생물 의학 연구에 소 폐 : 시각적으로 유도 기관지, Intrabronchial 접종 및<em&gt; 생체</em&gt; 샘플링 기법

요약

이 문서는 실험 조건에서 소 폐 기관지 내시경 기술, 즉 bronchoscopically 안내 접종, 기관지 세척액, 기관지 솔질하고, 기관지 폐 생검을 설명합니다.

초록

호흡기 의학의 연구에 다른 동물 모델에 대한 지속적인 검색이 있습니다. 연구의 목적에 따라, 폐 질환의 모델로서 큰 동물은 종종 마우스보다 훨씬 더 인간의 폐의 상황과 유사. 큰 동물들과 함께 작업하는 것은 또한 동물을 희생하지 않고 장기간의 연구를 수 시간의 특정 과정을 통해 반복적으로 동일한 동물을 맛볼 수있는 기회를 제공합니다.

기준은 호흡기 클라미디아 시타 감염 소 모델의 사용을위한 생체 시료 채취 방법을 확립했다. 샘플링은 연구 기간 동안 각각의 동물에 다양한 시간 지점에서 수행되어야하고, 샘플은 실험 조건 하에서 호스트 응답뿐만 아니라 병원체를 연구하는데 적합해야한다.

기관지 내시경은 인간과 동물 용 의약품의 귀중한 진단 도구입니다. 그것은 안전하고 법으로서 절차입니다. 이 북극르 intrabronchial 송아지의 접종뿐만 아니라 하부 호흡기에 대한 샘플링 방법에 대해 설명합니다. Videoendoscopic는 intrabronchial 접종은 모두 접종 동물에서 매우 일관된 임상 및 병리 결과에지도하고 있습니다, 따라서, 감염성 폐 질환의 모델에서 사용하기에 적합. 설명 샘플링 방법은 기관지 세척, 기관지 솔질 및 기관지 폐 생검이다. 이 모든 인간의 의학에서 중요한 진단 도구입니다 6 ~ 8 주령의 송아지에 대한 실험을 위해 적용 할 수 있습니다. 얻어진 샘플은 호스트에있는 폐 염증의 정도의 병원체 검출 및 특성 모두에 적합했다.

서문

생물 의학 연구에 큰 동물 모델의 값

현대 학제 생물 의학 연구에서 동물 모델은 여전히​​ 복잡한 상호 작용을 설명하기에 빠뜨릴 수없는 - 건강이나 질병 상태와 관련된 - 포유 동물의 생물 내. 연구의 1 % 미만 국내 동물과 작업하는 동안 생물 의학 연구 ^1의 모델로 소, 말, 양, 가금류를 공부 과학자에게 수여되는 17 노벨상에도 불구하고, 동물 실험의 요즘 대부분은, 설치류로 수행됩니다 또는 가축.

작은 동물은 많은 실용적인 장점 (즉, 저렴한 비용, 유전 순응성, 높은 처리량, 수많은 유전자의 가용성 및 면역 학적 도구 및 키트)를 제공하고, 유 전적으로 변형 된 쥐 모델은 일반적으로 특정 분자 경로를 발견 기계론의 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 복잡한 시스템, T의 생물 의학 연구에그는 생물학적 관련성 및 마우스 모델의 임상 적 유용성은 점점 더 의심되고있다. 그들은 오해의 소지가 생물학적 복잡성 ^2-9의 지나친 단순화의 위험을 부담 할 수 있습니다.

인한 종 (species) 간의 특수성으로, 단일 동물 종 완전 인간 상황을 반영하지 것이고, 둘 이상의 모델의 사용은 학제 생물 의학 연구 방법에서 도움이 될 것으로 보인다. 병진 의학의 맥락에서, 큰 동물은 인간과 동물 모두 건강 ¹ 이중 사용의 높은 생물학적 관련성이 결과를 제공하는 등 비교 모델을 제공 할 수있는 기회를 제공합니다. 현저하게, 인간 게놈은 더 밀접하게 실험실 쥐의 게놈보다는 소 게놈에 의해 닮은 있습니다. 또한 다른 분류군에 비해 마우스의 게놈은 더욱 ^10-12 재정렬 것을 최근에 확인되었다.

