إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

Summary

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Abstract

أصبحت نموذجا الزرد الفقاريات الرئيسية التي هي ذات الصلة لكثير من التخصصات لدراسة علمية. الزرد هي مناسبة بشكل جيد خاصة للتحليل الجيني إلى الأمام من العمليات التنموية بسبب التسميد الخارجية، حجم الجنينية، تطور الجنين السريع، والوضوح البصري - كوكبة من الصفات التي تمكن الملاحظة المباشرة للأحداث بدءا من تكون المعيدة لتوالد الأعضاء مع stereomicroscope الأساسية. علاوة على ذلك، يمكن أن الأجنة الزرد البقاء على قيد الحياة لعدة أيام في ولاية فرداني. إنتاج أجنة في المختبر فرداني هو أداة قوية لتحليل طفرية، لأنها تتيح تحديد الأليلات الطافرة متنحية موجودة في الجيل الأول (F1) ناقلات الإناث التالية الطفرات في الأبوية (P) جيل. هذا النهج يلغي ضرورة تنشئة أجيال متعددة (F2، F3، الخ) التي تنطوي على تربية أسرة متحولة، وبالتالي توفير الوقت الباحث جنبا إلى جنب مع الحداحتياجات مساحة مستعمرة الزرد، والعمل، وتكاليف تربية. على الرغم من الزرد وقد استخدمت لإجراء شاشات على مدى العقود العديدة الماضية قدما، كان هناك توسع مستمر من المعدلة وراثيا والجينوم أدوات التحرير. هذه الأدوات نقدم الآن مجموعة كبيرة من الطرق لإنشاء المقايسات دقة لشاشات الجيل القادم والتي يمكن استخدامها لمزيد من تشريح الشبكات التنظيمية الجينات التي تدفع الفقاريات تطور الجنين. هنا، نحن تصف كيفية إعداد الأجنة الزرد فرداني. ويمكن تنفيذ هذا البروتوكول للشاشات فرداني المستقبل الرواية، كما هو الحال في شاشات محسن والقامع، لمعالجة آليات التنمية لعدد واسع من العمليات والأنسجة التي تشكل خلال المراحل الجنينية المبكرة.

Introduction

العمليات الأساسية التي تنسق تطوير الفقاريات يتم حفظها على نطاق واسع ^1. وهناك طريقة فعالة لتحديد الجينات مع أدوار أساسية في التنمية هو عزل الطفرات الوراثية التي تؤدي إلى العيوب المظهرية في عملية الفائدة. الزرد، دانيو rerio، هو نوع مكتملة العظام المياه العذبة صغيرة تعود لعائلة Cyprinidae الأسماك التي أصبحت كائن نموذج المستخدمة على نطاق واسع لعلم الوراثة التنموية الفقاريات على مدى العقود العديدة الماضية ^2. يتم إخصابها البيض الزرد خارجيا، والسماح بالوصول إلى البيضة الملقحة من بداية الإخصاب ^3. علاوة على ذلك، الجنين في وقت مبكر شفافة بصريا، وتمكين التصور التنمية مع stereomicroscope بسيطة ^3. تطور الجنين الزرد سريعا، مع عمليات انشقاق، تكون المعيدة، وتوالد العديد من الهياكل، مثل القلب والكلى، أنجزت إلى حد كبير على مدى اليوم الأول للتنمية ^3. Tانه الوقت من مراحل اليرقات إلى مرحلة النضج الجنسي يأخذ 2-3 أشهر، والبالغين هي الفقاريات الصغيرة حوالي 3-4 سم في الطول، والكثير من الأسماك يمكن الحفاظ على الحد الأدنى من الفضاء في ^2. بالإضافة إلى ذلك، الزرد الكبار لديهم خصوبة عالية، مع كل الأسماك قادرة على إنتاج عدة مئات من الأجنة في الأسبوع ^2. جعلت هذه الصفات لمعرفة منشأ من الزرد لالأمام وعكس شاشات الوراثية. الزرد حاصلا على درجة عالية من الحفظ في التشريح، وبيولوجيا الخلايا، وعلم وظائف الأعضاء مع أكثر الأنواع الفقارية متقدمة مثل الثدييات ^2،4. في الواقع، أظهرت تحليل تسلسل الجينوم الأخيرة التي الزرد يحتوي homologs إلى ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية ^5. وقد مكن هذا الحفظ الباحثين لاستخدام الزرد كنموذج للعديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك الظروف الجنينية والكبار ^2،4. مجتمعة، جعلت هذه العوامل الزرد نظام ممتاز للشاشات تهدف إلى تحديد الجينات التي هيضروري لتطور الجنين الطبيعي الفقاريات.

تم تنفيذ عدد من الشاشات على نطاق واسع في الزرد وحددت عدة آلاف من الطفرات في الجينات التنموية ^6-8. في الذكور البالغين الزرد هو قابل للالطفرات، ويمكن أن تتولد التعديلات الكروموسومات مع ارتفاع وتيرة نسبيا باستخدام ethylnitrosourea المغير الكيميائية (ENU) ^6،7 أو فيروسات الطفرات إقحامي ^9. حتى الآن، تم إنشاء أكثر من 9،000 طفرات وراثية، وتشمل الجينات التي تؤثر على كافة جوانب التطور الجنيني. وقد أنشأت المجتمع الزرد بنك مركزي من هذه المسوخ في مركز الزرد الدولية الموارد (أو ZIRC) ^10، والتي جمعت ما يقرب من 5،000 الأليلات الطافرة والمعدلة وراثيا من مختلف أنحاء العالم. وقد تم تحليل العديد من هذه الطفرات والمستنسخة، وإعطاء الباحثين في مختلف التخصصات البيولوجية المعلومات القيمة التي استخدمت لندف بصرف النظر أستاذ دائملنا مسارات الخلوية والفسيولوجية من خلال رؤى الناشئة مع التجارب الزرد.

