule / pozzetto).
2. Incubare le cellule per 24 ore fino confluenti in un incubatore a 37 ° C + 5% di CO _2.

2. Infettare le cellule

1. Diluire virus e infettare le cellule.
   1. Virus fluorescenti e PLV (Promoter-less Venere) e disaggregare con sonicazione per 5 minuti; Thaw TrpV (Early Venere, Intermedio mCherry, Dopo TagBFP virus Triple). In alternativa, le riserve di virus grezzo può essere miscelato 1:1 con 0,25 mg / ml di tripsina in mezzi di infezione e incubate a 37 ° C per 30 min.
   2. Diluire le riserve di virus greggio in 37 ° C mezzi di infezione (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Per le infezioni alto MOI (10 PFU / cellulari), diluire virus stock da 1,0 x 10 ⁷ PFU / ml ipotizzando 5 x 10 ⁴cellule / pozzetto e un volume di inoculo di 50 microlitri. Piano di infettare 3 pozzi repliche per ogni trattamento con TrpV e altri 3 pozzi ripetute per lo stesso trattamento con PLV per tenere conto di fluorescenza di fondo specifico per ogni trattamento.
   3. Infettare pozzi aggiungendo 50 microlitri virus / ben diluito in mezzi di infezione. Questo è definito come infezione time = 0 h palo (0 HPI).
2. Diluire composti trattamenti desiderati in supporti di infezione. Per tutti i trattamenti una singola diluizione master mix 2x dovrebbe essere fatto e applicato per replicare pozzetti (es. 350 microlitri volume totale per sei 96-pozzetti con 50 ml ciascuna).
   1. Diluire composti sperimentali in supporti di infezione.
   2. Diluire veicolo-solvente di controllo (ad esempio PBS, DMSO) in supporti infezione. Nota: concentrazioni finali giudizio di solventi veicolo di controllo dovrebbero essere usati come richiesto per i composti sperimentali (ad esempio, se il tuo magazzino IBT è fatto con DMSO e utilizzato in un concentratio finalens di 1 ml / ml, quindi utilizzare DMSO solo a 1 microlitri / ml come il controllo del veicolo).
   3. Diluire composti di controllo in supporti di infezione. Composti di controllo consigliati sono: 3.6 micron (1 mg / ml) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), 50 pm (11,7 mcg / ml) Isatin β-thiosemicarbazone (IBT), 60 mM (50 mg / ml) rifampicina, o 5 micron (1,9 mg / ml) ST-246 ^8,15,16. Vedi i Risultati Rappresentante per gli effetti attesi. Nota: rendono questa diluizione al doppio (2x) la concentrazione finale desiderata poiché ciò viene aggiunto in un rapporto 1:1 a volume già nel pozzo.
3. Subito dopo l'aggiunta di virus, aggiungere 50 ml contenenti supporti di infezione trattamenti e controlli desiderati come diluito in fase 2.2. Nota: Per saggiare l'inibizione dell'espressione prima fase iniziale, il composto (s) può essere aggiunto direttamente al inoculo virus diluito (punto 2.1.2) o cellule ospiti prima dell'infezione (prima del punto 2.1.3).
4. Incubare 6-24 ore in un # 37 &176, C incubatore + 5% di CO _2.

3. Fissare Celle

1. Fix cellule aggiungendo 100 microlitri 8% paraformaldeide al supporto infezione già in ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce. Nota: Si raccomanda di aggiungere 2x PFA (8%) direttamente ai media di infezione per evitare aerosol di vaccino infettiva che può verificarsi se supporti ad alta titolo è invertito direttamente nel piatto rifiuti in attesa di fissazione.
2. Rimuovere fissativo invertendo piatto nel piatto rifiuti.
3. Aggiungere 100 microlitri di PBS a temperatura ambiente.
4. Sigillare piastra con pellicola adesiva otticamente trasparente. Nota: Le piastre possono essere conservati a 4 ° C, se non di leggere immediatamente. Essere sicuri di tornare piatti sigillati a temperatura ambiente prima di leggere per evitare la condensa di distorsione misurazioni spettrofotometriche.

4. Quantificare crescita Virus

1. Misurare endpoint fluorescenza a 515:530 per Venus, 587:610 per mCherry, e 415:457 fo TagBFP (eccitazione: d'onda di emissione in nm). Quattro le misure devono essere mediate per bene usando impostazioni di guadagno ottimizzate per ogni canale. Nota: La lunghezza d'onda di emissione del caso può essere diversa a seconda delle caratteristiche specifiche del modello e del filtro del vostro lettore per piastra. Questo può essere determinato empiricamente effettuando una scansione della lunghezza d'onda di emissione per determinare il punto in cui vi è la più grande differenza tra TrpV e PLV per ciascun canale.
2. Normalizzare i dati grezzi per facilitare il confronto tra esperimenti.
   1. Per ogni canale, determinare la media di replicare TrpV e pozzi PLV.
   2. Sottrarre i media misurazioni del fondo PLV-infettati dalle misure sperimentali medi TrpV-infettati per ogni trattamento.
   3. Normalizzare i dati dividendo ogni valore di fondo sottratto dal valore unico veicolo-bene.
   4. Una volta che un esperimento è stato ripetuto più volte, l'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) prova e più cONFRONTO post-test può essere eseguito per determinare se uno dei trattamenti riflette una differenza statisticamente significativa dal trattamento solo veicolo per ciascun canale.

. 5 Protocollo Alternativa: saggi piastra Kinetic

1. Eseguire tutti i passaggi attraverso l'aggiunta di trattamenti (punto 2.3).
2. Piastra di tenuta con la pellicola adesiva e posto in camera di lettore di piastre equilibrato a 37 ° C. Nota: Particolare cura deve essere presa per mantenere piastre costantemente a 37 ° C per evitare lo stress delle cellule eccessivo e condensazione. Per i saggi cinetici, è particolarmente importante utilizzare un mezzo tamponato (bicarbonato di sodio e HEPES) per mantenere il corretto pH senza aggiunta di 5% di CO _2.
3. Set lettore di piastre ottenere manualmente per evitare la saturazione di punti temporali successivi. Nota: accurata ottimizzazione del guadagno può essere ottenuto eseguendo un endpoint test in condizioni simili.
4. Acquisire letture orarie per 8-24 HPI e normalizzare utilizzando simiprocedura lar come nel saggio finale (punto 4.2).
5. Punti temporali individuali possono essere analizzati per la significatività statistica utilizzando metodi simili, come il saggio endpoint descritto in precedenza.

Risultati

Come un esempio di utilizzo tipico di questi virus, il virus tripla fluorescenza-reporter è stato utilizzato per confrontare il punto di inibizione di diversi inibitori poxvirus ben definiti.

Cellule HeLa sono state piastrate in coltura tissutale trasparente trattato piastre a 96 pozzetti a fondo piatto nero a pareti e incubate tutta la notte. Monostrati confluenti sono state infettate ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 utilizzando virus giornalista tripla (TrpV; Tabella ...

Discussione

Qui, abbiamo descritto l'uso pratico di un multi-stadio di virus del vaiolo vaccino reporter (TrpV), che fornisce riproducibili, misure di feedback in tempo reale di replicazione del virus. Utilizzando inibitori poxvirus ben definite, siamo stati in grado di dimostrare che TrpV risponde in modo coerente con il meccanismo capito di azione per ciascun inibitore. Mentre il virus TrpV fornisce le informazioni più complete sulla progressione fase virus, due stadi (IREV, LREV) e monostadio (EV, IV, LV) virus possono esse...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070