والبقري الرئة في البحوث الطبية الحيوية: إذ تسترشد بصريا القصبات، داخل القصبة التلقيح و<em&gt; في فيفو</em&gt; تقنيات أخذ العينات

Summary

يصف هذا المقال تقنيات تنظير القصبات في الرئة البقري تحت ظروف تجريبية، أي تلقيح موجهة bronchoscopically، غسيل القصبات، بالفرشاة الشعب الهوائية، وخزعة الرئة transbronchial.

Abstract

هناك البحث المستمر عن النماذج الحيوانية البديلة في مجال البحوث للطب الجهاز التنفسي. اعتمادا على الهدف من البحث، والحيوانات الكبيرة كنماذج من المرض الرئوي غالبا ما يشابه الوضع في الرئة الإنسان أفضل بكثير من الفئران القيام به. العمل مع الحيوانات الكبيرة أيضا يتيح الفرصة لأخذ عينات من نفس الحيوان مرارا وتكرارا خلال دورة معينة من الزمن، والذي يسمح دراسات طويلة الأجل دون التضحية الحيوانات.

كان الهدف هو اقامة في الجسم الحي طرق أخذ العينات لاستخدامها في نموذج البقري من الجهاز التنفسي العدوى الكلاميديا ​​الببغائية. يجب أن يتم تنفيذ أخذ العينات في نقاط زمنية مختلفة في كل حيوان أثناء الدراسة، ويجب أن تكون العينات مناسبة لدراسة استجابة المضيف، وكذلك الممرض تحت ظروف تجريبية.

القصبات هو أداة تشخيصية قيمة في الطب البشري والبيطري. هو إجراء آمن ومينيملي. هذا القطب الشماليلو يصف التلقيح داخل القصبة من العجول وكذلك طرق أخذ العينات للالسبيل التنفسي السفلي. Videoendoscopic، التلقيح داخل القصبة يؤدي إلى النتائج السريرية والمرضية متسقة للغاية في جميع الحيوانات الملقحة، وبالتالي، مناسبة تماما للاستخدام في نماذج من أمراض الرئة المعدية. طرق أخذ العينات وصفها هي غسل القصبات، بالفرشاة الشعب الهوائية والرئة خزعة transbronchial. كل هذه هي أدوات التشخيص قيمة في الطب البشري ويمكن تكييفها لأغراض تجريبية لالعجول الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع. وكانت العينات التي تم الحصول عليها ومناسبة لكلا كشف الممرض وتوصيف شدة التهاب الرئة في البلد المضيف.

Introduction

القيم من النماذج الحيوانية الكبيرة في البحوث الطبية الحيوية

في البحوث الطبية الحيوية التخصصات الحديثة، والنماذج الحيوانية لا تزال لا غنى عنه لتوضيح التفاعلات المعقدة - المتعلقة بالصحة أو الحالة المرضية - داخل الكائنات الثديية. على الرغم من 17 جوائز نوبل التي منحت لدرس العلماء أن الأبقار والخيول والأغنام والدواجن أو كنماذج للبحوث الطبية البيولوجية ^1، وتجري في الوقت الحاضر فإن الغالبية العظمى من التجارب على الحيوانات مع القوارض، في حين أن أقل من 1٪ من الدراسات والعمل مع الحيوانات الأليفة أو الماشية.

الحيوانات الصغيرة تقدم العديد من المزايا العملية (أي منخفضة التكلفة، والطواعية الوراثية، إنتاجية عالية، وتوافر العديد من الجينية، وأدوات ومستلزمات المناعية)، ويتم قبول نماذج الفئران المعدلة وراثيا بصفة عامة إلى إجراء دراسات خاصة الآلية اكتشاف المسارات الجزيئية. في البحوث الطبية الحيوية من الأنظمة المعقدة، رانه أهميتها البيولوجية والسريرية فائدة من نماذج الفئران أصبحت أكثر وأكثر مشكوك فيها. يمكن أن تكون مضللة وتحمل المخاطر من التبسيط من التعقيد البيولوجي ^2-9.

نظرا لخصوصيات بين الأنواع، لن الأنواع الحيوانية واحدة تعكس تماما الوضع البشري، ويبدو أن استخدام أكثر من نموذج واحد أن يكون مفيدا في نهج متعدد التخصصات البحوث الطبية الحيوية. في سياق الطب متعدية، الحيوانات الكبيرة تتيح الفرصة لخدمة نماذج مقارنة عن توفير نتائج ذات الأهمية البيولوجية العالية ذات الاستخدام المزدوج لكل من الإنسان والصحة الحيوانية ^1. بشكل ملحوظ، ويشبه الجينوم البشري عن كثب من قبل جينوم الأبقار من قبل جينوم القوارض المختبر. كما أنه تم تأكيد مؤخرا أن، بالمقارنة مع الأنواع الأخرى، جينوم الفئران هي أكثر من ذلك بكثير ترتيبها ^10-12.

