Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

Riepilogo

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Abstract

Il pesce zebra è diventato un modello vertebrato tradizionale che è rilevante per molte discipline di studio scientifico. Zebrafish sono particolarmente adatti per l'analisi genetica in avanti dei processi di sviluppo a causa della loro fecondazione esterna, dimensione embrionale, rapido ontogenesi e chiarezza ottica - una costellazione di tratti che consentono l'osservazione diretta degli eventi che vanno da gastrulation a organogenesi con uno stereomicroscopio di base. Inoltre, gli embrioni di zebrafish possono sopravvivere per diversi giorni in stato aploidi. La produzione di embrioni aploidi in vitro è un potente strumento per l'analisi mutazionale, in quanto consente l'identificazione delle recessivi alleli mutanti presenti nella prima generazione (F1) femmine portatrici seguenti mutagenesi nel parentale (P) generazione. Questo approccio elimina la necessità di sollevare più generazioni (F2, F3, ecc) che coinvolge allevamento di famiglie mutanti, risparmiando così il tempo ricercatore insieme a ridurrele esigenze di spazio zebrafish colonia, del lavoro e dei costi di allevamento. Sebbene zebrafish sono stati utilizzati per condurre avanti schermi per gli ultimi decenni, vi è stata una costante espansione di transgenici e genoma strumenti di editing. Questi strumenti offrono ora una pletora di modi per creare saggi sfumati per gli schermi di nuova generazione che possono essere utilizzati per analizzare ulteriormente le reti di regolazione genica che guidano vertebrati ontogenesi. Qui, descriviamo come preparare gli embrioni aploidi zebrafish. Questo protocollo può essere implementato per nuovi schermi aploidi futuri, come nelle schermate enhancer e soppressori, per affrontare i meccanismi di sviluppo per una vasta serie di processi e tessuti che si formano durante le fasi embrionali precoci.

Introduzione

I processi fondamentali che orchestrano sviluppo dei vertebrati sono ampiamente conservati ^1. Un modo efficace per identificare i geni con ruoli essenziali in sviluppo è isolare mutazioni ereditarie che portano a difetti fenotipici nel processo di interesse. Lo zebrafish, Danio rerio, è una piccola specie di acqua dolce teleostei appartenenti alla famiglia dei pesci ciprinidi che è diventato un ampiamente usato organismo modello per la genetica dello sviluppo dei vertebrati nel corso degli ultimi decenni ^2. Uova di zebrafish sono fecondate all'esterno, permettendo l'accesso al zigote fin dall'inizio della fecondazione ^3. Inoltre, l'embrione precoce è otticamente trasparente, consentendo la visualizzazione di sviluppo con un semplice stereomicroscopio ^3. Ontogenesi zebrafish è rapido, con i processi di segmentazione, gastrulazione, organogenesi e di numerose strutture, come il cuore e rene, sostanzialmente completata nell'arco del primo giorno di sviluppo ^3. Tha tempo da stadi larvali alla maturità sessuale richiede 2-3 mesi, e gli adulti sono piccoli vertebrati circa 3-4 cm di lunghezza, tanti i pesci possono essere mantenute in uno spazio minimo ^2. Inoltre, gli adulti di zebrafish hanno alta fecondità, con ogni pesce in grado di produrre diverse centinaia di embrioni a settimana ^2. Questi attributi hanno reso la trattabilità di zebrafish per la marcia avanti e indietro schermi genetiche. Zebrafish in possesso di un alto grado di conservazione nella loro anatomia, biologia cellulare, la fisiologia e con più specie di vertebrati avanzate come i mammiferi ^2,4. Infatti, recenti analisi della sequenza ha dimostrato che il genoma zebrafish contiene omologhi a quasi il 70% dei geni umani ^5. Tale conservazione ha permesso ai ricercatori di utilizzare zebrafish come modello per numerose malattie umane, tra cui sia embrionale e le condizioni di adulti ^2,4. Presi insieme, questi fattori hanno reso zebrafish un ottimo sistema per schermi volta ad individuare i geni che sonoessenziale per la normale ontogenesi vertebrati.

Un certo numero di schermi di grandi dimensioni sono state effettuate in zebrafish e hanno identificato diverse migliaia di mutazioni in geni dello sviluppo ^6-8. Il maschio adulto zebrafish è suscettibile di mutagenesi, e alterazioni cromosomiche può essere generato con frequenza relativamente alta con il etilnitrosourea mutageno chimico (ITA) ^6,7 o retrovirale mutagenesi inserzionale ^9. Ad oggi, oltre 9.000 mutazioni ereditarie sono stati creati, e comprendono geni che influenzano virtualmente tutti gli aspetti della embriogenesi. La comunità zebrafish ha istituito una banca centralizzata di questi mutanti presso il Centro Zebrafish International Resource (o Zirc) ^10, che ha raccolto circa 5.000 alleli mutanti e transgenici provenienti da tutto il mondo. Molte di queste mutazioni sono state analizzate e clonati, dando ai ricercatori attraverso discipline biologiche preziose informazioni che è stato usato per prendere in giro a parte NUMEROci vie cellulari e fisiologiche attraverso le intuizioni originarie con gli esperimenti di zebrafish.