على الرغم من أن حددت شاشات قدما عددا كبيرا من الجينات الهامة، والكثير لم يتم حتى الآن تقدير عن الشبكات التنظيمية الوراثية التي تتوسط عدد لا يحصى من العمليات. لم تصل العديد من الشاشات التي بذلت حتى الآن التشبع، وبالتالي إلى الأمام وكذلك شاشات الوراثية العكسية ظلت حجر الزاوية لتحديد آليات التطور الجنيني وتحليلها. في حين أن هناك رؤى الهائلة التي يمكن استخلاصها من أي خط متحولة الزرد واحدة، كان عاملا رئيسيا يحد في مجال تاريخيا الجهد تستغرق وقتا طويلا تشارك في الاستنساخ الموضعية. لهذا السبب، ظلت هوية العديد من الطفرات المستحثة كيميائيا لغزا. ومع ذلك، مع ظهور الأخيرة من نهج تسلسل الجينوم التي تسهل الاستنساخ السريع ^11-14، وتحديد كفاءة لا يصدق من الطفرات الوراثية هو الآن الحديدasible.

الشاشة إلى الأمام تنميط في الزرد هو شاشة مضاعفا التي يمكن تحديد الطفرات المتنحية في غضون ثلاثة أجيال ^6،7 (الشكل 1، يسار العمود). ينطوي هذا الأسلوب الطفرات في توليد الخلايا الجرثومية من الوالدين (P) من الذكور، ومن ثم التزاوج هذه الذكور مع الإناث نوع البرية. كل من الجيل الأول (F1) ذرية من هذا التزاوج سوف تؤوي احد أو أكثر من الطفرات فريدة من نوعها نظرا لمساهمات الكروموسومات من الجينوم الأب تحور. تثار ذرية F1 وoutcrossed مع أنواع البرية لخلق أسر F2. في الأسرة F2، سوف يكون إما الأشقاء النوع البري أو متخالف ناقلات، وincrossed عشوائيا لتوليد براثن F3 التي يتم تحليلها لالنمط الظاهري (ق) من الفائدة. سوف براثن F3 ناقلات متخالف تحتوي على 25٪ النوع البري، و 50٪ متخالف، و 25٪ الأسماك متحولة متماثلة اللواقح. هذا المخطط الفرز متعددة الأجيال فعالة، ولكن العيب الرئيسي لهذا واحديتضمن pproach الوقت اللازم للتحضير للشاشة: تشارك على الأقل 1 سنة من تربية الأسماك وحدها، لأن كل جيل يتطلب حوالي 3 أشهر لتصل إلى مرحلة النضج الجنسي. قيود أخرى من هذا النوع من الشاشة مضاعفا هي العمل، والفضاء، وتكلفة السكن هذه الأجيال.

الشاشة هي واحدة فرداني البديلة التي يمكن استخدامها لتحديد وعزل الطفرات المتنحية في وقت لاحق باستخدام استراتيجيات مماثلة الطفرات ¹⁵ (الشكل 1، العمود الأيمن). وقد وصفت إنتاج الأجنة الزرد فرداني الأولى أكثر من 30 عاما منذ ^{16 عاما،} ولقد تم الاستفادة من قدرة الزرد عادة مضاعفا لتطوير لعدة أيام مع الصيغة الصبغية الكروموسومات فرداني للعديد من الدراسات الجينية منذ هذا الوقت. والفائدة الرئيسية من الشاشة فرداني هو أن هذا الأسلوب لا ينطوي على جمع العائلات F2 من أجل كشف عن الأليلات المتنحية متحولة. بدلا من ذلك، يتم تقييم إناث الجيل F1 للمن الطفرات المتنحية تغاير الزيجوت في عملية الفائدة من خلال دراسة أبنائهم F2 في حالة فرداني (الشكل 1، العمود الأيمن). وعموما، فإن الخطوات لشراء أجنة فرداني هي واضحة نسبيا (الشكل 2). بعد إعداد الحلول اللازمة لمعالجة الحيوانات المنوية، ويتم الحصول على البيض من الإناث الجيل F1 من خلال التلاعب دليل وذلك لقذف (أو "الضغط") البيض من البطن. مرة واحدة يتم الحصول على البيض، وأنها المخصبة في المختبر عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) المعطل الحيوانات المنوية. الحيوانات المنوية المعطل الأشعة فوق البنفسجية غير قادرين على المساهمة الحمض النووي قابلة للحياة إلى البيض يرجع ذلك إلى حقيقة أن الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية قصيرة crosslinks الحمض النووي الأب. ومع ذلك، فإن الحيوانات المنوية لا تزال قادرة على تحريك النشاط البيض والأحداث المرتبطة بالتنمية لاقحي. عند تنشيط التمثيل الغذائي، فإن البيض استكمال الانقسام الاختزالي الثاني، والمضي قدما لتطوير فقط مع نسخة واحدة تودع أمهات كل chromosoلي. بسبب هذا 1N الصيغة الصبغية، الجنين يخضع لعواقب التنموية للأليل متحولة المتنحية، إذا كان موجودا على كروموسوم الأمهات. وبالتالي كل مخلب فرداني F2 سوف تحتوي على 50٪ و 50٪ wildtype الأجنة متحولة إذا كانت الأم هي الناقل متخالف من أليل المتنحية توغل بالكامل. هذا التوزيع من المورثات الجنينية يمكن بسهولة نسبية من حيث تقييم مخلب لوجود النمط الظاهري متحولة (ق) من الفائدة. إذا تم الكشف عن مثل هذا النمط الظاهري، وoutcrossed مؤسس الجيل F1 الإناث فيما بعد إلى نوع البرية الزرد الذكور لخلق وجمع المزيد من حاملات متخالف. لأنه ليس من الضروري تنشئة أجيال متعددة لأداء الشاشة، يمكن للباحث انقاذ وقتا طويلا، والعمل، ومساحة الحوض، ولكن لا يزال لديه القدرة على مسح عدد كبير من الجينوم على أساس عدد من الإناث F1 فحصها. وبالتالي، شاشات فرداني مجدية خاصة بالنسبة للمختبرات الصغيرة أو المشاريع التي بدأت في absenc(ه) من تمويل كبير.