복잡한 연구 설계에서, 가축의 사용은 uniq를 제공동물을 희생하지 않고 1과 동일 - individuum으로부터 생체 시료의 다양한 반복 콜렉션으로 인트라 개별 장기 연구 UE 기회. 따라서 기능적인 염증 및 형태 학적 변화는 ¹³ 시간의 일정 기간 동안 동일한 주제에 모니터링 할 수 있습니다.

적절한 호흡 모델로 소 폐

때문에 폐 해부학, 호흡 생리학, 폐 면역학에 큰 차이의 높은 숫자로, 마우스는 인간의 폐 질환의 많은 중요한 병태 생리 학적 측면을 재생하지 않습니다. 호흡기 질환 ^2,9,14-16의 동물 모델 등을 사용할 때 고려되어야한다. 해부학과 구조의 특수성 각 포유류의 폐에 존재하지만, 기능적 특성 (즉, 폐 볼륨, 기류 및 호흡 기계)에 의한 유사한 체중에 성인 인간과 종아리 사이에 더 나은 비교할 수(50~1백kg).

다음과 같이 소 폐의 종 고유의 특성이 요약되어 있습니다 : 왼쪽 폐 (2 개 세그먼트로 분할하고, lobus의 caudalis됩니다 lobus의 cranialis) 두 개의 엽 (叶)으로 구성되어, 오른쪽 폐는 네 개의 엽 (叶)으로 구성되어있는 동안 (lobus cranialis, lobus 미디 우스, lobus의 caudalis 및 lobus의 accessorius). 대부분의 다른 포유류의 폐 해부학과는 달리, 기관의 오른쪽 측면에서 직접 오른쪽 뇌 로브 지점의 기관지. 해부학 subgross에 대하여, 소의 폐 분엽의 높은 수준과 상대적으로 낮은 특정 폐 준수 선도 간질 조직 ^17,18의 높은 비율과 높은 폐동맥 티슈 저항 ^(19)을 제시한다. 따라서 필요한 호흡 활동은 다른 종 ^{(20, 21)에} 비해 다소 높다. 분엽의 높은 수준의 세그먼트의 강한 독립에 이르게한다. 따라서, INFlammatory 과정은 결합 조직의 격막에 의해 제한하고, 질병 및 건강 세그먼트는 종종 같은 로브에서 거짓말. 때문에 담보기도의 부족으로, 소 폐 특히 폐쇄성 폐 기능 장애 ^(13)를 미러에 적합합니다. 소 폐의 혈관에 관해서는, 작은 폐동맥 매우 눈에 띄는 평활근 층을 보여줍니다. 따라서, 종아리는 ^{22 ~ 24를} 개조 폐동맥 고혈압이나 혈관의 잘 확립 된 동물 모델이 될 수있다.

호흡기 감염과 관련하여, 자연적으로 발생하는 질병은 사람의 비교 질병과 많은 유사점을 공유하는 가축에 존재합니다. 전형적인 예는 소 결핵 ^(25), 호흡기 세포 융합 바이러스 송아지 ^{26 ~ 28의} (RSV) 감염, 또는 자연적으로 획득 클라미디아 감염 ^29입니다. 따라서, 큰 동물 모델은 밀접하게 자연의 호스트의 상황과 유사 않습니다. 따라서, 그들은 가장 USEF 있습니다UL 호스트 병원체 상호 작용과 인간 ^{(30, 31)에} 해당하는 질병의 복잡한 기전을 연구.

호흡 클라미디아 시타 감염의 생물학 관련 모델로, 송아지는 소과이 병원체 ^32-35 천연 호스트를 대표하기 때문에 선택되었다. 동물과 인간의 질병 또는 가능한 전송 경로의 발병 기전과 관련하여,이 모델에서 얻은 정보는, 소와 사람 모두에게 영향을 우리의 지식을 확장하는 데 도움이 될 것입니다. 또한이 모델은 폐 C.의 제거를위한 일반적으로 인정 및 대체 치료 옵션을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다 모두 동물과 인간의 의학에 대한 관심이 다시이며, 시타 감염,,.