Sebbene gli schermi a termine hanno identificato un numero impressionante di geni importanti, molto deve ancora essere apprezzato per le reti di regolazione genetica che mediano una miriade di processi. Molti schermi intraprese finora non hanno raggiunto la saturazione, e quindi avanti così come gli schermi genetici inversa sono rimasti una pietra miliare per identificare e analizzare i meccanismi dell'embriogenesi. Mentre ci sono enormi intuizioni che si può ricavare da ogni singola linea mutante zebrafish, un importante fattore limitante nel campo è stato storicamente lo sforzo che richiede tempo coinvolto nella clonazione posizionale. Per questo motivo, l'identità di molte mutazioni indotte chimicamente è rimasto un mistero. Tuttavia, con il recente avvento di interi genomi approcci di sequenziamento che facilitano la rapida clonazione ^11-14, l'identificazione incredibilmente efficiente delle mutazioni genetiche è ora feasible.

La schermata avanti prototipo in zebrafish è uno schermo diploide che può identificare mutazioni recessive entro tre generazioni ^6,7 (Figura 1, colonna a sinistra). Questa tecnica comporta mutazioni generano nelle cellule germinali del maschio parentale (P), e quindi questa accoppiamento maschio con una femmina tipo selvatico. Ciascuna delle progenie di prima generazione (F1) da questo accoppiamento si porto una o più mutazioni uniche dovute ai contributi cromosomiche del genoma paterno mutato. La progenie F1 sono sollevate e outcrossed con i tipi selvatici per creare famiglie F2. Nella famiglia F2, i fratelli saranno sia di tipo selvatico o eterozigoti, e sono incrossed casualmente per generare frizioni F3 che vengono analizzati per fenotipo (s) di interesse. Le frizioni F3 di portatori eterozigoti contengono il 25% di tipo selvatico, il 50% eterozigote, e il 25% di pesce mutante omozigote. Questo schema di screening multi-generazionale è efficace, tuttavia un grave inconveniente per questo unAPPROCCIO comprende il tempo necessario per prepararsi per il grande schermo: almeno 1 anno di solo pesce di allevamento è coinvolto, dal momento che ogni generazione richiede circa 3 mesi per raggiungere la maturità sessuale. Altre limitazioni di questo tipo di schermo diploide sono opera, spazio e costo degli alloggi queste generazioni.

Lo schermo aploide è una alternativa che può essere utilizzato per identificare e quindi isolare mutazioni recessive utilizzando strategie di mutagenesi simili ¹⁵ (Figura 1, colonna di destra). La produzione di embrioni aploidi zebrafish è stato descritto oltre 30 anni fa ^16, e la capacità del zebrafish normalmente diploide sviluppare per alcuni giorni con una cromosomico aploide ploidia è stato utilizzato per numerosi studi genetici da questo momento. Il principale vantaggio dello schermo aploide è che questo metodo non comporta sollevare le famiglie F2 al fine di schermare per recessivi alleli mutanti. Invece, le femmine generazione F1 vengono valutati pereterozigosità di mutazioni recessive nel processo di interesse esaminando loro progenie F2 in una condizione aploide (Figura 1, colonna di destra). In generale, la procedura per procurarsi embrioni aploidi sono relativamente semplici (Figura 2). Dopo la preparazione delle soluzioni necessarie per la gestione dello sperma, le uova sono ottenuti da femmine della generazione F1 dalla manipolazione manuale in modo da estrudere (o "squeeze"), le uova dalla pancia. Una volta ottenute le uova, vengono fecondati in vitro mediante esposizione a raggi ultravioletti (UV) sperma inattivato. Lo sperma inattivato UV sono incapaci di contribuire DNA praticabile per l'uovo a causa del fatto che la breve lunghezza d'onda UV reticola il DNA paterno. Tuttavia, gli spermatozoi sono ancora in grado di innescare l'attività uovo e gli eventi associati con lo sviluppo dello zigote. Dopo l'attivazione metabolica, l'uovo completerà la meiosi II, e procedere a svilupparsi con solo una copia materna depositato di ogni chromosome. A causa di questo 1N ploidia, l'embrione è soggetto alle conseguenze dello sviluppo di un allele mutante recessivo, se presente su un cromosoma materno. Così ogni frizione aploidi F2 conterrà il 50% di tipo selvatico e il 50% degli embrioni mutanti se la madre è portatrice eterozigote di un allele recessivo a penetranza completa. Questa distribuzione dei genotipi embrionali ha la relativa facilità in termini di valutazione della frizione per la presenza di fenotipo mutante (s) di interesse. Se viene rilevato un tale fenotipo, il fondatore femmina generazione F1 è successivamente outcrossed di tipo selvaggio zebrafish maschile per creare e raccogliere più portatori eterozigoti. Poiché non è necessario alzare più generazioni per eseguire lo schermo, il ricercatore può risparmiare tempo, lavoro e spazio acquario, ma ha ancora il potere di rilevare un numero significativo di genomi in base al numero di femmine F1 esaminato. Così, schermi aploidi sono particolarmente fattibili per piccoli laboratori o progetti avviati nel absence di cospicui finanziamenti.