ومع ذلك، هناك العديد من القيود والعوائق لاستخدام النباتات الاحاديه. أول والأجنة الزرد فرداني يعيش لعدة أيام فقط، ويموت عادة بين 3 و 5 أيام بعد الإخصاب (DPF) ^15. الأجنة الزرد فرداني يمكن تمييزها عن diploids يعتمد على عدة خصائص، أهمها كونه الجسم القصير وممتلئ الجسم الذي لديه مع ذلك العدد المعتاد من قطاعات الجسيدة ^15،17. كما تقدم التنمية، وزيادة المعروضات موت الخلايا في الدماغ والدورة الدموية والفقراء، وعادة ما يرتبط بها مع تجميع الدم بنسبة 2-3 DPF وذمة ^15،17. علاوة على ذلك، تفشل النباتات الاحاديه لتضخيم ^15،17 السباحة المثانة. بغض النظر عن هذه الاختلافات المورفولوجية، تتشكل معظم الأعضاء والأنسجة الرئيسية، بما في ذلك القلب، والعين، والحبل الظهري ^15،17. وأشار ميزة واحدة عن براثن فرداني هو أنها تحتوي على مجموعة من الظواهر من حيث أصناف من الأجنة المعيبة & #8212؛ لاحظ ميزة عبر سلالات الزرد. وبالتالي، ينبغي للمرء أن تحقق إذا كانت الأنسجة (ق) ونقطة زمنية من الفائدة تظهر التطور الطبيعي معقول في نوع السلالة البرية فرداني، وبالتالي لديها القدرة على أن تقيم لعيوب وراثية في الشاشة أو المشروع البحثي الأخرى.

على الرغم من هذه التحديات، تم تنفيذها شاشات فرداني بنجاح لتحديد الجينات الضرورية لعمليات التنمية في وقت مبكر من الزرد، وتم البروتوكولات فرداني راسخة الموارد في المجتمع لعدة سنوات ^15-19. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت عملية توليد أجنة الأسماك فرداني من قبل الباحثين لخلق فرداني الجذعية الجنينية (ES) الثقافات الخلية من الأسماك الميداكا ^20،21. بعد إنتاج أجنة في المختبر الميداكا فرداني، استخدمت أجنة لاستخلاص الثقافات الخلية الأولية التي تم passaged لمدة 15 أسابيع تليها 5-8 أسابيع أخرى لتوليد الحيوانات المستنسخة نقية من خلايا فرداني معخصائص الخلية ES ^15-19. الجيل الأسماك فرداني خطوط الخلايا ES يبشر بالخير في المستقبل واسعة لتحليل الظواهر المتنحية في الأنساب الخلية الفقاريات، ويمثل نهجا جديدا للتحليل الجيني في السنوات المقبلة. وبالتالي، وتوليد أجنة الأسماك فرداني وقد تزايد الطلبات في المجتمع البحوث الطبية الحيوية. توفر هذه المقالة الفيديو مظاهرة البصرية من الخطوات المتبعة مع إنتاج الأجنة الزرد فرداني في المختبر باستخدام الحيوانات المنوية المعطل للأشعة فوق البنفسجية بناء على البروتوكولات المعمول ^15-19،22.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على إجراءات للعمل مع الأجنة الزرد الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم في جامعة نوتردام. ملاحظة: على الرغم من أن البروتوكول ينص التالية مظاهرة من الحيوانات المنوية العزلة التي تنطوي على القتل الرحيم من الذكور، الحيوانات المنوية يمكن جمع من المسام التناسلية للتخدير الزرد الذكور الذين يعيشون باستخدام الضغط في البطن لطيف وmicrocapillary لجمع الحيوانات المنوية ^17،18. الضغط من الذكور الحية يتطلب عدة ذكور لاستخدامها من أجل جمع كمية يعادل الحيوانات المنوية التي يمكن الحصول عليها من أحد الذكور ^17،18 الموت الرحيم. ومع ذلك، من الذكور التي خضعت الضغط البقاء بصحة جيدة جدا، ويمكن استخدامها لالتزاوج الطبيعي أو اللاحقة في المختبر إجراءات ^17. كلما كان ذلك ممكنا، يجب أن إجراءات اختيار لحد التضحية الأسماك لا لزوم لها.

1. إعداد حلول واسماك الزرد التزاوج الغرف

<رأ>

إعداد هانك الاسهم حلول (رقم 1، 2، 4، 6) وبريمكس الحل هانك (انظر الجدول مواد) ^19، ثم الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجات مئوية.

حدد العدد المطلوب من الإناث الزرد الكبار (ق) لجمع مخلب فرداني. ملاحظة: استنادا إلى الخبرة، وذلك باستخدام F1 mutagenized تتألف من سلالة الفطرية توبنغن الزرد، كان ما يقرب من 50٪ من الإناث ناضجة جنسيا "عصر" في المتوسط ​​بعد فتيلة منهم عن طريق وضعها في قفص التزاوج بين عشية وضحاها مع ذكر - أي تم الحصول على مخلب عبر الضغط الداخلي - وغالبية هذه براثن (تتراوح ما بين 70-90٪) تنتج النباتات الاحاديه قابلة للحياة. مع اثنين من الباحثين أداء إعداد فرداني، ما يقرب من 80 الكبار F1 الإناث الزرد يمكن عصره في صباح أحد الأيام. لحساب الكواشف اللازمة لفرداني التجربة، عامل في كل من معدل ضغط من الجيل F1 وعدد من الباحثين متوفرة لتنفيذ إكسبeriment. نضع في اعتبارنا أن عدد الإناث التي سوف تنتج براثن فرداني جودة عالية هو متغير للغاية، مع وجود اختلافات بين الإناث وحظ الزرد من سلالات مختلفة، والأعمار، والحمية الغذائية ^15.

إعداد أقفاص التزاوج عن طريق وضع كل الكبار الزرد الإناث مع الذكور البالغين الزرد في غرفة من الماء النظام بحيث يتم فصلهم عن طريق مقسم بين عشية وضحاها. ملاحظة: يجب أن تتعرض الإناث إلى الذكور بين عشية وضحاها لرئيس الوزراء، أو إعدادهم، لوضع البيض عن طريق الضغط.