소 호흡기 시스템에서와 시편 획득 가능한에 적용하는 기술

이 논문은 설명하고 기술과 진단 방법을 보여줍니다 applicabl소 폐에 전자와 포유류의 폐 및 치료 적 개입의 효과에 대한 병원균의 양의 효과를 평가하기 위해 우리의 모델에 사용.

기관지 내시경은 1960 년대 이후 인간의 의학에서 수행 된 안전한 절차 ^36로 간주됩니다. 송아지에서 실험 기관지 내시경은 처음 ⁽³⁷⁾ 1968 년에 설명했다. 병원균의 intrabronchial 응용 프로그램 Potgieter 등에 의해 제안되었다. 신뢰할 수있는 방법은 종아리 ^(38)에 하부 호흡기 질환을 생산하고 지금 소 연구 ^34,39,40의 대폭적인 방법입니다로서. videoendoscopic 통제하에 병원체의 정의 양의 Intrabronchial 접종은 폐의 감염 인자를 선택적으로 배치 할 수 있습니다. 이것은 모든 동물 ^(34)에 일관된 임상 및 병리학 적 연구 결과에 이르게 인해 병원균 노출로 변경 될 것으로 예상되는 폐 영역의 표적으로 샘플링을 할 수 있습니다.

기관지 세척액 (BALF)는 폐 염증의 존재와 정도에 대한 잘 설명하는 지표입니다. 기관지 폐포 세척액 (BAL)은 호흡기 질환 ^(41)의 다양한 진단을 위해 인간의 의학의 표준 절차입니다. 생우에서 BAL은 지난 세기 ⁴² 년대 말 70 년대 윌키와 마컴에 의해 도입되었다. 그것은 가축의 낮은 호흡 기관을 연구하는 안전하고 반복 가능한 방법으로 간주되었다. 때문에 굴곡성 기관 지경 건강한 송아지에 1988 프링 글 등. 수행 BAL에있는 건강한 동물의 BALF 매개 변수에 대한 충분한 데이터의 부족. 저자는 비교 결과 ^(43)를 얻기위한 실험 조건 하에서 BAL 프로토콜을 표준화 할 필요성을 지적 하였다. BAL은 여전히 송아지 ^44-46의 생체 시료 채취 방법으로 사용된다.

기관지 솔질은 일반적으로 인간의 의학에서 사용되는종 양성 병변 또는 미생물 학적 분석 ³⁶ 견본 진단 도구입니다. 연구 목적으로, 세포 학적 칫솔질에 의해 수확 상피 세포의 주요 세포 배양은 ⁴⁷ 얻을 수있다. 가축에서 미생물 분석 기관지 칫솔질의 사용은 폐 ^(43)의 미생물 환경을 특성화 기술되었다.

경 기관지 폐 생검은 폐 조직 샘플을 제공하고 인간의 폐 질환을 확산위한 유용한 진단 도구입니다. 의 인성 기흉 및 절차 관련 출혈이 기술과 관련된 합병증이다. 이들의 발병률은 인간 환자 ^(48)에 1 % 미만으로보고되어있다. 기관지 폐 생검에 필요한 고가의 장비와 생검을 얻기 위해 필요한 시간으로 인해 가축에서 사용하기위한 일반적인 방법은 아니다. 대신, 경피적 폐 생검은 현장 조건 ^49-51에서 더 편리합니다.

프로토콜

윤리 정책
이 연구는 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽과 국가 법에 의거하여 수행 하였다. 프로토콜은 튀 링겐 주, 독일 (: 04-004/11 허가 번호)에 동물 실험 윤리 및 동물의 보호에 관한위원회의 승인을 받았다. 모든 실험은 동물 보호에 대한 공인 기관 요원의 감독하에 수행되었다. 기관지 내시경은 엄격하게 전신 마취를 시행 하였다. 연구 기간 동안, 모든 노력은 불편 함이나 고통을 최소화하기 위해 만들어졌다.