في تصميم الدراسة المعقدة، واستخدام الثروة الحيوانية يوفر عناصر القائمة الفرصة رق من والدراسات البينية الفرد على المدى الطويل من خلال جمع المتكررة من مجموعة متنوعة من العينات في الجسم الحي من والحركة ونفس واحدة individuum دون التضحية الحيوانية. لذلك، يمكن رصد التغيرات الوظيفية، التهابات والصرفية في نفس الموضوع خلال فترة معينة من الزمن ^13.

والبقري الرئة باعتبارها الجهاز التنفسي نموذج مناسب

ويرجع ذلك إلى ارتفاع عدد فروق ذات دلالة إحصائية في علم التشريح الرئة، علم وظائف الأعضاء في الجهاز التنفسي، وعلم المناعة الرئوي والفئران لا تتكاثر العديد من الجوانب المرضية في جسم المريض مهم من مرض الرئة الإنسان. يجب أن يؤخذ هذا في الاعتبار عند استخدامها كنماذج الحيوان من أمراض الجهاز التنفسي ^2،9،14-16. على الرغم من خصوصيات تشريح وبنية موجودة لكل الرئة الثدييات وخصائص وظيفية (أي كميات الرئة، والميكانيكا تدفقات الهواء في الجهاز التنفسي) هي أفضل مقارنة بين البشر الكبار والعجول بسبب الأوزان هيئة مماثلة(50-100 كجم).

وتتلخص خصائص أنواع محددة من الرئة البقري على النحو التالي: تتكون الرئة اليسرى من فصين (القحفية الفص، الذي ينقسم إلى جزأين، والفص الذنبية)، في حين تتكون الرئة اليمنى من أربعة فصوص (الفص القحفي، الفص الألوية المتوسطة، الفص الذنبية، والفص الإضافي). على عكس التشريح الرئة لمعظم الثدييات الأخرى، والقصبات الهوائية حق فروع الفص القحفي مباشرة من الجانب الوحشي بحق القصبة الهوائية. فيما يتعلق subgross التشريح، ويعرض الرئة البقري على درجة عالية من تفصص ونسبة عالية من الأنسجة الخلالية ^17،18 مما يؤدي إلى منخفض نسبيا الامتثال الرئة محددة وأعلى مقاومة الأنسجة الرئوي ^19. وبالتالي فإن المطلوب هو النشاط التنفس عالية نوعا ما مقارنة مع الأنواع الأخرى ^20،21. على درجة عالية من تفصص يؤدي إلى الاستقلال قوية للقطاعات. وبالتالي، الوقود النووي المشعهي عمليات lammatory محدودة بسبب حواجز النسيج الضام، وكثيرا ما تكمن قطاعات المريضة وصحية في نفس الفص. بسبب عدم وجود ضمانات الهوائية، هي مناسبة الرئة البقري بشكل خاص ليعكس الخلل الانسداد الرئوي ^13. فيما يتعلق الأوعية الدموية في الرئة البقري، وتظهر الشرايين الرئوية الصغيرة بارزة جدا طبقات العضلات الملساء. وبالتالي، فإن العجل قد تكون أيضا بمثابة نموذج حيواني راسخة من ارتفاع ضغط الدم الرئوي أو الأوعية الدموية إعادة عرض ^22-24.

مع الاحترام لالتهابات الجهاز التنفسي، أمراض موجودة طبيعيا في الحيوانات التي تشترك في العديد من أوجه التشابه مع المرض مقارنة في الإنسان. أمثلة نموذجية هي السل البقري ^25، والجهاز التنفسي المخلوي فيروس (RSV) التهابات في العجول ^26-28، أو التهابات الكلاميديا ​​المكتسبة طبيعيا ^29. وبالتالي، نماذج حيوانية كبيرة لا تشبه الوضع في البلد المضيف الطبيعي. وبالتالي، فهي الأكثر USEFالمجاهدين لدراسة التفاعلات المضيف الممرض والفيزيولوجيا المرضية المعقدة للمرض المقابلة في البشر ^30،31.