2. تشريح الخصية

1. جعل هانك الأسهم الحل # 6 الطازجة بإضافة 0.35 غرام من بيكربونات الصوديوم إلى 10 مل من الماء المقطر. تخلط جيدا لإذابة مسحوق بيكربونات الصوديوم.
2. الجمع بين ما يلي في أنبوب على الجليد من أجل جعل الحل النهائي للعمل هانك مخزنة للنطفة: 9.9 مل من هانكس بريمكس أنا مع 100 ميكرولتر من محلول المخزون # 6.
3. تخلط جيدا، ثم قسامة 500 ميكرولتر من هانك7، ق حل العاملة النهائي في أنبوب microcentrifuge ومكان على الجليد. ملاحظة: سيتم استخدام كل ميكرولتر قسامة 500 لإعداد الحيوانات المنوية من الخصيتين من 4-5 الزرد الذكور.
4. اختر بين 4-5 الزرد الذكور لكل الحصاد الحيوانات المنوية. ملاحظة: هذا حصاد الحيوانات المنوية ما يكفي ليتم جمعها ومعالجتها، وتخزينها في أنبوب واحد microcentrifuge 1.5 مل، والتي يمكن استخدامها لتخصيب حوالي 15 براثن فرداني. تحديد الأفواج إضافية من الذكور من أجل إعداد أنابيب إضافية اعتمادا على حجم التجربة. إذا كان الزرد الذكور المختارة هي صغيرة أو تشريح الخصيتين غير مكتملة، وعادة ما سوف تكون هناك حاجة إلى 5 ذكور.
5. الموت ببطء كل ​​الذكور باستخدام شبكة لنقل بلطف السمك في طبق يحتوي على 0.2٪ تريكين لحوالي 5-6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: كن حذرا للتأكد من أن الذكور قد الموت الرحيم بشكل صحيح قبل البدء في تشريح. عادة، انتظر عدة (2-3) دقيقة بعد خياشيم السمك يتوقف عن الحركة والأسماكلم يعد يستجيب للمس.
6. اختيار الذكور تصل بلطف مع ملعقة من البلاستيك وصمة عار بعناية الجافة الذكور من السائل. المقبل، وإزالة الرأس من الذكور مع زوج من مقص حاد وثم قص شق على طول خط الوسط بطني. ملاحظة: إزالة جميع السوائل الزائدة من الأسماك ضروري لمنع التسبب تفعيل الحيوانات المنوية.
7. إزالة الأمعاء والأعضاء المرتبطة الأمعاء من تجويف البطن باستخدام ملقط غرامة ومكان في وعاء واقية للتخلص منها.
8. استخدام ملقط غرامة لإزالة الخصيتين، والتي تقع على طول جدار الجسم الظهرية، الجانبي إلى المثانة السباحة، ولها مظهر معتم الأبيض عندما ينظر إليها تحت stereomicroscope. ملاحظة: يمكن الحفاظ على الخصيتين سليمة تساعد على منع تعرض الحيوانات المنوية إلى المياه القائمة سوائل الجسم وبالتالي منع تفعيل المبكرة.
9. وضع الخصيتين في حل الحيوانات المنوية على الجليد والحفاظ على أنبوب على الجليد كما يتم تشريح الخصيتين الأخرى. كرر الخطوات من 2،6-2،9 حتى كل متم تشريح الس.
10. وضع أطر وأي الأنسجة الحيوانية المتبقية في وعاء واقية للتخلص المؤسسية المناسبة.

3. الأشعة فوق البنفسجية الحيوانات المنوية التعطيل

1. التجانس الخصيتين عن طريق طحن بلطف أنبوب microcentrifuge مع microtube مدقة العقيمة.
2. نقل طاف إلى طبق بتري صغيرة أو الزجاج ساعة على الجليد. ملاحظة: لا نقل الحطام الأنسجة مع الحل طاف. وهذا خلق الظلال وتعرض للخطر تعطيل الأشعة فوق البنفسجية من الحيوانات المنوية.
3. شطف الأنبوب مع الحيوانات المنوية بين 300-400 ميكرولتر من الحل النهائي عمل إضافية هانك (المعد في الخطوة 2.2 وتخزينها على الجليد)، وإضافة هذا يغسل طاف إلى طبق بتري صغيرة أو مشاهدة الزجاج في الخطوة 3.2.
4. فضح طبق للأشعة فوق البنفسجية من مصباح مقاعد البدلاء (254 نانومتر) ليصبح المجموع 2 دقيقة على مسافة من المصدر مصباح حوالي 15 في (38.1 سم). ملاحظة: يجب توخي الحذر عند العمل مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية وارتداء درع الوجه أومعدات الحماية الشخصية العين الأخرى.
5. العودة الطبق إلى دلو الثلج، ثم نقل الحيوانات المنوية للأشعة فوق البنفسجية المعطل لأنبوب microcentrifuge الطازجة وتخزين العينة على الجليد. ملاحظة: عند هذه النقطة سوف يكون هناك ما يقرب من 800 ميكرولتر من الأشعة فوق البنفسجية المعطل الحيوانات المنوية للإخصاب مخلب فرداني. يجب أن تبقى الحيوانات المنوية على الجليد طوال كامل مدة من الوقت الذي يقضيه في عصر الإناث. الحيوانات المنوية في لهانك الباردة يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 6 ساعة دون أي تخفيض في نتائج الإخصاب. ومن المثير للاهتمام، فقد أفاد باحثون الأخرى التي في الحيوانات المنوية لهانك الباردة قابلة للتطبيق من عدة ساعات إلى عدة أيام ^18.