총론
설명 된 기술은 60 ~ 80 kg의 무게, 연령의 약 6-8주의 송아지를 위해 개발되었습니다. 다른 큰 동물 종 또는 연령과 체중에있는 다른 송아지의 사용을 위해, 기술은 크기와 무게에 맞게 및 계정에 특정 동물 종의 폐 해부학을하도록해야합니다. 모든사용되는 장비는 멸균해야합니다. 클라미디아 시타가 인간의 호흡기 및 일반 질병을 일으키는 원인이 될 수있는 인수 공통 세균이다. 비 조류 C. 본 프로토콜에서 사용 시타 변형 DC15는 바이오 안전성 레벨 2에 따라 처리해야합니다. 병원체로 감염된 동물과의 모든 작업은 이러한 인공 호흡기, 스플래시 물 증거 낙하산 강하 복, 고무 장화 및 장갑 등 개인 보호 장비를 착용 수행해야합니다. 적절한 호흡 보호구를 착용하는 것은 매우 중요하다 C.에 대한 감염의 자연 경로 이후 시타는 aerogen입니다. 포장 및 샘플의 라벨은 모든 것이 동물 하우징 장치를 떠나기 전에 제조업체의 지침에 따라 chlamydiae에 대해 살균 효과로 처리해야하기 때문에 살균제 증명해야합니다.

1. 기관지의 동물을 준비

1. 마취제의 투여 량에 대한 송아지의 무게를 결정합니다.
2. 정맥 주사 (IV) 액세스 나 배치N 왼쪽 경정맥.
3. 첫째, 천천히 진정 작용이 발생한 후, (2.0 ㎎ / ㎏ 체중) 마취제를 주입 한 후, 약 30 초 이상 (0.2 ㎎ / ㎏ 체중) 자일 라진을 주입.
4. 테이블에 동물을 들어 올려 오른쪽 측면 드러 누움에 배치합니다. 동물이 적절하게 테이블에 배치되면 IV 접근이 아직도 그 자리에있는 경우, 검사하고 필요한 경우이를 다시 조정. 마취하는 동안 정기적으로 마취의 깊이를 결정하기 위해 눈꺼풀의 반사를 확인합니다.
5. 동물이 꾸준히 호흡을하면, 사람이 혀를 당겨 목을 스트레칭해야합니다. 약간의 회전 운동을 이용하여, 동물의 입에 금속 튜브 검경를 놓습니다. 후두가 보일 때까지, 손전등을 사용하여 시력 제어 앞으로 검경을 밀어 넣습니다.
6. 필요에 따라 7 밀리그램 자일 라진 70 밀리그램 케타민의 알약을 주입하여 전체 내시경 절차 전반에 걸쳐 마취를 유지합니다.

. 2 예방 접종 (접종 장소 : 그림 1)

1. 1, 2를 포함 접종 3 주사기 및 접종 5 ㎖를 준비합니다.
2. 내시경의 작업 채널에 테프론 튜브를 삽입합니다. 튜브는 내시경의 끝에서 돌출하지 않아야합니다.
3. 금속 검경을 통해 내시경을 삽입합니다. 검경의 약간의 재조정은 후두의 통과를 가능하게 할 필요가 있습니다. 오른쪽에 떨어져 분기, 모니터에 사진을 정렬하는 데 도움이 기관지 trachealis.
4. 테프론 튜브의 단부에 5 ㎖의 접종 주사기를 부착. 접종이 기탁된다 가지에 튜브를 이동하고 원하는 금액 (오른쪽 폐 적용 Lobus의 미디 우스 : 0.5 ㎖, Lobus의 accessorius : 0.5 ㎖를, Lobus는 caudalis : 0.5 ㎖, 1.0 ㎖에, 왼쪽 폐 : Lobus의 cranialis, cranialis을 갈 거예요 : 0.5 ㎖, 파스 caudalis : 0.5 ㎖, Lobus는 caudalis : 1.5 ㎖). 1 주사기를 부착 &# 160; 관 ㎖를 접종은 다음 기관지 trachealis로 이동하여 접종 예금 (1.0 ㎖를 Lobus의 cranialis을 caudalis을 갈 거예요). 그것은 항상 동일한 순서 현지화 접근하는 것이 도움이된다.
5. 내시경 및 검경을 제거합니다.
6. 액추에이터 각 콧 구멍에 접종 1 ㎖ 스프레이.
7. 다시 안정에 동물을 가져오고 깨어 난에 발생하기 쉬운 위치에 배치합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 또는 다른 동물의 회사에서 동물을 방치하지 마십시오. 체온 조절을위한 동물의 능력이 전신 마취 감소되기 때문에 복구 안정, 에어컨이 있어야합니다.
   참고 : 첫 번째 임상 증상은 사용되는 병원체에 따라 접종 후 약 24 ~ 36 시간을 발생한다.