Tuttavia, ci sono numerose limitazioni e svantaggi all'utilizzo di aploidi. In primo luogo, gli embrioni aploidi zebrafish vivono solo per alcuni giorni, e di solito muoiono tra 3 e 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) ^15. Embrioni aploidi zebrafish possono essere distinti da diploidi sulla base di alcune caratteristiche, primo fra tutti essere un corpo corto e tozzo che ha comunque il normale numero di segmenti somite ^15,17. Dato che lo sviluppo progredisce, le mostre del cervello aumento della morte cellulare e la circolazione è scarsa, di solito associati a una pozza di sangue da 2-3 dpf ed edema ^15,17. Inoltre, aploidi non riescono a gonfiare un ^15,17 vescica natatoria. Indipendentemente da queste differenze morfologiche, la maggior parte dei principali organi e tessuti sono formati, tra cui il cuore, occhio, e notochord ^15,17. Una caratteristica notato su frizioni aploidi è che essi contengono una serie di fenotipi in termini di varietà di embrioni difettosi & #8212; una caratteristica osservata in ceppi di zebrafish. Pertanto, si dovrebbe verificare se il tessuto (s) e il punto di tempo di interesse mostrano sviluppo ragionevolmente normale nel ceppo selvatico aploide e quindi potenzialmente essere valutati per difetti genetici in uno schermo o altro progetto di ricerca.

Nonostante queste sfide, schermi aploidi sono state implementate con successo per identificare i geni necessari per i processi di sviluppo anticipato in zebrafish e protocolli aploidi sono stati ben stabiliti le risorse della comunità per molti anni ^15-19. Più recentemente, il processo di generazione di embrioni aploidi pesce è stato usato dai ricercatori per creare aploide staminali embrionali (ES) colture cellulari dal pesce Medaka ^20,21. Dopo la produzione di embrioni Medaka aploidi in vitro, gli embrioni sono stati usati per derivare colture cellulari primarie che sono state fatte passare per 15 settimane, seguite da altri 5-8 settimane per generare cloni puri di cellule aploidi conProprietà delle cellule ES ^15-19. La generazione di pesce aploidi linee di cellule staminali detiene un'ampia promessa di futuro per l'analisi dei fenotipi recessivi in ​​linee cellulari vertebrati, e rappresenta un nuovo approccio per l'analisi genetica nei prossimi anni. Così, la generazione di embrioni di pesce aploidi è crescente applicazioni nella comunità di ricerca biomedica. In questo articolo video fornisce una dimostrazione visiva dei passaggi coinvolti con la produzione di aploidi embrioni di zebrafish in vitro con lo sperma-UV inattivato basato su protocolli stabiliti ^15-19,22.

Protocollo

NOTA: Le procedure per l'utilizzo di embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso l'Università di Notre Dame. NOTA: sebbene il seguente protocollo fornisce una dimostrazione di isolamento spermatozoi che coinvolge l'eutanasia dei maschi, lo sperma può essere raccolta dal poro genitale della anestetizzato vivere zebrafish di sesso maschile con pressione addominale dolce e un microcapillare per la raccolta dello sperma ^17,18. Spremitura dei maschi vivi richieda parecchi maschi per essere utilizzato al fine di raccogliere la quantità di spermatozoi equivalente che può essere ottenuto da un maschio eutanasia ^17,18. Tuttavia, i maschi che hanno subito spremitura rimangono abbastanza sani e possono essere usate per accoppiamenti naturali o successive procedure in vitro ^17. Quando possibile, le procedure scelte dovrebbero minimizzare inutile sacrificio di pesce.

1. Preparazione di soluzioni e Zebrafish Chambers affini

1. Preparare di Hank Diritti Solutions (# 1, 2, 4, 6) e Premix soluzione di Hank (vedi tabella Materials) ^19, poi autoclave e conservare a 4 ° C.
2. Selezionare il numero desiderato di sesso femminile zebrafish adulto (s) per la raccolta di frizione aploidi. NOTA: In base all'esperienza, utilizzando una F1 mutagenizzato composto innata Tübingen ceppo zebrafish, circa il 50% delle femmine sessualmente mature erano 'comprimibile', in media, dopo averli adescamento mettendoli in una gabbia di accoppiamento durante la notte con un uomo - cioè una frizione è stato ottenuto tramite la procedura di spremitura - e la maggior parte di queste frizioni (compresi tra il 70-90%) prodotta aploidi vitali. Con due ricercatori che svolgono la preparazione aploidi, circa 80 adulti di sesso femminile F1 zebrafish può essere spremuto in una mattina. Per calcolare i reattivi necessari per l'esperimento aploide, fattore sia il tasso di compressione della generazione F1 e il numero di ricercatori disponibile per eseguire l'experiment. Tenete a mente che il numero di femmine che producono frizioni aploidi di alta qualità è estremamente variabile, con differenze osservate tra le donne zebrafish di ceppi diversi, età e dieta alimentare ^15.
3. Preparare gabbie accoppiamento inserendo ogni femmina adulta zebrafish considerando un zebrafish adulto maschio in una camera di acqua sistema in modo che essi sono separati da un divisore notte. NOTA: Le femmine devono essere esposti ad una notte di sesso maschile per innescare, o li preparano, per la deposizione delle uova tramite spremitura.