كنموذج ذات الصلة بيولوجيا من الجهاز التنفسي عدوى الكلاميديا ​​الببغائية، وقد تم اختيار العجول منذ الأبقار تمثل الحاضن الطبيعي لهذا الممرض ^32-35. المعلومات التي تم الحصول عليها من هذا النموذج، فيما يتعلق التسبب في المرض أو المسارات انتقال محتمل بين الحيوانات والبشر، وسوف تساعد على توسيع معرفتنا مع تأثير لكلا الماشية والإنسان. يمكن للنموذج أن يساعد أيضا على التحقق من الخيارات العلاجية البديلة والمقبولة عموما للقضاء على الرئوي C. التهابات الببغائية، الذي هو، مرة أخرى، من مصلحة في كل من الطب البيطري والبشري.

تقنيات تطبق على عينات ويمكن الحصول عليها من الجهاز التنفسي البقري

وتصف هذه الورقة ويوضح تقنيات وأساليب التشخيص applicablه إلى الرئة البقري واستخدامها في نموذجنا لتقييم كل من الآثار المترتبة على الممرض على الرئة الثدييات وفعالية التدخل العلاجي.

وقد أجريت تنظير القصبات في الطب البشري منذ 1960s، ويعتبر إجراء آمن ^36. في العجول، وقد وصفت القصبات التجريبية في عام 1968 لأول مرة ^37. واقترح تطبيق داخل القصبة من مسببات الأمراض عن طريق بوتجييتير آخرون كوسيلة من وسائل موثوق بها لتقلل من أمراض الجهاز التنفسي في العجول ³⁸ والآن طريقة على نطاق واسع في مجال البحوث البقري ^34،39،40. التلقيح داخل القصبة من كمية محددة من مسببات المرض تحت السيطرة videoendoscopic يسمح لوضع انتقائية وكيل المعدية في الرئة. وهذا يؤدي إلى النتائج السريرية والمرضية متسقة في جميع الحيوانات ³⁴ ويسمح أخذ العينات المستهدفة من مناطق الرئة التي من المتوقع أن يتغير بسبب التعرض الممرض.

القصبات السائل غسل (BALF) هو مؤشر موصوفة وصفا جيدا لوجود وشدة التهاب الرئة. وغسل القصبات (BAL) هو إجراء القياسية في الطب البشري لتشخيص مجموعة متنوعة من أمراض الجهاز التنفسي ^41. في الماشية الحية، وقدم BAL بواسطة يلكي وماركهام في أواخر السبعينات من القرن الماضي ^42. فقد اعتبر تقنية آمنة وقابلة للتكرار لدراسة الجهاز التنفسي السفلي من الماشية. ويرجع ذلك إلى عدم وجود بيانات كافية عن المعلمات BALF في الحيوانات السليمة، في عام 1988 برينغل آخرون. تنفيذ BAL على العجول صحية مع القصبات الالياف البصرية المرنة. أشار الكتاب أيضا إلى ضرورة توحيد بروتوكولات BAL تحت ظروف تجريبية للحصول على نتائج مماثلة ^43. لا يزال يستخدم BAL كأسلوب أخذ العينات في الجسم الحي في العجول ^44-46.

يستخدم بالفرشاة القصبي عادة في الطب البشري باعتبارهأداة تشخيصية لأخذ عينات الآفات الورمية أو للتحليل الميكروبيولوجي ^36. لأغراض البحث والثقافات الخلية الأولية من الخلايا الظهارية تحصد بالفرشاة الخلوي يمكن الحصول على ^47. في الماشية، وقد وصفت استخدام brushings الشعب الهوائية للتحليل الميكروبيولوجي لتوصيف البيئة الميكروبية في الرئة ^43.

يوفر خزعة الرئة Transbronchial عينات أنسجة الرئة وهو أداة تشخيصية قيمة لنزع فتيل أمراض الرئة في البشر. استرواح علاجي المنشأ ونزيف الداخلي ذات الصلة هي المضاعفات المرتبطة مع هذه التقنية. وتفيد التقارير الإصابة على أن تكون أقل من واحد في المئة في المرضى من البشر ^48. خزعة الرئة Transbronchial ليس طريقة شائعة لاستخدامها في الماشية، وذلك بسبب التكلفة العالية للمعدات المطلوبة والوقت اللازم للحصول على الخزعات. بدلا من ذلك، خزعات الرئة عبر الجلد هي أكثر ملاءمة في ظل الظروف الميدانية ^49-51.

Protocol

بيان الأخلاق
وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع القانون الأوروبي والوطني لرعاية واستخدام الحيوانات. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات للتجارب على الحيوانات وحماية الحيوانات في ولاية ساكسونيا السفلى، ألمانيا (رقم تصريح: 04-004/11). أجريت جميع التجارب تحت إشراف وكيل مؤسسي معتمد لحماية الحيوان. تم إجراء تنظير القصبات بدقة تحت التخدير العام. خلال الدراسة، تم بذل كل جهد ممكن لتقليل الانزعاج أو المعاناة.