. 3 샘플링 절차 (샘플링 사이트 : 그림 2)

1. 단계 1.1-1.6의 설명에 따라 동물을 준비한다.
2. 기관지 폐포
   1. 물 목욕에 각각 멸균 등​​장 식염수 20 ㎖를 포함하는 5 주사기를 배치하고 약 38 ° C로 예열
   2. 내시경의 작업 채널로 세척 카테터를 삽입 한 후 금속 검경에 내시경을 삽입하고 내시경이 더 앞서 하나를 푸시 할 수없는 곳으로 "쐐기 위치가"에 도달 할 때까지 왼쪽 폐의 주요 기관지로 앞으로 이동합니다.
   3. 다른 후 하나는, 세척 카테터에 따뜻한 염화나트륨 용액으로 주사기를 장착, 유체를 주입하고 직접 대기음. 기관지 세척액은 실리콘 처리 된 유리 병에 저장 및 유리 표면에 부착에서 폐포 대 식세포를 방지하기 위해 복구 후 즉시 얼음에 넣어해야합니다. 주입 식염수의 양 및 복구 유체의 양을 모두 있습니다.
   4. 작업 채널에서 세척 카테터를 제거합니다.
3. 기관지 솔질
   1. 설명 프로토콜이 Bifurcatio tracheae입니다 원하는 샘플링 위치에 내시경을 이동합니다.
   2. 브러시의 끝이 모니터에 표시 될 때까지 내시경의 작업 채널에 삽입하기 전에 튜브와 브러시 커버.
   3. 앞으로 플라스틱 튜브로 약 5 센티미터 브러시를 누르고 핸들을 밀어 플라스틱 관에서 발견, 다음 솔질하는 위치로 이동합니다.
   4. 브러시와 기관지의 벽 사이의 접촉을 확인하기 위해 내시경을 탐색하는 동안 앞뒤로 가볍게 브러시를 밀고 당겨 상피 통화를 문질러. 출혈이 발생하면 마찰 중지합니다. 작업 채널 뺄 전에 튜브와 브러시 커버.
   5. 부드럽게 슬라이드에 브러시를 회전하여 현미경 슬라이드에 다섯 얼룩까지 준비합니다. -20 ℃에서 10 분, 공기 건조 및 저장을위한 냉 메탄올의 얼룩을 흥분시키는
   6. 브러쉬로 세척 할 수있다샘플링 된 셀의 목적에 따라 다양한 미디어. 같은 브러시로 여러 칫솔질을 복용하는 경우에만 점막을 자극하지 않는 미디어에 씻어해야합니다.
4. 경 기관지 폐 생검
   1. 설명 프로토콜이 Lobus의 cranialis의 갈 거예요 caudalis입니다 원하는 샘플링 위치에 내시경을 이동합니다. 열려있는 작업 채널로 생검 겸자를 삽입하고 원활하게 작동하는지 확인하는 데 몇 번을 닫기 전에.
   2. 약간의 저항이 발생할 때까지 trachealis 기관지의 꼬리 지점에있는 생검 겸자를 밀어 넣습니다. 다시 2-3cm 당겨 집게를 열고, 앞으로 약 2 ㎝를 밀어 집게를 닫고 다시 끌어와 작업 채널에서 집게를 제거합니다. 이것은 약간의 연습이 필요합니다.
   3. 조심스럽게 바늘이나 작은 집게를 사용하여 생검 겸자에서 조직을 제거합니다. 조직의 추가적인 용도에 따라, 액체되었습니다 Nitr에 보관ogen 또는 적합한 고정 매체. 이자가 분해 과정을 방지하기 위해 제거 후 바로 발생한다.
5. 시술 후 치료
   1. 다시 안정에 동물을 가져오고 깨어 난에 발생하기 쉬운 위치에 배치합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 또는 다른 동물의 회사에서 동물을 방치하지 마십시오. 체온 조절을위한 동물의 능력이 전신 마취 감소되기 때문에 복구 안정, 에어컨이 있어야합니다.
   2. 다음 24 시간 동안 기흉의 징후를 면밀히 동물을 모니터링합니다. 동물이 전체 의식을 회복했을 때 사료와 신선한 물을 제공합니다.