4. المشتريات البيض من اسماك الزرد الكبار أنثى والإخصاب في المختبر من الفاصل

1. إعداد حمام تريكين للتخدير عن طريق الجمع بين 20 مل من 0.2٪ الأسهم تريكين مع 80 مل من الماء نظام الأسماك.
2. حدد الأنثى لجمع البيض، وذلك باستخدام شبكة لوضع لها برفق في طبق من آرicaine.
3. الانتظار لمدة 2-3 دقائق حتى يتم تخدير الأنثى والتي لم تعد تستجيب للمس. ملاحظة: إذا كان تشنجات الإناث أو يتسبب الحركات الأخرى، ويعطيها وقتا إضافيا للخضوع إلى تخدير.
4. استخدام ملعقة من البلاستيك لرفع بلطف الأنثى، الصب الحل قبل وضع الإناث على منشفة ورقية لالفتيل بعيدا السوائل الزائدة. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ترك حل اضافية على الأنثى، كما السائل من شأنه أن يؤدي تفعيل البيض قبل إضافة الحيوانات المنوية.
5. وضع الإناث في الشريحة لها في طبق بتري نظيفة وتصور بطنها تحت stereomicroscope.
6. السكتة الدماغية بطن الأنثى بلطف لحوالي 10-20 ثانية باستخدام واحد أو اثنين من أصابع من يد واحدة للضغط على البيض من بطنها، ودعم هذه الأثناء ظهر الأنثى عن طريق وضع واحد أو اثنين من أصابع من ناحية أخرى فقط وراء ظهري لها جدار الجسم. ملاحظة: عند التمسيد بطن الأنثى، ينبغي أن البيض يخرج بسهولة بالغة. إذا البيض لا تظهر الطرافةح تخفيف فمن غير المستحسن أن 'دفع أصعب' والبيض قوة من الإناث. هذا يشير إلى أن البيض ليست موجودة و / أو غير مستعدة للإخصاب، واستمر دفع يترافق مع خطر كبير من الإضرار الإناث (على سبيل المثال، انهيارا المثانة السباحة أو التسبب في إصابة داخلية أخرى قاتلة). إذا محشورة الأنثى ولكنها توفر شيء أو قليل من البيض، والعودة الأنثى إلى مرفق الحيوان. بعد 1-2 أسابيع من الراحة، وإقران الإناث مع الذكور لالتزاوج الطبيعي لتنظيف الحطام المتبقي البيض. فصل الإناث التي تتزاوج بشكل طبيعي في خزان لمدة 1-2 أسابيع أخرى من الراحة قبل محاولة أزمة ثانية. بدلا من ذلك، يمكن الإناث راحة لمدة 4 أسابيع، وهي الفترة التي يمكن إعدادها لالتزاوج الطبيعي ^15.
7. استخدام مسبار الغرامة أو ملعقة صغيرة لحلج القطن البيض من تحت الأنثى و / أو سطح بطنها.
8. رفع بلطف الأنثى والعودة بها إلى العزلة وصفت دبابة تحتوي على الماء بشكل مناسب نظام الأسماك.
9. إضافة 50 ميكرولتر من الأشعة فوق البنفسجية المعطل الحل الحيوانات المنوية إلى مخلب من البيض، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية خلال هذه الفترة، يضعوا تسمية المقابلة لطبق لتتبع ذلك مع الرقم الذي يتم تعيينه إلى الأصل الإناث.
10. إضافة 1 مل من E3 إلى البيض، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
11. إضافة حلا كافيا E3 لملء الطبق في منتصف الطريق، ووضع الأجنة عند 28 درجة مئوية لمدة الحضانة لاحقة. ملاحظة: إضافة البنسلين / الستربتوميسين (1٪ (V / V) حل القلم بكتيريا تحتوي على 5،000 وحدة البنسلين والستربتوميسين 5 ملغ لكل مل) ¹⁹ إلى E3 يمكن أن تساعد في الصحة العامة للأجنة فرداني.

5. مراقبة والتعامل مع الأجنة فرداني

1. بعد 4-8 ساعة، وإزالة الأجنة غير مخصبة من الطبق وغسل الأجنة المتبقية من خلال استبدال وسائل الإعلام الجنين E3 E3 مع الحل الطازجة. ملاحظة: سوف الأجنة غير المخصب عرض اللون الأبيض، والمظهر مبهمة أو يمكن عرض شفافppearance مع خلية واحدة ممسوخ.
2. احتضان حتى نقطة الوقت المطلوب من الفائدة، ومن ثم الاستفادة في مقايسة الشاشة المطلوب أو تطبيق البحوث الأخرى (ق).

النتائج

يمكن تنفيذها لإنتاج أجنة فرداني لتحديد الطفرات المتنحية في الجيل F2 عندما يتم الحصول على النباتات الاحاديه من الإناث الزرد الناضجة التي هي وليدة الآباء mutagenized (الشكل 1). هذا يوفر الوقت والفضاء مقارنة مع الشاشة مضاعفا التقليدية، والتي يحتاج الباحثون إلى رفع مستوى الأسر التي F2 ثم يتم تقييمها عن الظواهر ذات أهمية (الشكل 1) ذرية مضاعفا.

الخطوات الرئيسية في البروتوكول هو موضح في الخطوات 1-5 أعلاه للحصول على الأجنة الزرد فرداني من خلال التخصيب في المختبر يتم schematized بمثابة مخطط (الشكل 2). تنطوي هذه الخطوات إعداد الحلول وفتيلة من الاناث، من خلال التعرض لهرمونات الذكورة في خزانات التزاوج (يوم 1)، تليها الحيوانات المنوية والبيض والشراء في التخصيب في المختبر (يوم 2)، وأخيرا تربية من النباتات الاحاديه (3-5 أيام) (الشكل 2). عندما كومbined ومع شاشة الوراثية، وهو إجراء الطفرات شيوعا في الزرد يشمل التعرض السابقة من الذكور البالغين الزرد النوع البري إلى المغير (على سبيل المثال، إلى المغير الكيميائية مثل ENU، على الرغم من الإجراءات الأخرى، مثل فيروسات أساس الطفرات التي يمكن تنفيذها أيضا تسهيل استنساخ الخلل الكروموسومي)، تليها تربية مع نوع البرية الإناث لخلق جيل F1 mutagenized. مثل هذه الاستعدادات تتطلب عدة أشهر من العمل (حوالي 6 أشهر) على أساس مرات جيل اللازمة لأنواع البرية الخلفية، نفذ الطفرات، والخلفية اللاحقة mutagenized F1 ^15،17،22.