ملاحظات عامة
وقد تم تطوير تقنيات وصفها لعجول حوالي 6-8 أسابيع من العمر، وتزن حوالي 60-80 كجم. لاستخدامها في أنواع الحيوانات الكبيرة الأخرى أو العجول مختلفة في العمر ووزن الجسم، يجب أن تتكيف التقنيات لتتناسب مع حجم ووزن وتأخذ بعين الاعتبار التشريح الرئة من الأنواع الحيوانية معينة. كليجب أن تكون المعدات المستخدمة معقمة. الكلاميديا ​​الببغائية هي نوع من البكتيريا التي يمكن أن تسبب الحيوانية أمراض الجهاز التنفسي والعامة في البشر. سي غير الطيور يجب التعامل الببغائية سلالة DC15 المستخدمة في هذا البروتوكول تحت مستوى السلامة الحيوية 2. كل عمل مع الممرض ومع الحيوانات المصابة يجب إجراء ارتداء معدات الوقاية الشخصية، مثل جهاز التنفس الصناعى، بذلة دليل على المياه البداية، والأحذية المطاطية والقفازات. ارتداء جهاز تنفس صناعي مناسبة له أهمية كبيرة، حيث أن الطريق الطبيعية للعدوى للC. الببغائية هو مولد الغاز؛ مرياح. يجب أن تكون التعبئة والتغليف ووضع العلامات على عينات إثبات مطهر منذ يجب أن يعامل كل شيء مع مطهر فعال ضد متدثرات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة قبل مغادرة وحدة سكنية الحيوان.

1. إعداد الحيوان للتنظير القصبات

1. تحديد وزن العجل لجرعة التخدير.
2. وضع الوريد (IV) ط الوصولن حبل الوريد الأيسر.
3. الأولى، حقن ببطء زيلازين (0.2 ملغم / كغم من وزن الجسم) على مدى ما يقرب من 30 ثانية، ثم، بعد حدوث التخدير، وضخ الكيتامين (2.0 ملغم / كغم من وزن الجسم).
4. رفع الحيوان على الطاولة ووضعه في الاستلقاء الجانبي الأيمن. مرة واحدة يتم وضع الحيوان على نحو كاف على الطاولة، ومعرفة ما اذا كان وصول الرابع لا يزال في مكان وتعديل إذا لزم الأمر. أثناء التخدير، والتحقق بانتظام منعكس الجفن لتحديد عمق التخدير.
5. مرة واحدة الحيوان يتنفس بشكل مطرد، ويكون هناك شخص سحب اللسان وتمتد من الرقبة. وضع منظار أنبوب معدني في فم الحيوان، وذلك باستخدام الحركات الدورية طفيفة. دفع إلى الأمام تحت السيطرة منظار الأفق، وذلك باستخدام مصباح يدوي، حتى الحنجرة مرئيا.
6. الحفاظ على التخدير في جميع أنحاء الداخلي بالمنظار كله عن طريق حقن بلعة من 7 ملغ و 70 ملغ زيلازين الكيتامين حسب الحاجة.

2 تلقيح (التلقيح مواقع: الشكل 1)

1. 3 إعداد المحاقن مع اللقاح، تحتوي على 1، 2، و 5 مل من اللقاح.
2. إدراج أنبوب تفلون في قناة تعمل في المنظار. يجب أن الأنبوب لا تبرز من طرف المنظار ل.
3. إدراج المنظار من خلال منظار معدني. تعديلات طفيفة من منظار قد تكون ضرورية لتمكين مرور الحنجرة. ورغامية قصبة، والذي يتفرع إلى الجانب الأيمن، ويساعد على محاذاة الصورة على الشاشة.
4. نعلق المحقنة مع 5 مل اللقاح إلى نهاية الأنبوب التفلون. التنقل في أنبوب في الفروع حيث تودع اللقاح وتطبيق المبلغ المطلوب (الرئة اليمنى: الفص المتوسط: 0.5 مل، الفص الإضافي: 0.5 مل، الفص الذنبية: 0.5 مل و 1.0 مل؛ اليسار الرئة: القحفية الفص، بارس القحفية : 0.5 مل، فارس الذنبية: 0.5 مل، الفص الذنبية: 1.5 مل). نعلق المحقنة مع 1 &# 160؛ مل اللقاح إلى أنبوب، ثم انتقل إلى رغامية قصبة وإيداع اللقاح (القحفية الفص، بارس الذنبية: 1.0 مل). فإنه من المفيد أن نقترب دائما تعريب في نفس الترتيب.
5. إزالة المنظار والمنظار.
6. رش 1 مل من اللقاح في كل منخر مع المحرك.
7. جلب الحيوان إلى مستقرة ووضعه في موقف المعرضة للالاستيقاظ. لا تترك الحيوان غير المراقب أو في الشركة من الحيوانات الأخرى حتى استعاد وعيه أنها كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. يجب أن تكون مستقرة الانتعاش مكيفة الهواء، حيث انخفضت قدرة الحيوان لتنظيم الحرارة تحت التخدير العام.
   ملاحظة: العلامات السريرية الأولى ينبغي أن تحدث عن 24-36 ساعة بعد التطعيم، اعتمادا على الممرض المستخدمة.