결과

질병의 과정

동물의 건강에 대한 병원체의 효과는 임상 시험에서 평가 될 수있다. 우리의 호흡기 감염 모델에서, 동물은 매일 두 번 검토하고, 임상 관찰은 채점 시스템을 사용하여 기록되었다. 추가 정보는 예를 들어, 다른 생체 표본 추출 방법, 혈액의 수집 및 면봉이나 폐 기능 측정을 수행하여 캡처 한. 접종은 감염 ^32-34의 진전을 설명하는 후 병리 검사는 서로 다른 시간 지점에서 수행 하였다.

BALF 회수율

주입 액의 회수율은 83.05 ± 4.58 %였다 (평균 ± SD).

병원체 검출

병원체의 Recultivati​​on 기관지 칫솔질에서 수행 할 수 있습니다. 또, 각종 시료의 PCR 스크리닝은 병원체를 검출하는 것이 가능하다, 예를 들면 TIssue 조직 검사, 세포학 솔 샘플, BALF 세포 ⁵² 또는 인두 면봉. 병원체의 시각화 폐 생검 및 BALF 세포의 침전 제제의 동결 절편의 면역 조직 화학 염색 (그림 3)을 수행 가능합니다. 이전의 실험에서 혈액 샘플과 면봉 (결막, 배설물, 코)의 PCR은 확산 및 병원체 ^(32)의 흘리기의 특성을 수행 하였다.

폐 조직의 지역 염증의 마커

BALF에서 폐 염증의 다양한 매개 변수를 공부하실 수 있습니다. 폐 염증이 존재할 때 전체 세포 수 및 호중구의 비율은 일반적으로 증가한다. 세포 분화를 들어, BALF 세포의 침전 제제는 지엠 사 (Giemsa)에 따라 스테인드 기름 침수 (그림 4)를 사용하여 차별화 할 수 있습니다. BALF의 세포 및 액체 비율은 원심 분리 (, 20 분 300 XG)로 구분됩니다. BALF- 상층 액은 폐에 염증 과정에서 변경 및 실험 조건에서 연구 할 수있는 다양한 마커가 포함되어 있습니다. 예를 들면 총 단백질과 에이코 사 노이드 ^{29,34입니다.}

설명 된 샘플의 잠재적 추가 사용의 개략도가도 5에 도시된다.

접종 장소 (옐로우)와 소의 폐의 그림 1. 반응식. 번호 종균이 다른 기관지에 투여되는 순서를 나타낸다. R : 오른쪽; L : 왼쪽. 오른쪽 폐 : 1 Lobus의 미디 우스 : 0.5 ㎖, 2 Lobus의 accessorius : 0.5 ㎖, 3 Lobus caudalis : 0.5 ㎖ 및 1.0 ㎖의 4; 왼쪽 폐 : Lobus의 cranialis, 5 파스는 cranialis : 0.5 ㎖, 6 파스 caudalis : 0.5 ㎖, 7 Lobus caudalis : 1.5 ㎖, 8 Lobus의 cranialis, 파스 caudalis : 1.0 ML.

. 그림 2 접종 사이트 (노란색) 및 샘플링 사이트와 소 폐의 계획 :. 기관지 폐포 세척액 (파란색), 기관지 솔질 (녹색), 및 폐 생검 (오렌지) 모든 샘플이 병원체는 증착 지역에서 얻은합니다 전. R : 오른쪽, L은 : 떠났다.

엽록소 접종 송아지의 그림 3.) 폐 생검 amydia 시타는 사일 접종 후 수 (dpi), b)는 송아지에서 BALF의 세포 침전물 C. 접종 시타 9 DPI. chlamydiae에 대한 면역 조직 화학 라벨. 클라미디아 흠 (화살표)는 폐 (a) 및 폐포 대 식세포 (b)에 존재한다. 헤 마톡 실린의 counterstain.