2. Dissezione dei testicoli

1. Assicurarsi di Hank Soluzione Stock # 6 fresco aggiungendo 0,35 g di bicarbonato di sodio a 10 ml di acqua distillata. Mescolare bene per sciogliere la polvere di bicarbonato di sodio.
2. Combinare il seguente in una provetta in ghiaccio per rendere la soluzione di lavoro finale di Hank tamponata per lo sperma: 9,9 ml di Hanks Premix I con 100 ml di soluzione stock # 6.
3. Mescolare bene, quindi un'aliquota 500 microlitri della matassa7; s soluzione di lavoro finale in una provetta e posto sul ghiaccio. NOTA: Ogni 500 microlitri aliquota sarà utilizzato per preparare lo sperma dai testicoli di 4-5 zebrafish maschile.
4. Scegliere tra 4-5 zebrafish maschio per ogni raccolto lo sperma. NOTA: Questo raccogliere abbastanza sperma per essere raccolti, elaborati e conservati in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, che può essere utilizzato per concimare circa 15 frizioni aploidi. Selezionare altre coorti di maschi per preparare tubi aggiuntivi a seconda della scala dell'esperimento. Se il pesce zebra maschio selezionate sono o testicoli dissezione è incompleta, tipicamente saranno necessari 5 maschi.
5. Euthanize ogni maschio utilizzando una rete per trasferire delicatamente il pesce in un piatto contenente 0,2% tricaine per circa 5-6 minuti a temperatura ambiente. NOTA: prestare attenzione a garantire che il maschio sia stato correttamente eutanasia prima di iniziare la dissezione. Tipicamente, attendere alcuni (2-3) minuti dopo le branchie dei pesci smettono di muoversi e il pescenon è più sensibile al tatto.
6. Prendete il maschio delicatamente con un cucchiaio di plastica e asciugare accuratamente la secca maschile di liquido. Poi, rimuovere la testa del maschio con un paio di forbici e poi tagliare un'incisione lungo la linea mediana ventrale. NOTA: La rimozione di tutti i liquidi in eccesso dal pesce è essenziale per prevenire innescare l'attivazione dello sperma.
7. Rimuovere l'intestino e gli organi intestinali associate dalla cavità addominale utilizzando una pinza sottile e posto in un contenitore a rischio biologico per lo smaltimento.
8. Utilizzare una pinza sottile per rimuovere i testicoli, che si trovano lungo la parete dorsale del corpo, laterali alla vescica natatoria, e hanno un aspetto bianco opaco se visto con lo stereomicroscopio. NOTA: Mantenere i testicoli intatti può aiutare a prevenire l'esposizione dello sperma ai fluidi corporei a base di acqua e prevenire l'attivazione prematura così.
9. Posizionare i testicoli nella soluzione sperma su ghiaccio e mantenere il tubo in ghiaccio come le altre testicoli sono sezionati. Ripetere i passaggi 2,6-2,9 finché tutte le males sono stati sezionati.
10. Mettere le carcasse e le eventuali tessuti animali rimasti in un contenitore di rischio biologico per il corretto smaltimento istituzionale.

3. UV Sperm inattivazione

1. Omogeneizzare i testicoli dalla macinazione delicatamente la provetta con un pestello provetta sterile.
2. Trasferire il surnatante in una piccola scatola di Petri o vetro d'orologio sul ghiaccio. NOTA: Non trasferire frammenti di tessuto insieme con la soluzione surnatante. Questo creerà ombre e compromettere l'inattivazione UV di sperma.
3. Sciacquate la provetta con sperma tra 300-400 ml di soluzione di lavoro finale aggiuntivo di Hank (preparata al punto 2.2 e memorizzati su ghiaccio), e aggiungere questo lavaggio surnatante alla piccola scatola di Petri o guardare vetro nel passaggio 3.2.
4. Esporre il piatto di una lampada UV da banco (254 nm) per un totale di 2 minuti ad una distanza dalla sorgente lampada di circa 15 in (38,1 cm). NOTA: Prestare attenzione quando si lavora con una lampada UV ed indossare una maschera oaltro occhio dispositivi di protezione individuale.
5. Riportare il piatto per il secchiello del ghiaccio, quindi trasferire lo sperma inattivato UV in una provetta fresco e conservare il campione in ghiaccio. NOTA: A questo punto ci saranno circa 800 ml di UV inattivato spermatozoi per la fecondazione aploidi frizione. Lo sperma deve essere mantenuto in ghiaccio per tutta la durata del tempo speso per spremitura femmine. Sperma in freddo Hank può essere utilizzato per un massimo di 6 ore, senza alcuna riduzione nel risultato fecondazione. È interessante notare, altri ricercatori hanno riferito che lo sperma nel freddo Hank è praticabile da diverse ore a diversi giorni ^18.