آخر نقطة رئيسية للنظر في توظيف النباتات الاحاديه للشاشة هو اختيار سلالة الزرد. أصبح AB * (AB نجوم) سلالة معروفة لإنتاج أجنة فرداني مع خصائص أفضل بشكل عام والصحة من السلالات الأخرى ^15. ومع ذلك، في سلالة توبنغن المستمدة لدت في مختبر لديناالمحافظين، لاحظنا في الآونة الأخيرة ميزات الجنينية التي مكنت شاشات ناجحة للشذوذ التنموية للنظام الكلوي (G. جيرلاخ وR. ينغيرت، غير منشورة). تم mutagenized الكبار الزرد توبنغن ذكور سلالة من خلال سلسلة من ثلاثة علاجات ENU، وانتقل منها إلى البرية من نوع الإناث توبنغن لإنشاء جيل F1 لفرزها. وقد تقلص الإناث F1 للحصول على البيض وكان البيض الملقحة هذه F2 مع الأشعة فوق البنفسجية المعطل الحيوانات المنوية. مقارنة براثن مضاعفا حصلت عليها التزاوج الطبيعي من النوع البري الآباء توبنغن (الشكل 3A)، الأجنة في هذه فرداني توبنغن براثن سلالة عرض أقصر، ممتلئ الجسم مميزة جذع الدولة فرداني (أرقام 3B، C). علاوة على ذلك، تتكون عادة من براثن فرداني الأشقاء الجنين الذي عرض مجموعة من العيوب، والتي لاحظنا كذلك (أرقام 3B، C)، والذي يعرف أن تختلف داخل السلالات، كما تمت مناقشته بمزيد من التفصيل أدناه ^15،17.

وقد أثبتت الدراسات السابقة سلسلة الدرجات الكنسي، المقابلة لدرجات من A إلى D، لتصنيف مجموعة من العيوب النمط الظاهري فرداني ^15،17، وبالإضافة إلى النباتات الاحاديه كما تم الإشارة إليها من حيث الصفات الجيدة والمتوسطة والفقراء جودة ^22. الصف A النباتات الاحاديه الموافق النباتات الاحاديه جودة عالية، هي الأكثر طبيعية في المظهر، مع جسم ممتلئ الجسم القصير ولكن تظهر عموما مظهر مماثل لالمورفولوجية diploids ^15،17،22 (قارن الأشقاء مضاعفا (د) إلى الصف A فرداني (المسمى A) أشقاء، الشكل 3B). فرداني الصف والأجنة أيضا تطوير ذمة التامور متواضعة، الذي هو سمة نموذجية للتنمية الزرد فرداني ^15،17،22 (الشكل 3B). بالمقارنة مع الصف والنباتات الاحاديه والمتوسطة أو ما يسمى درجة B الأجنة فرداني (B المسمى، وشخصيات 3B، C) وتتميز تطوير / twis مزيد من تقصير أو متلوىتيد الجذع، على الرغم من ملامح الرأس والذيل بشكل واضح ^15،17،22 تمييزها. أخيرا، الصف C أو سوء نوعية النباتات الاحاديه (المدرجة أيضا في بعض المراجع مثل C / D) ^15،17،22 معيبة للغاية وعرض كتلة من الخلايا غير منظم بالتعاون مع كرة من صفار (المسمى C، الشكل 3C). حتى بين نفس السلالة، براثن فرداني تختلف في توزيع الظواهر A، B، C وسوف نلاحظ أن واحدا. على سبيل المثال، ومخلب واحد من فرداني توبنغن الإناث عرض أفضل للتنمية الشاملة، مع معظمهم ألف وباء الصف ذرية فرداني (الشكل 3B) مقارنة مع النباتات الاحاديه الحصول عليها من الإناث توبنغن الثاني، الذي يتألف من العديد من الصف C نسل فرداني وكذلك القابض A والظواهر فرداني B (الشكل 3C). سلالة مماثلة من تقلب درجات الجنين فرداني لوحظت سابقا في AB AB * والأسماك وكذلك سلالة ^15.

على الرغم من هذه مورالاختلافات phological، توالد العديد من الهياكل العائدات عادة نسبيا في الجنين فرداني. على الرغم من أن لديهم أقصر الجسم الجذع، وتطوير الأجهزة مثل العينين والقلب يشبه نسبيا لأنه من نوع البرية الأجنة مضاعفا، ويمكن أيضا أنواع الخلايا مثل الخلايا الصبغية (melanophores وxanthophores) يتم تقييم ^15. بالإضافة إلى ذلك، لقد وثقت مؤخرا أن سليفة الكلوة، أو الكلى الجنينية، تم تطويرها من قبل الإخصاب آخر 1 يوم في النوع البري فرداني، على غرار diploids النوع البري. كدليل على هذا، يعرض نوع من الخلايا سليفة الكلوة الزخرفة نمط تنميط قطاعات (الشكل 4). علاوة على ذلك، النمط الظاهري من الطفرات المتنحية التي تغير وضع سليفة الكلوة، مثل طفرة ليب الذي يقلل إنتاج حمض الريتينويك، تبين وجود نمط مماثل في ولاية فرداني مقارنة الدولة مضاعفا (الشكل 4) ^23،24. هذه الملاحظة يتماشى مع ذلك من reces أخرىSIVE الطفرات التي تؤدي إلى الظواهر مماثلة في كل حالة وفرداني مضاعفا، رغم أن هذا ليس هو الحال دائما مع جميع الطفرات، وينبغي أن يوضع في الاعتبار إذا تقييم هذا النوع من استراتيجية الشاشة ^15.

وهناك عدد من الأنسجة والأعضاء وعادة ما تكون غير طبيعية في النباتات الاحاديه. على سبيل المثال، عرض النباتات الاحاديه عيوب في الدورة الدموية، واظهار عادة تجميع الدم، الأمر الذي قد يجعل قدرتهم على دراسة بعض الجوانب من تكون الأوعية محدودة ^15. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ أن النباتات الاحاديه يمكن أن يكون لها مخالفات في التنمية الأذن، بحيث يمكن تقييم للطفرات التي تحول دون تشكيل الحويصلة الأذنية تماما، ولكن ليس لالطفرات التي تؤثر على عمليات خفية تشارك مع التشكل من هذا الهيكل ^15. وكمثال آخر على ذلك، التشكل غير طبيعي في الدماغ النباتات الاحاديه، وبالتالي شاشات فرداني لتحديد مسارات التنمية الدماغ المطلوبة تقتصر ^15. على الرغم من هذه القيود، لديناnalysis التنمية الكلى في الدولة فرداني (الشكل 4) ويضيف هذا الجهاز إلى قائمة الهياكل الجنينية 'screenable'. ويبرز هذا الاستنتاج أن منهجية الشاشة فرداني يمكن استخدامها لتشريح المكونات الوراثية من السلف الكلوي الزخرفة ويضيف التركيز على الشعور بأن النهج الشاشة بارعة يمكن الالتفاف على القيود المفروضة على فرداني الجنين تطور الجنين للكشف عن نماذج متحولة جديدة وقيمة لدراسة تطوير الفقاريات ^15.