3 إجراءات أخذ العينات (مواقع أخذ العينات: الشكل 2)

1. إعداد الحيوان كما هو موضح في الخطوات 1،1-1،6.
2. غسل الشعبى
   1. 5 وضع الحقن تحتوي كل منها على 20 مل من المياه المالحة متساوي التوتر العقيمة، في حمام مائي والسماح لهم الاحماء إلى ما يقرب من 38 درجة مئوية.
   2. ادخال قسطرة غسيل في قناة تعمل المنظار، ثم تضاف المنظار إلى منظار معدنية والتنقل إلى الأمام في القصبات الهوائية الرئيسية من الرئة اليسرى حتى يتم الوصول إلى "موقف إسفين" حيث المنظار لا يمكن دفع أي أبعد من ذلك.
   3. واحدا تلو الآخر، ونعلق المحاقن مع حل كلوريد الصوديوم الدافئ لغسل القسطرة، غرس السوائل ونضح مباشرة. يجب تخزين السوائل غسل القصبات في عبوات زجاجية siliconized وضعت على الجليد على الفور بعد الشفاء لمنع الضامة السنخية من الالتصاق على سطح الزجاج. لاحظ كل من كمية المياه المالحة وغرست كمية السائل استردادها.
   4. إزالة القسطرة غسيل من قناة العمل.
3. بالفرشاة الهوائية
   1. التنقل في المنظار إلى الموقع لأخذ العينات المطلوبة، في البروتوكول وصف هذا هو انشعاب الرغامى.
   2. تغطية فرشاة مع الأنبوب قبل إدراجه في قناة تعمل المنظار حتى يبدو طرف الفرشاة على الشاشة.
   3. دفع الفرشاة مع أنبوب بلاستيكي إلى الأمام حوالي 5 سم وكشف أنه من أنبوب بلاستيكي عن طريق دفع المقبض، ثم انتقل إلى الموقع الذي سيتم تجاهل.
   4. كشط المكالمات الظهارية عن طريق دفع بلطف وسحب الفرشاة ذهابا وإيابا أثناء التنقل المنظار لضمان الاتصال بين الفرشاة وجدار القصبات الهوائية. وقف فرك عندما يحدث النزيف. تغطية فرشاة مع الأنبوب قبل سحب عليه للخروج من قناة العمل.
   5. إعداد ما يصل إلى خمسة مسحات على شرائح المجهر من قبل المتداول بلطف الفرشاة على الشريحة. يحملق في مسحات الميثانول الباردة لمدة 10 دقيقة، والهواء الجاف وتخزينها في -20 درجة مئوية.
   6. يمكن شطف الفرشاة فيوسائل الإعلام المختلفة، وهذا يتوقف على الغرض من عينات الخلايا. إذا أخذ brushings متعددة مع نفس الفرشاة، تأكد من شطفه فقط في وسائل الإعلام التي لا تهيج الأغشية المخاطية.
4. خزعة الرئة Transbronchial
   1. التنقل في المنظار إلى الموقع لأخذ العينات المطلوبة، في البروتوكول وصف هذا هو الذنبية بارس من الفص القحفي. قبل إدراج ملقط الخزعة في القناة عامل مفتوح وإغلاقه عدة مرات للتأكد من أنها تعمل بسلاسة.
   2. دفع ملقط الخزعة في فرع الذيلية للقصبة رغامية حتى حدوث مقاومة طفيفة. سحب 2-3 سم، وفتح ملقط، ودفع حوالي 2 سم إلى الأمام، إغلاق ملقط، والتراجع وإزالة ملقط من قناة العمل. هذا يتطلب بعض الممارسة.
   3. إزالة بعناية الأنسجة من ملقط الخزعة، وذلك باستخدام إبرة أو ملقط صغير. اعتمادا على استخدام مزيد من الأنسجة، واحفظها في nitr السائلogen أو وسيلة تثبيت مناسبة. هذا الحق يجب أن يحدث بعد إزالة لمنع عمليات الانحلال الذاتي.
5. العلاج بعد الإجرائية
   1. جلب الحيوان إلى مستقرة ووضعه في موقف المعرضة للالاستيقاظ. لا تترك الحيوان غير المراقب أو في الشركة من الحيوانات الأخرى حتى استعاد وعيه أنها كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. يجب أن تكون مستقرة الانتعاش مكيفة الهواء، حيث انخفضت قدرة الحيوان لتنظيم الحرارة تحت التخدير العام.
   2. مراقبة الحيوانات عن كثب بحثا عن علامات على استرواح الصدر للساعة 24 المقبلة. توفير الأعلاف والمياه العذبة عندما استعاد وعيه الكامل الحيوان.