4. Procurement Egg dal Zebrafish adulti femminile e fecondazione in vitro della frizione

1. Preparare bagno tricaine per l'anestesia, combinando 20 ml di 0,2% tricaine magazzino con 80 ml di acqua sistema di pesci.
2. Selezionare la femmina per la raccolta delle uova, utilizzando una rete per mettere dolcemente nel piatto di tricaine.
3. Attendere 2-3 minuti fino a quando la femmina è anestetizzato e non risponde più al tatto. NOTA: Se le contrazioni femminili o suscita altri movimenti, darle il tempo supplementare per soccombere alla anestesia.
4. Utilizzare un cucchiaio di plastica per sollevare delicatamente la femmina, la decantazione la soluzione prima di mettere la femmina su un tovagliolo di carta per favorire la via il liquido in eccesso. NOTA: Fare attenzione a non lasciare soluzione in più sulla femmina, come fluido innescherà l'attivazione uovo prima dell'aggiunta di sperma.
5. Posizionare la femmina sul suo vetrino in un piatto pulito Petri e visualizzare la sua pancia con lo stereomicroscopio.
6. Stroke pancia delicatamente la femmina per circa 10-20 sec utilizzando uno o due dita da una mano a spremere le uova dal suo addome, nel frattempo sostenendo schiena della femmina posizionando uno o due dita dell'altra mano dietro la sua parete dorsale del corpo. NOTA: Su accarezzare l'addome della femmina, le uova dovrebbero uscire molto facilmente. Se le uova non emergono with facilità non è consigliabile a 'spingere di più' e forza uova dalla femmina. Ciò indica che le uova non sono presenti e / o non è pronta per la fecondazione, e la continua spinta è associata con notevole rischio di danneggiare la femmina (ad esempio, sgonfiando la vescica natatoria o causare altre lesioni interne letali). Se una femmina è spremuto, ma fornisce nessuna o poche uova, ritorno la femmina alla struttura animale. Dopo 1-2 settimane di riposo, accoppiare la femmina con un maschio per un accoppiamento naturale per ripulire i detriti uovo residuo. Segregare le femmine che si accoppiano naturalmente in un serbatoio per altre 1-2 settimane di riposo prima di tentare una seconda compressione. In alternativa, le femmine possono essere riposati per 4 settimane, durante i quali essi possono essere impostate per accoppiamenti naturali ^15.
7. Utilizzare una multa sonda o piccola spatola per raccogliere le uova da sotto il femminile e / o la sua superficie ventre.
8. Sollevare delicatamente la femmina e il suo ritorno ad una vasca di isolamento adeguatamente etichettati contenente acqua sistema di pesce.
9. Aggiungere 50 ml di soluzione di sperma UV inattivato alla frizione delle uova, e incubare a temperatura ambiente per 30 secondi durante i quali, apporre un'etichetta corrispondente al piatto di seguirli con il numero assegnato al genitore femmina.
10. Aggiungere 1 ml di E3 alle uova, e incubare a temperatura ambiente per 1 min.
11. Aggiungere la soluzione E3 sufficiente a riempire la metà piatto, e posizionare gli embrioni a 28 ° C per la successiva incubazione. NOTA: L'aggiunta di penicillina / streptomicina (1% (v / v) pen-strep contenente 5.000 unità di penicillina e 5 mg di streptomicina per ml) ¹⁹ al E3 può aiutare nella salute generale degli embrioni aploidi.

5. Osservazione e Trattamento delle Haploid embrioni

1. Dopo 4-8 ore, rimuovere gli embrioni fecondati dal piatto e lavare i rimanenti embrioni sostituendo il materiale embrione E3 con la soluzione E3 fresca. NOTA: non fecondati gli embrioni vengono visualizzati un bianco, aspetto opaco o può visualizzare un trasparenteppearance con una singola cella deforme.
2. Incubare fino punto desiderato di interesse, e quindi utilizzare nel saggio videata desiderata o altra applicazione di ricerca (s).

Risultati

La produzione di embrioni aploidi può essere implementata per identificare mutazioni recessive nella generazione F2 quando i aploidi sono ottenuti da femmine zebrafish mature che discendono da genitori mutagenizzate (Figura 1). Ciò consente di risparmiare tempo e spazio rispetto al tradizionale schermo diploide, in cui i ricercatori hanno bisogno di formarsi una famiglia F2 cui prole diploide vengono poi valutati per fenotipi di interesse (Figura 1).

I principali passaggi del protocollo descritto nei passi sopra 1-5 per l'ottenimento di embrioni di zebrafish aploidi attraverso la fecondazione in vitro sono schematizzato come un diagramma di flusso (Figura 2). Questi passaggi prevedono la preparazione di soluzioni e di adescamento delle femmine da esposizione a ormoni maschili in vasche di accoppiamento (giorno 1), seguita da sperma e l'approvvigionamento di uova e la fecondazione in vitro (Day 2), e, infine, l'allevamento degli aploidi (giorni 3-5) (Figura 2). Quando comcombinato con uno schermo genetico, una procedura di mutagenesi comune nel zebrafish comprende precedente esposizione dei maschi adulti wild type zebrafish ad un mutageno (ad esempio, per un mutageno chimico come ENU, anche se altre procedure, come retrovirale basato mutagenesi possono essere implementate anche che facilitare la clonazione del difetto cromosomico), seguita da incroci con wild type femmine per creare una generazione F1 mutagenizzato. Tali preparati richiedono diversi mesi di lavoro (circa 6 mesi) in base ai tempi di generazione necessarie per tipi selvatici posteriori, eseguire mutagenesi, e dietro la successiva mutagenizzato F1 ^15,17,22.