الشكل 1. تخطيطي استراتيجيات الشاشة مضاعفا وفرداني في نموذج الزرد. بعد الطفرات من جيل الآباء، ويمكن أن تثار الجيل F1 ويستخدم إما لتوليد الأسر متحولة F2 التي يتم استخدامها لفحص الجيل F3 في حالة مضاعفا (يسار ) أو الشاشة مباشرةإد في استراتيجية فرداني (يمين). في شاشة فرداني، يتم استخدام ناضجة جنسيا الإناث الجيل F1 F2 لجمع براثن فرداني للتحليل الجيني. ويتم تحديد ناقلات متخالف الإناث إذا ما يقرب من نصف النباتات الاحاديه F2 عرض النمط الظاهري متحولة (الأجنة الحمراء) بالمقارنة مع النوع البري الأشقاء فرداني (الأجنة الأصفر).

الشكل 2. فرداني الجنين إنتاج الرسم البياني. الخطوات الرئيسية لالتخصيب في المختبر لإنتاج أجنة فرداني وschematized كما المهام التي يؤديها في يوم 1 (مربعات الوردي) لإعداد حلول الحيوانات المنوية والكبار الزرد رئيس الإناث، المهام التي يؤديها في يوم 2 (صناديق البرتقال ) لجمع وتعطيل الأشعة فوق البنفسجية الحيوانات المنوية، لجمع البيض، لتخصيب البيض مع الأشعة فوق البنفسجية المعطل الحيوانات المنوية لتوليد النباتات الاحاديه، ثم لإحياء أم أنثى، وfinallذ المهام اللاحقة التي أجريت على أيام 3-5 (المربع الأصفر) عندما يتم تحضين براثن إلى نقطة الوقت المطلوب (ق) للمراقبة والتحليل.

الرقم 3. مقارنة توبنغن الأجنة الزرد سلالة مضاعفا وفرداني. أ) أنتجت أجنة مضاعف النوع البري من قبل التفريخ الطبيعي ثم حضنت حتى ما يقرب من 30 HPF باء، وأنتجت C) فرداني الأجنة النوع البري من قبل التخصيب في المختبر من براثن تم الحصول عليها من الجيل F1 الإناث mutagenized مع المعطل للأشعة فوق البنفسجية الحيوانات المنوية، وحضنت حتى ما يقرب من 30 HPF. عرضت مجموعة من النباتات الاحاديه تشوهات في التنمية مقارنة مع الأجنة مضاعفا النوع البري (السهام السوداء، د للإشارة مضاعفا). كان النباتات الاحاديه عادية نسبيا تقصير، وأكثر الأسهم الجسم مشابهة لنظام الدرجات منوA فرداني ¹⁵ (السهام الحمراء، وصفت A)، بينما النباتات الاحاديه مع تشوهات جسيمة عرضت محور الجسم اقتطاع بشدة (النصال الأرجواني، B المسمى) المقابلة لدرجة B، C وأخيرا الصف (السهام الزرقاء، وصفت C) على أساس أوصاف نشرت ^15. وقد صورت جميع الأجنة الحية في التكبير 2.5X.

الشكل 4. الزخرفة التنموي من أنواع الخلايا التي تشكل سليفة الكلوة الجنينية الجهاز الكلى في فرداني توبنغن سلالة الزرد. أنواع البرية فرداني عرض النمط الطبيعي من أنواع الخلايا في بنية الكلى الجنينية (الصف العلوي). تتكون الكلى الجنينية من زوج من وحدات وظيفية مجزأة المعروفة باسم النيفرون. يمكن تصور نمط مجزأة من أنواع الخلايا المنفصلة موجودة في النيفرون استنادا إلى جبل بأكمله التهجين الموضع نمط التعبير الجيني من النصوص التي هي فريدة من نوعها إلى أنواع الخلايا نفرون متباينة، والتي تشمل podocytes (P) تميزت wt1b وnephrin في ونبيب الملتوية القريبة (PCT) تميزت slc20a1a، نبيب الداني على التوالي (PST ) تميزت trpm7، والقاصي في وقت مبكر (DE) تميزت slc12a1، والراحل نبيب القاصي (DL) تميزت slc12a3. الأجنة ليب فرداني متحولة (الصف السفلي) عرض تخفيض podocytes، معاهدة التعاون بشأن البراءات وتغيب PST، جنبا إلى جنب مع توسيع DE والجزء DL، على غرار الأجنة ليب مضاعفا ^18. تم تصويرها الأجنة في طريقة عرض الظهرية، مع الأمامي إلى اليسار، في التكبير 10X.

Discussion

فحص فرداني هو تقنية مفيدة لاكتشاف الجينات الأساسية اللازمة لمراحل النمو المبكرة. علاوة على ذلك، تم استخدام زراعة الخلايا فرداني من الأسماك الميداكا لعزل خطوط الخلايا ES-مثل التي لديها العديد من التطبيقات البحثية والإمكانات، مما يدل على أن الخلايا فرداني قد توفر مكانا قيما المستقبل لأنواع أخرى من الفقاريات الدراسات الجينية ^20،21. يوفر هذا البروتوكول مظاهرة من أساليب المشاركة مع أداء إنتاج الأجنة الزرد فرداني من خلال التخصيب في المختبر مع الأشعة فوق البنفسجية المعطل الحيوانات المنوية. هذه المنهجية يمكن استخدامها لأداء شاشات فرداني قدما الأسماك F1 mutagenized، والتي يمكن إجراؤها باستخدام نوع البرية، المعدلة وراثيا أو سلالات متحولة للفحص محسن / القامع.