النتائج

بالطبع من الأمراض

تأثير الممرض على صحة الحيوانات يمكن تقييمها من خلال الفحص السريري. في نماذجنا عدوى الجهاز التنفسي، تم فحص الحيوانات مرتين يوميا وسجلت الملاحظات السريرية باستخدام نظام التهديف. تم القبض على معلومات إضافية عن طريق أداء في الجسم الحي طرق أخذ العينات الأخرى، على سبيل المثال، مجموعة من الدم ومسحات أو قياس وظائف الرئة. وأجريت الفحوص المرضية للخروج في نقاط زمنية مختلفة بعد التلقيح لوصف التقدم للعدوى ^32-34.

BALF استعادة قيم

وكان معدل الاسترداد من السائل تغرس 83.05 ± 4.58٪ (متوسط ​​± SD).

كشف الممرض

إعادة الزراعة من مسببات المرض لا يمكن أن يؤديها من brushings الشعب الهوائية. أيضا، PCR فحص عينات مختلفة من الممكن الكشف عن مسببات المرض، مثل منظمة الشفافية الدوليةخزعة ssue، عينة الفرشاة علم الخلايا، BALF خلايا ⁵² أو البلعوم مسحة. التصور من مسببات المرض من الممكن عن طريق أداء المناعية من أقسام المجمدة من خزعات الرئة والاستعدادات الترسيب للخلايا BALF (الشكل 3). في التجارب السابقة، وأجريت PCR من عينات الدم ومسحات (الملتحمة، البراز، والأنف) لتوصيف نشر وسفك من مسببات المرض ^32.

علامات التهاب المحلي من أنسجة الرئة

في BALF، يمكن دراسة معايير مختلفة من التهاب الرئة. عدد خلايا الكلي ونسبة العدلات عادة زيادة التهاب الرئة عند غير موجودة. لتمايز الخلايا، والأعمال التحضيرية الترسيب من BALF الخلايا يمكن أن تكون ملطخة وفقا لبالغيمزا ومتباينة باستخدام الغمر النفط (الشكل 4). يتم فصل نسب الخلوية والسائلة من BALF بواسطة الطرد المركزي (300 x ج، و 20 دقيقة). وBALF-طاف يحتوي على علامات المختلفة التي تتغير خلال عمليات التهابات في الرئة ويمكن دراستها تحت ظروف تجريبية. الأمثلة على ذلك البروتين الكلي وeicosanoids ^29،34.

يتم عرض لمحة التخطيطي للمزيد من الاستخدام المحتمل للعينات هو موضح في الشكل 5.

الشكل 1. مخطط الرئة البقري مع مواقع التلقيح (الصفراء). تشير الأرقام إلى الترتيب الذي يدار اللقاح في الشعب الهوائية المختلفة. R: الحق؛ L: اليسار. الرئة اليمنى: 1 الفص المتوسط: 0.5 مل، 2 الفص الإضافي: 0.5 مل، 3 الفص الذنبية: 0.5 مل و 4 1.0 مل؛ الرئة اليسرى: القحفية الفص، 5 بارس القحفية: 0.5 لتر، 6 بارس الذنبية: 0.5 مل، 7 الفص الذنبية: 1.5 لتر، 8 القحفية الفص، فارس الذنبية: 1.0 مل.

الشكل 2 مخطط الرئة البقري مع مواقع التلقيح (الصفراء) ومواقع أخذ العينات: غسل القصبات (الأزرق)، بالفرشاة الهوائية (الأخضر)، وخزعة الرئة (البرتقالي) لاحظ أن يتم الحصول على عينات من جميع المناطق حيث تم إيداع الممرض من قبل. R: الحق، L: اليسار.

الشكل 3 أ) خزعة الرئة من العجل تلقيح مع كلوروفيل amydia الببغائية بعد 4 أيام التلقيح (نقطة في البوصة)، ب) من الرواسب الخلوية BALF من العجل تلقيح مع C. الببغائية 9 نقطة في البوصة. وضع العلامات المناعى للمتدثرات. مشتملات المتدثرة (السهام) موجودة في الرئة (أ) و في الضامة السنخية (ب). الهيماتوكسيلين ملون مباين.