Un altro punto importante per la considerazione nell'impiego aploidi per uno schermo è la scelta del ceppo zebrafish. L'AB * (AB stella) ceppo è diventato ben noto per la produzione di embrioni aploidi con migliori caratteristiche globali e la salute di altri ceppi ^15. Tuttavia, nel ceppo Tübingen derivata allevati nel nostro laboratoriostoria, abbiamo recentemente osservato caratteristiche embrionali che hanno permesso schermi di successo per le anomalie dello sviluppo del sistema renale (G. Gerlach e R. Wingert, inedito). Zebrafish adulti maschi ceppo Tubinga sono stati mutagenizzate da una serie di tre trattamenti ENU, e poi incrociati con wild type Tubinga femmine per generare una generazione F1 per lo screening. Le femmine F1 sono stati spremuti per ottenere le uova e le uova F2 sono stati fecondati con lo sperma UV inattivato. Rispetto alle frizioni diploidi ottenuti da accoppiamenti naturali di tipo selvaggio genitori Tubinga (Figura 3a), embrioni in questi aploidi frizioni ceppo Tubinga visualizzata una più breve, tozzo tronco caratteristico dello stato aploide (Figure 3B, C). Inoltre, innesti aploidi consistono tipicamente di fratelli embrione che mostrano una serie di difetti, che abbiamo osservato e (Figure 3B, C), che è noto per variare entro ceppi, come discusso più sotto ^15,17.

Studi precedenti hanno stabilito una serie di classificazione canonica, corrispondenti ai gradi da A a D, per classificare la gamma di difetti fenotipo aploidi ^15,17, e inoltre aploidi sono stati di cui in termini di aggettivi buona, intermedia e scarsa qualità ^22. Aploidi Grado A, corrispondente a aploidi di alta qualità, sono il più normale in apparenza, con un corpo corto e tozzo, ma mostrano nel complesso un aspetto morfologico simile a diploidi ^15,17,22 (confrontare i fratelli diploide (d) per aploidi grado A (etichetta A) fratelli, Figura 3B). Aploidi embrioni grado A anche sviluppare edema pericardico modesto, che è una caratteristica tipica di sviluppo zebrafish aploide ^15,17,22 (Figura 3B). In confronto a aploidi grado A, intermedio o cosiddetta grade B embrioni aploidi (con etichetta B, figure 3B, C), si distinguono per lo sviluppo di un ulteriore abbreviato o piegato / twistronco ted, anche se le caratteristiche di un testa e coda sono chiaramente distinguibili ^15,17,22. Infine, di grado C o di scarsa qualità aploidi (anche elencati alcuni riferimenti come C / D) ^15,17,22 sono estremamente difettosa e mostrano una massa disorganizzata di cellule in associazione con una palla di tuorlo (etichetta C, Figura 3C). Anche tra lo stesso ceppo, frizioni aploidi variano nella distribuzione di A, B, e C fenotipi che si osserverà. Ad esempio, la frizione aploide da una femmina Tübingen visualizzata migliore sviluppo complessivo, con soprattutto A e B di grado prole aploide (Figura 3B) rispetto al aploidi ottenuti da una seconda femmina Tübingen, la cui frizione consisteva di numerose grado C prole aploide così come A e fenotipi aploidi B (Figura 3C). Simile ceppo variabilità dei gradi di embrioni aploidi essere stata precedentemente osservata in AB e AB * ceppo pesce, nonché ^15.

Nonostante questi mordifferenze morfologiche, organogenesi di molte strutture procede relativamente normalmente nell'embrione aploidi. Anche se hanno una più breve corpo di tronco, sviluppo di organi come gli occhi ed il cuore è relativamente simile a quella di tipo selvaggio embrioni diploidi, e tipi cellulari quali cellule pigmentate (melanofore e xantofore) può anche essere valutata ^15. Inoltre, abbiamo documentato di recente che i pronephros, o embrionali renali, è sviluppato da 1 giorno dopo la fecondazione nel tipo selvaggio aploidi, analogamente a digitare diploidi selvatici. A riprova di questo, tipo pronephros cellule patterning visualizza il modello prototipico di segmenti (Figura 4). Inoltre, il fenotipo di mutazioni recessive che alterano sviluppo pronephros, come la mutazione lib che riduce la produzione di acido retinoico, mostrano un modello simile in stato aploide rispetto allo stato diploide (Figura 4) ^23,24. Questa osservazione è in linea con quello di altri recessioneSIVE mutazioni che portano a fenotipi simili sia condizione aploide e diploide, se questo non è sempre il caso con tutte le mutazioni e deve essere tenuto in considerazione se la valutazione di questo tipo di strategia schermo ^15.

Un certo numero di tessuti e organi sono tipicamente anormale aploidi. Ad esempio, aploidi mostrano difetti di circolazione, comunemente espositrici pozza di sangue, che possono rendere la loro capacità di studiare alcuni aspetti del vasculogenesis limitato ^15. Inoltre, è stato notato che aploidi possono avere irregolarità nello sviluppo dell'orecchio, tale da poter essere valutati per mutazioni che impediscono la formazione vescicola otica interamente, ma non per le mutazioni che influenzano processi sottili coinvolti morfogenesi di questa struttura ^15. Come altro esempio di questo, la morfogenesi del cervello è anormale in aploidi, e, quindi, schermi aploidi per identificare i necessari percorsi di sviluppo del cervello sono limitate ^15. Nonostante questi limiti, il nostro unnalisi di sviluppo renale allo stato aploide (Figura 4) aggiunge questo organo per l'elenco delle strutture embrionali 'screenable. Questa scoperta mette in evidenza che una metodologia schermo aploidi può essere utilizzato per analizzare le componenti genetiche di progenitore renale patterning e aggiunge enfasi al sentimento che gli approcci schermo geniale possono aggirare le limitazioni di aploidi embrione ontogenesi per scoprire preziosi nuovi modelli mutanti per studiare lo sviluppo dei vertebrati ^15.

