فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

Summary

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Abstract

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Introduction

وتشمل المجمعات SNF2 الكروماتين الأسرة على إعادة عرض مثل SNF2 المركزية أتباز فرعية ^1،2. ATPases بعض الوظائف مثل SNF2 كإنزيمات فرعية واحدة، في حين يعمل آخرون مثل الوحيدات الحفاز من أكبر المجمعات متعددة فرعية. توضيح الآليات الجزيئية التي فيها كل من مفارز الكروماتين تساهم المجمعات إعادة عرض لأنشطتها يتطلب القدرة على أداء فحوصات البيوكيميائية التي تشريح عملية التجديد.

إعادة عرض النيوكليوسومات ATP التي تعتمد من قبل مجمع INO80 البشري وغيرها من لونين إعادة عرض الانزيمات يمكن تصوره على أنه عملية متعددة الخطوات التي تبدأ مع ملزمة للانزيم إعادة عرض لnucleosomes، تليها تفعيل DNA- و / أو النيوكليوسومات التي تعتمد أتباز، إزفاء للانزيم إعادة عرض على الحمض النووي nucleosomal، وإعادة تموضع في نهاية المطاف nucleosomes ^1،2. فهم التفاصيل الجزيئية لعملية إعادة عرض الكروماتين ص تعتمد على ATPequires تشريح للتفاعل إعادة عرض في خطواتها الفردية وتعريف بمساهمات مفارز الفردية للمجمع لونين إعادة عرض لكل خطوة من خطوات التفاعل. مثل هذه التحليلات تتطلب القدرة على تحليل إعادة النيوكليوسومات وغيرها من الأنشطة باستخدام ركائز الجزيئية المحددة في المختبر.

في البروتوكول إن الرب السابق، وصفنا الإجراءات المستخدمة لتوليد INO80 المجمعات إعادة عرض الكروماتين وsubcomplexes مع مكونات فرعية محددة ^3. هنا، نقدم ثلاثة فحوصات البيوكيميائية التي تمكن التحليل الكمي للالنيوكليوسومات ملزمة، DNA- والنيوكليوسومات تنشيط أتباز، وأنشطة إعادة النيوكليوسومات المرتبطة بهذه المجمعات.

Protocol

1. ATP-تعتمد النيوكليوسومات إعادة عرض فحوصات

لقياس ATP-تعتمد الأنشطة النيوكليوسومات إعادة عرض، immunopurified INO80 أو يتم تحضين subcomplexes INO80 مع ATP والركيزة mononucleosomal، الذي يحتوي على جسيم نووي واحد المتمركزة على واحدة من نهاية جزء DNA-BP 216، وصفت ^P-32. ثم يتعرضون المنتجات رد فعل الكهربائي في المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأصلية.