그림 4. C. 접종 송아지에서 BALF의 세포 침전물 시타 9 DPI. 폐포 대 식세포 (#)는 BALF에서 지배적 인 세포 유형입니다. 염증 과정이있을 때 호중구 과립구의 양 (*)가 증가한다. 수정 Pappenheim 염색.

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그림 5. 샘플 준비를위한 가능한 방법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

접종 기관지 방법이 개발되었으며 여러 기관지 샘플링 방법은 실험 조건 하에서 큰 동물들에 사용되기에 적합 하였다. 설명 기술도 내시경 검사에 약간의 경험이있는 시험관에 대해 쉽게 배울 수 있습니다. 기관지의 프로세스는 최소 침습하며 접종의 방법뿐만 아니라, 설명 된 샘플링 방식 (BAL, 기관지 폐 생검, 기관지 칫솔질)와 관련된 부작용은 적 동물 항에 나타나지 않았다. 인간의 기관지 폐 생검과 관련된 합병증은 출혈과 기흉 ^(48), 이들 중 아무도이 절차를 시행 한 송아지에서 볼 수 있었다. 경 기관지 폐 생검은 더 많은 시간이 소요됩니다 및 경피적 방법보다 더 많은 장비가 필요하지만, 덜 침습적이고, 상처 감염의 위험을 부담하지 않습니다.

inoculat의 시각 제어, 내시경 방법이온은 폐의 특정 사이트에서 병원체의 정의 양의 증착을 할 수 있습니다. 따라서, 모든 접종 동물 ^32-34에서 매우 일관된 임상 및 병리학 적 연구 결과가 발생합니다. 그러나, 송아지 자연 감염의 모든 기능을 유사하지 않습니다. 호흡 C.의 모델 자연스럽게 획득 감염 송아지 보통 혀끝의 엽 (叶)의 폐렴을 개발, 반면 시타 감염은 접종의 기술 기술은 병원체의 배치 ^(34)의 사이트와 관련된 폐 병변을했다. 이 사실은 소과 천연 취득한 폐 감염의 컨텍스트에서 실험 결과의 관련성을 해석 할 때 고려되어야한다.

Videoendoscopic BAL은 폐의 정의 된 영역을 샘플링한다. 실험 목적을 위해,이 장님 조건 하에서 비강 카테터의 사용에 비해 장점이다. 때문에 소 폐의 해부학, 맹목적으로 삽입 된 카테터 푸시 것대부분의 경우 ^{(53, 54)의} 오른쪽 횡격막 엽에 ED 및 심사관은 lavaged되어 폐의 영역에 영향을주지 않습니다. 횡 나태에서 마취 된 송아지 내시경 BAL의 또 다른 장점은 80 % 이상의 주입 유체의 높은 평균 회수율이다. 다른 연구와 비교 서, 진정 송아지, 133.3 ± 1.6 ML ^(46)의 복구와 127.13 ± 3.53 ㎖의 ⁴⁵ 꼬리 엽에 액 240 ㎖를 점안 한 후보고 있음을 알 수있다. 진정 송아지 흉골 드러 누움에 주입 액의 51 %는 꼬리 엽 ^{(43)로부터} 두개골 로브와 62 %에서 발견 될 수있다. 이것은 주입 유체의 약 절반은 종아리의 수직으로 복구 할 수 있다는 것을 의미합니다. 상기 샘플 준비에 필요한 BALF의 양에 따라, 이는 원하는 모든 실험을 수행하기에 충분한 물질을 남겨 두지 있습니다. 가축의 BAL 많은 연구 그룹에 의해 사용 된 다수다른 매개 변수는 다양한 조건에서 조사되었다. 대부분의 저자는 기저 로브 ^43,45,46의 세척을 수행하지만, 세척에 사용되는 유체의 양을 연구 그룹간에 다르다. 이로 인해 다른 출판물에서의 연구 결과를 비교하고, 회수 된 세포, 단백질 및 기타 물질의 희석에 불일치가 발생합니다. 따라서, 가축에 사용하기 위해 즉시 점안 후 복구되는 20 ㎖ 몸 따뜻한, 등장 성 식염수 (총 즉, 100 ㎖)의 다섯 분수와 세척을 권장합니다. 큰 직경 (즉,> 2mm)로 세척 카테터를 사용하는 경우, 각 분획의 부피가 약간 카테터에 남아 유체의 양에 따라 증가시킬 필요가있다.