Figura 1. Schema di strategie schermo diploidi e aploidi nel modello zebrafish. Seguito mutagenesi della generazione parentale, la generazione F1 può essere sollevato e utilizzato sia per generare F2 famiglie mutanti che vengono utilizzati per schermare la generazione F3 in uno stato diploide (sinistra ) o direttamente a schermoEd in una strategia aploide (a destra). In una schermata aploidi, le femmine sessualmente maturi generazione F1 vengono utilizzati per raccogliere frizioni F2 aploidi per l'analisi genetica. Portatori eterozigoti femminili sono identificati se circa la metà degli aploidi F2 visualizzare un fenotipo mutante (embrioni rosso) rispetto ai fratelli aploidi wild type (embrioni giallo).

Figura 2. Haploid embrione produzione diagramma di flusso. Le principali fasi della fecondazione in vitro per la produzione di embrioni aploidi sono schematizzato come compiti eseguiti su Day 1 (scatole rosa) per preparare le soluzioni di sperma e prime femmine adulte di zebrafish, compiti svolti il giorno 2 (scatole arancioni ) per raccogliere e inattivare UV sperma, a raccogliere le uova, per fertilizzare le uova con UV inattivato sperma per generare aploidi, e quindi di far rivivere la madre femmina, e finallcompiti y eseguiti su successive Giorni 3-5 (scatola gialla) quando gli innesti vengono incubate al punto di tempo desiderato (s) per l'osservazione e l'analisi.

Figura 3. Confronto tra Tübingen embrioni diploidi e aploidi ceppo zebrafish. A) diploidi tipo embrioni selvatici sono stati prodotti da riproduzione naturale e quindi incubate fino a circa 30 HPF. B, C) ​​aploidi embrioni wild type sono stati prodotti con la fecondazione in vitro di frizioni ottenuti dalla generazione F1 femmine mutagenizzate con lo sperma-UV inattivato, e incubate fino circa 30 hpf. Aploidi esposti una serie di anomalie nello sviluppo rispetto a embrioni diploidi wild type (frecce nere, d per indicare diploide). Aploidi relativamente normali avevano accorciato, il resto dello stock corpo analogo al sistema di classificazione diA un aploide ¹⁵ (frecce rosse, etichettati A), mentre aploidi con gravi anomalie esposte ad un asse del corpo gravemente troncati (punte di freccia viola, etichettato B) corrispondente a un grado di B, e, infine, di grado C (punte di freccia blu, C etichettato) basate su descrizioni pubblicate ^15. Tutti gli embrioni sono stati fotografati dal vivo con un ingrandimento 2.5X.

Figura 4. Patterning dello sviluppo di tipi di cellule che compongono il pronephros embrionale organo rene in aploide Tübingen ceppo zebrafish. Tipi selvatici aploidi visualizzato un normale modello di tipi di cellule nella struttura rene embrionale (riga in alto). Il rene embrionale costituito da una coppia di unità funzionali segmentati conosciuti come nefroni. Il modello segmentato di tipi di cellule presenti in discrete nefroni può essere visualizzata basato su tutto il monte ibridazione in situ pattern di espressione dei trascritti genici che sono unici per i tipi di cellule differenziate nefrone, che comprendono le podocytes (P) contrassegnati da wt1b e nefrina, tubulo contorto prossimale (PCT) segnato dalla slc20a1a, il tubulo prossimale dritto (PST ) segnato dalla TRPM7, distale precoce (DE) segnato da SLC12A1, e il tubulo distale tardiva (DL), segnati da SLC12A3. lib embrioni mutanti aploidi (podocytes fila in basso) mostra una riduzione, PCT e PST assente, insieme con DE espanso e segmento DL, simile a diploidi embrioni lib ^18. Gli embrioni sono stati fotografati in una vista dorsale, con anteriore a fianco, con un ingrandimento 10X.

Discussione

Lo screening aploide è una tecnica utile per scoprire geni essenziali necessari per le fasi precoci dello sviluppo. Inoltre, la coltura di cellule aploidi dal pesce Medaka è stato usato per isolare linee di cellule ES-simili che hanno numerose applicazioni di ricerca e potenziale, dimostrando che le cellule aploidi possono fornire un luogo prezioso futuro per altri tipi di studi genetici vertebrati ^20,21. Questo protocollo fornisce una dimostrazione dei metodi coinvolti eseguire la produzione di embrioni aploidi zebrafish attraverso la fecondazione in vitro con lo sperma UV inattivato. Questa metodologia può essere utilizzato per eseguire le schermate avanti aploidi con pesce F1 mutagenizzato, che può essere fatta usando wild type, transgenici o ceppi mutanti per lo screening enhancer / soppressore.