الشكل 4. الرواسب الخلوية من BALF من العجل تلقيح مع C. الببغائية 9 نقطة في البوصة. الضامة السنخية (#) هي نوع من الخلايا الغالبة في BALF. كمية المحببة العدلة (*) يزيد عند وجود عمليات التهابات. تعديل بابنهايم تلطيخ.

es.jpg "العرض =" 600 "/>
الرقم 5. الطرق الممكنة لإعداد العينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد تم تطوير طريقة تنظير القصبات التلقيح وتم تكييف مختلف أساليب أخذ العينات تنظير القصبات لاستخدامها في الحيوانات الكبيرة تحت ظروف تجريبية. التقنيات الموضحة سهلة التعلم، حتى بالنسبة للممتحنين مع خبرة قليلة في التنظير. عملية تنظير القصبات هو الغازية الحد الأدنى وليس له آثار السلبية المرتبطة مع أساليب التلقيح، فضلا عن طرق أخذ العينات وصفها (BAL، خزعة الرئة transbronchial، بالفرشاة الهوائية)، وشوهد من أي وقت مضى في أي من الحيوانات. المضاعفات المرتبطة خزعات الرئة transbronchial في البشر والنزيف واسترواح الصدر شوهد ^48، فإن أيا من هذه العجول في أن خضع لهذا الإجراء. خزعة الرئة هو أكثر transbronchial تستغرق وقتا طويلا ويتطلب المزيد من المعدات من الأسلوب عبر الجلد، وإنما هو أقل الغازية و لا تتحمل مخاطر عدوى الجرح.

و، طريقة بالمنظار تسيطر بصريا من inoculatايون يسمح ترسب كمية محددة من الممرض في مواقع محددة من الرئة. وبالتالي، فإنه يؤدي إلى النتائج السريرية والمرضية متسقة للغاية في جميع الحيوانات تلقيح ^32-34. ومع ذلك، فإنه لا تشبه كل ملامح العدوى الطبيعية في العجول. في نموذج لC. الجهاز التنفسي عدوى الببغائية، قاد أسلوب الموصوفة من التلقيح إلى آفات الرئة المرتبطة بمواقع من الممرض التنسيب ^34، بينما في الإصابات المكتسبة طبيعيا العجول عادة ما يصابون بالالتهاب الرئوي من الفص القمي. هذه الحقيقة يجب أن يؤخذ في الاعتبار عند تفسير أهمية النتائج التجريبية في سياق التهابات الرئة المكتسبة الطبيعي في الأبقار.

Videoendoscopic BAL يسمح أخذ عينات من منطقة محددة من الرئة. لأغراض تجريبية، وهذا هو ميزة بالمقارنة مع استخدام القسطرة الأنفية في ظل ظروف أعمى. ويرجع ذلك إلى تشريح الرئة البقري، فإن القسطرة إدراجها عمياء يكون دفعأد إلى الفص حجابي الحق في معظم الحالات ^53،54 والفاحص ليس له أي تأثير على المنطقة من الرئة الذي lavaged. ميزة أخرى من BAL بالمنظار في العجول تخدير في الاستلقاء الجانبي هو ارتفاع متوسط ​​معدل الاسترداد من السائل غرست أكثر من 80٪. مقارنة مع غيرها من الدراسات التي تكشف، في وضع والعجول مخدرا، والانتعاش من 133.3 ± 1.6 مل ⁴⁶ و 127.13 ± 3.53 مل ⁴⁵ بعد تقطير من 240 مل السوائل في الفص الذيلية يقال. في العجول مخدرا في الاستلقاء القصية يمكن استعادة 51٪ من السائل غرست من الفص القحفي و 62٪ من الفص الذيلية ^43. وهذا يعني أن ما يقرب من نصف السائل غرست يمكن استردادها في وضع رأسي من العجل. اعتمادا على كمية من BALF حاجة لمزيد من إعداد العينات، وهذا قد لا تترك ما يكفي من المواد لتنفيذ جميع التجارب المطلوبة. BAL في الماشية وقد تم استخدامها من قبل العديد من المجموعات البحثية والعديد منوقد تم فحص معلمات مختلفة تحت ظروف مختلفة. يقوم معظم المؤلفين غسيل من فصوص القاعدية ^43،45،46، ولكن كمية السائل المستخدمة لغسل تختلف بين المجموعات البحثية. وهذا يؤدي إلى عدم الاتساق في التخفيف من الخلايا تعافى والبروتينات وغيرها من المواد، مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج من المنشورات المختلفة. وبالتالي، لاستخدامها في الماشية فمن المستحسن غسل مع خمسة أجزاء من 20 مل (أي 100 مل في المجموع) الجسم الدافئة، والمياه المالحة متساوي التوتر، والتي يتم استردادها على الفور بعد تقطير. عند استخدام القسطرة غسيل بقطر كبير (أي> 2 مم)، حجم كل جزء يحتاج إلى زيادة طفيفة، اعتمادا على كمية السوائل التي ستبقى في القسطرة.