على الرغم من أن الوقت الفحص باستخدام استراتيجية فرداني هو تقصير كبير بالمقارنة مع الفحص مضاعفا، وسوف يستغرق عدة أشهر ومع ذلك لإكمال. ونحن descriسرير سابقا، هناك العديد من الفوائد التي توجد عن طريق إجراء الشاشة باستخدام مخطط فرداني، والتي يمكن أن تساعد في تقديم مساهمات الرواية إلى المعرفة الحالية حول أي عدد من الأحداث التنموية. منهجية الشاشة فرداني هو أكثر كفاءة لتحديد الأليلات المتنحية متحولة من شاشات مقرها مضاعفا، ويرجع ذلك إلى الحد من الوقت، والفضاء، وعدد من الأسماك التي يحتاجها. ومع ذلك، هناك العديد من المزالق إلى شاشة فرداني. ويمكن للشاشة فرداني فقط تحديد طفرات في الجينات التي تنشط خلال الأيام القليلة الأولى من التنمية، حيث أن الجنين يمكن البقاء على قيد الحياة فقط لفترة محدودة مع الجينوم فرداني. أن الجينات التي يتم التعبير عنها في وقت لاحق في التنمية لا بد من تحديد بطريقة مختلفة، مثل شاشة مضاعفا. أيضا، بعض الأجهزة لا تتطور بشكل صحيح في كائن فرداني. قد يكون هناك تشوهات التشريحية، أو الوقت تأخر التنمية، والتي قد تسبب الطفرة ينبغي تفويتها بواسطة تقنية الفحص فرداني. أنان بالإضافة إلى ذلك، بعض سلالات من الأسماك لا تتطور وكذلك في حالة فرداني ^15. النباتات الاحاديه يمكن تصنيفها من خلال سلسلة من الميزات الجنينية الدرجات الجيدة والمتوسطة والفقراء، مع والأجنة هي الأكثر طبيعية، B تعيين الأجنة بعيوب في المحور ولكن رئيس واضحة والذيل، وC / D لتعيين الأجنة مع التعرف الميزات (جماهير خلايا كرات فوق صفار) ^15،17. نسب الأجنة داخل هذه الفئات تختلف من سلالة الزرد، مع زيادة أعداد النباتات الاحاديه أفضل نوعية أكثر انتشارا على وجه الخصوص الخلفيات الوراثية ^15،17. نظرا لهذه العوامل، فمن الضروري إيجاد سلالة مناسبة من الزرد لأداء الطفرات والصلبان اللاحقة. في تجربتنا الأخيرة، أنتجت نوع البرية توبنغن سلالة النباتات الاحاديه قابلة للفحص (كما هو موضح في الشكلين 3 و 4) على الرغم من الباحثين الزرد تاريخيا استخدمت AB أو AB * سلالات لexperim فردانيentation ^15.

بالإضافة إلى هذه التحديات المذكورة آنفا، لن جميع الإناث الزرد الكبار معبي إنتاج القابض على أداء تقنية الضغط. على سبيل المثال، في العمل مع ENU mutagenized-توبنغن إناث السلالة، ما يقرب من نصف جميع الإناث أنتجت القابض على الضغط، وكانت بعض جزء من هذه (عادة 10-30٪) وسوء نوعية الجنين أو تعذر المخصبة. وبالتالي، لأداء شاشة فرداني لا بد من خطة لرفع مرتين على الأقل العديد من الأسماك حسب الحاجة لفحص العدد المطلوب من الجينوم (تمثل كل أنثى فحص الجينوم واحد). بغض النظر عن هذا الاعتبار، فإن فوائد أسلوب فرداني الفرز لتغطية أعداد كبيرة من الجينوم دون مرفق الحيوانية الضخمة هي في الواقع كبيرة جدا إذا كان الاختبار هو قابلة للدولة فرداني. ومع ذلك، فإنه تجدر الإشارة أيضا إلى أن دراسة أخرى من الطفرة (ق) التي تم تحديدها في مخلب فرداني وتعتمد بشكل كامل على رفع بنجاحن هجين الأباعد من مؤسس الإناث. كما هو الحال مع أي شاشة، 'يضرب' حددت في البداية أثناء عملية الفرز يجب أن يعاد تحديدها في الدولة مضاعفا.

على الرغم من مطبات باستخدام شاشة فرداني، وقد أظهرت لها أن تكون ناجحة جدا في تحديد المسوخ، والتي تم تحليلها في العمق مع المكاسب الثاقبة إلى الميدان العلمي ^15. يمكن تنفيذها شاشات فرداني للتحقيق في عمليات أخرى غير مفهومة التنمية الفقاريات. باستخدام النباتات الاحاديه للشاشات محسن والقامع هو أحد السبل لكسب مزيد من التبصر في الأنشطة والشبكة التنظيمية من الجينات في المصالح. ويمكن أيضا أن تستخدم تقنية فحص فرداني لتحديد القدرة والمكثفات من المسوخ التي تم عزلها بواسطة طرق مثل الطفرات الكيميائية أو إقحامي أو الوراثة عكس النهج مثل الحراثة أو TALENs. وباختصار، يمكن mutagenized متحولة معزولة سابقا مع ENU وفرزهم للمحسنات أو لياليuppressors من النمط الظاهري متحولة الأصلي. يجب أن تكون متحولة قادرة على الوصول إلى مراحل الكبار، ولذلك فمن الضروري أن يكون هناك حيوان أو متخالف ضعف الأسماك متحولة متماثلة اللواقح لأداء هذه الشاشة، ومع ذلك سمحت التطورات الحديثة في نقل الجينات الباحثين للالتفاف على هذه المشكلة. يمكن تعلم كيفية التعامل مع مسارات في التنمية يؤدي إلى الكثير من الاحتمالات المثيرة بما في ذلك احتمال مسارات إقلاق لعلاج الحالات المرضية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O
Hank's Premix			Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C.
Hank's Stock Solution #6			0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use.
Hank's Final working solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
XX-Series UV Bench lamp	UVP	95-0042-05	Model XX-15S Bench Lamp
XX Bench Stand (Adjustable)	UVP	18-0062-01	Model XX-15 Stand
Embryo incubation dish	Falcon	35-1005
50 X E3			250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3			Dilute 50 X E3 in distilled water
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645; SMZ1000