Anche se il tempo di screening utilizzando una strategia aploidi è notevolmente ridotto rispetto allo screening diploide, sarà comunque necessari diversi mesi per completare. Come abbiamo Descriletto in precedenza, ci sono molti vantaggi che esistono eseguendo uno schermo mediante uno schema aploide, ognuno dei quali può aiutare a fare nuovi contributi alla conoscenza attuale su qualsiasi numero di eventi di sviluppo. La metodologia schermo aploide è più efficiente per l'identificazione di alleli mutanti recessivi rispetto agli schermi diploidi basata causa della riduzione del tempo, lo spazio, e il numero di pesci che sono necessari. Tuttavia, ci sono diverse insidie ​​di uno schermo aploidi. Uno schermo haploid può identificare solo mutanti in geni che sono attivi entro i primi giorni di sviluppo, come l'embrione può sopravvivere solo per un tempo limitato con un genoma aploide. Geni che sono espressi successivamente in sviluppo dovranno essere identificati da un metodo diverso, come uno schermo diploide. Inoltre, alcuni organi non si sviluppano correttamente in un organismo aploide. Ci possono essere anomalie anatomiche, o un tempo di ritardo di sviluppo, che possono causare la mutazione da non perdere con la tecnica di screening aploidi. Ion Inoltre, alcuni ceppi di pesce non sviluppano così in una condizione aploide ^15. Aploidi possono essere classificati da una serie di buoni classificazione, intermedi e poveri caratteristiche embrionali, con A embrioni è il più normale, B per designare gli embrioni con difetti di asse, ma la mente lucida e la coda, e C / D per designare gli embrioni con irriconoscibili caratteristiche (masse di cellule in cima palle tuorlo) ^15,17. Le proporzioni di embrioni all'interno di queste categorie varia da ceppo zebrafish, con aumento del numero di migliore qualità aploidi più prevalenti in particolare background genetico ^15,17. A causa di questi fattori, è necessario trovare un giusto ceppo di zebrafish effettuare la mutagenesi e croci successivi. Nella nostra recente esperienza, il tipo selvatico Tübingen ceppo prodotta aploidi vitali per lo screening (come mostrato nelle figure 3 e 4) se i ricercatori storicamente zebrafish hanno utilizzato l'AB o AB * ceppi per sperim aploidisentazione ^15.

Oltre a questi problemi citati in precedenza, non tutte le femmine zebrafish adulto innescati produrranno una frizione upon eseguire la tecnica di spremitura. Ad esempio, nel lavoro con ENU-mutagenizzate femmine deformazione Tubinga, circa la metà di tutte le donne ha prodotto una frizione su spremitura, e una frazione di questi (tipicamente 10-30%) erano scarsa qualità embrione o non è stato fecondato. Quindi, effettuare una schermata aploide bisogna pianificare per raccogliere almeno doppio dei pesci come necessario per schermare il numero desiderato di genomi (ogni femmina rappresenta uno genoma proiettato). Indipendentemente da questa considerazione, i vantaggi del metodo di screening di aploide a coprire un gran numero di genomi senza stabulario massiccia sono effettivamente abbastanza significativo se il saggio è riconducibile allo stato aploide. Tuttavia, va anche notato che l'ulteriore studio della mutazione (s) identificato nella frizione aploide è completamente dipendente dalle sollevando successo unn out-cross dal fondatore femminile. Come con qualsiasi schermo, 'colpi' inizialmente individuate durante il processo di screening devono essere nuovamente identificati nello stato diploide.

Nonostante le insidie ​​di utilizzare lo schermo aploidi, ha dimostrato di essere molto efficace per identificare mutanti, che sono state analizzate in profondità con guadagni penetranti al campo scientifico ^15. Schermi aploidi possono essere implementate per studiare altri processi poco conosciute di sviluppo dei vertebrati. Utilizzando aploidi per schermi enhancer e soppressori è un modo per ottenere un quadro più chiaro delle attività e la rete di regolamentazione di un gene di interesse. La tecnica di screening aploide può anche essere utilizzato per identificare esaltatori e soppressori di mutanti che sono già stati isolati con metodi quali la mutagenesi inserzionale o chimica o genetica inversa approcci come tecniche di lavorazione oppure Talens. In breve, il mutante in precedenza isolato può essere mutagenizzato con ENU e screening per esaltatori o suppressors del fenotipo mutante originale. Il mutante deve essere in grado di raggiungere stadi adulti, quindi è necessario avere un animale eterozigote o un debole omozigote mutante pesce effettuare questa schermata, tuttavia recenti progressi nella transgenesi hanno permesso ai ricercatori di gonna questo problema. Imparare a manipolare percorsi di sviluppo può portare a molte possibilità interessanti, tra cui la prospettiva di percorsi perturbanti per il trattamento di stati di malattia.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O
Hank's Premix			Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C.
Hank's Stock Solution #6			0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use.
Hank's Final working solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
XX-Series UV Bench lamp	UVP	95-0042-05	Model XX-15S Bench Lamp
XX Bench Stand (Adjustable)	UVP	18-0062-01	Model XX-15 Stand
Embryo incubation dish	Falcon	35-1005
50 X E3			250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3			Dilute 50 X E3 in distilled water
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645; SMZ1000