تشريح مجزأة للغاية في الرئة البقري يؤدي إلى وجود قيود منهجية؛ النتائج التي تم الحصول عليها من جزء واحد من الرئة قد لا يكون صحيحا بالنسبة لبقية الرئة. حيث لا يوجدالسيطرة مرأى من منطقة الرئة كله بحثها بواسطة الخزعة transbronchial وغسل، الفاحص لا يمكن معرفة ما إذا كانت عينات مجالات صحية أو المريضة. وبالتالي، فمن المهم جدا أن يجرب المواقع حيث تم تلقيح الممرض قبل من أجل الحصول على معدل استرداد أعلى من مسببات المرض والحصول على إمكانية أخذ العينات أعلى من المناطق الرئة المريضة. قيود أخرى هي زيادة خطر التخدير في الحيوانات من حالة سريرية الفقراء. يجب فقط أن تستخدم الأساليب المذكورة في نماذج من خفيفة الى معتدلة مرض للحفاظ على عبء للحيوانات عند أدنى مستوى ممكن. وينبغي دائما أن تبقى التخدير العام في المجترات قصيرة قدر الإمكان، حيث أن تطوير الغاز في الكرش يزيد من مخاطر التخدير في هذه الأنواع. يجب أن توضع الحيوانات في موقف المعرضة مباشرة بعد القصبات للسماح للهروب رأس المال من الغاز المتقدمة ويجب أن تراقب عن كثب حتى يتم تعافى تماما أنهم من التخدير. أيضا، وتقنيات وصفها ليست سويتابلي لأخذ العينات فترات أقل من 24 ساعة.

بروتوكول وصف يمكن تكييفها لعوامل معدية أخرى. وقد وصفت التلقيح بالمنظار من مختلف مسببات الأمراض، مثل C. الببغائية ^32-34، الباستوريلة الحالة للدم ^38-40،42، المستدمية somni ^55، والبقري الفيروسي فيروس الإسهال ^44. أيضا، يمكن تكييفها المواقع إيداع الممرض في الرئة إلى النموذج المطلوب. عند اختيار مواقع أخذ العينات، وبعض الحقائق المهمة يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار: ينبغي اختيار المواقع (ط) أخذ العينات استنادا إلى مواقع التطعيم وعلى النتائج المرضية المتوقعة. (ب) عند التشريح التي يتعين القيام بها يجب الحرص على ترك ما يكفي من المناطق الرئة unsampled لالسابقين فيفو أخذ العينات. (ج) يجب اختيار مواقع أخذ العينات الموقع بحيث يمكن التوصل إليها مع المعدات. وخاصة بالنسبة للخزعة الرئة transbronchial، وهناك قيود نظرا لطول ملقط الخزعة. (د) Tانه أمر من أخذ العينات هو المهم، بالفرشاة الشعب الهوائية والرئة خزعة transbronchial قد يؤدي إلى نزيف الطفيفة، التي من شأنها أن تلوث BALF. وبالتالي، يجب أن يكون دائما BALF الحصول أولا. عند استخدام البروتوكول في الأنواع الأخرى، يجب أن تؤخذ في التشريح الرئة أنواع محددة في الاعتبار.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary Video Endoscope	Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany	PV-SG 22–140	diameter: 9 mm, working channel: 2.2 mm, working length 140 cm
Lavage catheter	Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany		diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
Actuator	WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany	32660	length: 60 mm
Biopsy forceps	Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany	REF 60180LT	1.8 mm, serrated, oval
Omnifix 20 ml, Luer-Lock	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	4617207V
Cytology brush	mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany	110240-10	working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
iv acess	Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany	370-211	diameter: 1.2 mm; length: 43 mm
Rompun 2% (xylazin)	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany		0.2 mg/kg bodyweight
Ketamin 10% (ketamine)	bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany		2.0 mg/kg bodyweight
Isotonic saline solution	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	3200950
SUB 6 waterbath	CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany	n/a
Metal tube speculum	n/a	n/a	diameter: 3.5 cm; length: 35 cm
Flashlight	n/a	n/a
Siliconized glass bottles	n/a	n/a	siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
Omnifix Luer 3 ml	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	4616025V
Omnifix Luer 5 ml	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	4616057V
Sealing plugs	Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany	900-3057
Inoculum		n/a	dilute pathogen in 8 ml buffer