소 폐의 높은 세그먼트 해부학 방법론 제한에 이르게; 폐의 한 부분에서 얻은 결과는 폐의 나머지 부분에 대한 사실이 아닐 수 있습니다. 전혀 없기 때문에기관지 생검 및 세척으로 탐색 할 전체 폐 영역의 시야 제어, 심사관은 샘플링 된 영역이 건강하거나 병에 있었는지 알 수 없습니다. 따라서, 병원체가 병원체의 높은 회수율을받는 질병 및 폐 영역을 샘플링의 높은 가능성을 가지고 순서 전에 접종 하였다 명소를 샘플링하는 것이 매우 중요하다. 또 다른 한계는 가난한 임상 상태의 동물의 증가 마취 위험입니다. 한 방법은 가능한 한 낮은 동물에 대한 부담을 유지하기 위해 질병을 경도에서 중등도의 모델에서 사용되어야한다. 반추위에서 가스 개발이 종에서 마취 위험을 증가로 반추 동물에서 전신 마취는 항상 가능한 한 짧게 유지되어야한다. 동물 기관지가 개발 한 가스의 유출을 허용하는 즉시 발생하기 쉬운 위치에 배치해야하고 완전히 마취에서 회복 될 때까지 면밀히 모니터링해야합니다. 또한, 설명 된 기술은 이타 없습니다24 개 미만의 시간 간격을 샘플링에 적합한 용.

설명 프로토콜은 다른 감염원에 적용 할 수 있습니다. 각종 병원균의 내시경 접종은 C. 같이 설명되었지만 시타 ^32-34, 파 스튜 렐라 해 몰리의 ^38-40,42, 헤모필루스 somni ⁽⁵⁵⁾ 및 소 바이러스 성 설사 바이러스 ^44. 또한, 폐에 병원체 예금의 사이트는 원하는 모델에 적용 할 수 있습니다. (ⅰ) 샘플링 사이트 접종에 위치와 예상 병리학 적 연구 결과에 기초하여 선택되어야한다 : 샘플링 사이트를 선택할 때 몇 가지 중요한 사실이 고려되어야한다. 부검은 치료를 수행 할 때 (II) 생체 표본 추출에 대한 충분한 샘플링되지 않은 폐의 영역을 떠나주의해야합니다. 그들은 장비에 도달 할 수 있도록 (III) 샘플링 사이트 위치를 선택해야합니다. 특히 기관지 폐 생검을 위해, 생검 겸자의 길이에 의한 제한이 있습니다. (iv) T그는 샘플링의 순서는 중요합니다, 기관지 솔질 및 기관지 폐 생검은 BALF를 오염시킬 수있는 작은 출혈로 이어질 수도있다. 따라서, BALF가 항상 먼저 취득해야합니다. 다른 종의 프로토콜을 사용할 때, 종 특이 폐 해부가 고려되어야한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary Video Endoscope	Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany	PV-SG 22–140	diameter: 9 mm, working channel: 2.2 mm, working length 140 cm
Lavage catheter	Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany		diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
Actuator	WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany	32660	length: 60 mm
Biopsy forceps	Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany	REF 60180LT	1.8 mm, serrated, oval
Omnifix 20 ml, Luer-Lock	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	4617207V
Cytology brush	mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany	110240-10	working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
iv acess	Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany	370-211	diameter: 1.2 mm; length: 43 mm
Rompun 2% (xylazin)	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany		0.2 mg/kg bodyweight
Ketamin 10% (ketamine)	bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany		2.0 mg/kg bodyweight
Isotonic saline solution	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	3200950
SUB 6 waterbath	CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany	n/a
Metal tube speculum	n/a	n/a	diameter: 3.5 cm; length: 35 cm
Flashlight	n/a	n/a
Siliconized glass bottles	n/a	n/a	siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
Omnifix Luer 3 ml	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	4616025V
Omnifix Luer 5 ml	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	4616057V
Sealing plugs	Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany	900-3057
Inoculum		n/a	dilute pathogen in 8 ml buffer