1. لتوليد ف المسمى "601" جزء DNA ^32، تضخيم من pGEM-3Z-601 ⁴ جزء DNA 216 BP تحتوي على 601 تسلسل المواقع النيوكليوسومات-وضع نهاية، وذلك باستخدام [أليغنوكليوتيد 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG و5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG و إلى الأمام وعكس الاشعال.
   1. انشاء 100 ميكرولتر PCR رد فعل كما هو موضح في الجدول 1.
   2. إجراء تفاعلات PCR في cycler الحرارية باستخدام البرنامج التالي: 1 دقيقة في 96 درجة مئوية، واتباعها!د بنسبة 45 ثانية في 94 درجة مئوية، و 30 ثانية في 57 ° C، 60 ثانية عند 72 درجة مئوية لمدة 30 دورات. تنتهي مع 7 دقائق عند 72 درجة مئوية.
   3. بعد الانتهاء من رد فعل PCR، وإزالة النيوكليوتيدات الفردية عن طريق تمرير المنتجات رد فعل مرتين من خلال الأعمدة تدور nuclease خالية.
   4. تشغيل 5 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى في 1.2٪ هلام الاغاروز للتأكد من أن رد فعل PCR إنشاء المطلوب ~ 216 DNA بي بي شظية.
   5. تمييع 5 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى 20 أضعاف، وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. ومتوسط ​​العائد هو ~ 40 نانوغرام / ميكرولتر.
   6. قياس النشاط الإشعاعي من 1 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى في عداد التلألؤ. تقدير كفاءة التوسيم عن طريق حساب الكلفة لكل ألف / نانوغرام. ومن المتوقع أن تسفر ~ 15،000 نسخة في الدقيقة / 601 نانوغرام من الحمض النووي جزء رد فعل التوسيم الناجح.
2. نقل nucleosomes خلية هيلا على 601 المسمى DNA باستخدام طريقة التخفيف المتسلسل ^5.
   1. مزيج من 2 بمول³² 601 شظية مع الحمض النووي المسمى P 6 ميكروغرام من nucleosomes هيلا (المعد كما هو موضح ⁵⁾ في 50 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 1.0 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، 0.1 ملي PMSF، و1 ملم DTT واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. بالتتابع تمييع الخليط إلى 0.8 M، M 0.6، و 0.4 M كلوريد الصوديوم عن طريق التخفيف مع 12.5 ميكرولتر، ميكرولتر 20.8، و 41.6 ميكرولتر، على التوالي، من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 1 ملم EDTA، 0.1 ملي PMSF، و 1 ملم DTT، مع الحضانة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية بعد كل تخفيف.
   3. وعلاوة على ذلك تمييع الخليط إلى 0.2 M ثم إلى 0.1 M كلوريد الصوديوم عن طريق إضافة 125 ميكرولتر ثم 250 ميكرولتر من نفس العازلة التي تحتوي على 0.1٪ Nonidet P-40، 20٪ الجلسرين، و 200 ميكروغرام / مل BSA، مع الحضانة 30 دقيقة في 30 ° C بين الأخيرين التخفيفات. تخزين الركيزة mononucleosome في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
3. أداء النيوكليوسومات انزلاق ردود الفعل ATP-تعتمد في الحجم الإجمالي من 10 ميكرولتر. الجرميةوترد المكونات ction في الجدول 2. منذ تركيز كلوريد الصوديوم الأمثل لINO80 النشاط النيوكليوسومات إعادة عرض هو ~ 50 مم كلوريد الصوديوم (نتائج غير منشورة)، وضبط التركيز الكلي من كلوريد الصوديوم في كل رد فعل ل50 ملم، مع الأخذ في الاعتبار كمية كلوريد الصوديوم الواردة في استعدادات nucleosomes والانزيم.
   1. قبل البدء في إعداد المقايسات، ويلقي المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأم (18 × 16 سم). لإعداد جيل واحد يحتوي على 5٪ الأكريلاميد (الأكريلاميد: bisacrylamide 37.5: 1)، TBE 0.5X (45 ملي تريس بورات، 1 ملم EDTA)، 0.01٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS)، و 0.001٪ N، N، N'، N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)، خلط المكونات المدرجة في الجدول 3. السماح لهلام تتبلمر لا يقل عن 2 ساعة على RT.
   2. وفي الوقت نفسه، لكل رد فعل يتعين القيام بها، والجمع في قبل المبردة صلكنزد أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ~ 20 نانومتر INO80 أو INO80 subcomplex (المعد كما هو موضح ³⁾ مع كمية من العازلة EB100 ( الجدول 4) كافية لإعطاء حجم 4.75 ميكرولتر. على الفور إعادة تجميد أي المتبقية الكسور التي تحتوي على INO80 في الثلج الجاف المجفف أو النيتروجين السائل.
   3. انشاء كوكتيل رئيسية مع بقية المكونات، وزيادة بعامل 'X' (حيث X = العدد الكلي للتفاعلات +3). يتم سرد كمية كل عنصر اللازمة لواحد رد فعل 10 ميكرولتر في الجدول 5. يجب تحجيمها وصفة تصل وفقا لعدد من التفاعلات التي يتعين القيام بها. مزيج جيد من خلال الاستفادة من أنبوب أو عن طريق pipetting صعودا وهبوطا مع Pipetman وتدور الأنبوب لبضع ثوان في microcentrifuge الفوق.
   4. الاستغناء 5.25 ميكرولتر من الكوكتيل رئيسية لكل من أنابيب رد فعل بإعدادها في الخطوة 1.3.2. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. بدء التفاعلات عن طريق نقل أنابيب رد الفعل إلى 30 ° C الحرارة أو كتلة ماء الحمام واحتضان لمدة 2 ساعة.
   5. وفي الوقت نفسه، وإعداد "إزالة مزيج" كوكتيل تحتوي على الحمض النووي منافسوnucleosomes، التحجيم من قبل عامل X (X = العدد الكلي للتفاعلات + 4). يتم سرد كمية كل عنصر اللازمة لإعداد 1.5 ميكرولتر إزالة مزيج لفعل واحد في الجدول 6؛ يجب تحجيمها وصفة يصل اعتمادا على عدد من المقايسات التي يتعين القيام بها.
   6. إنهاء ردود الفعل بإضافة 1.5 ميكرولتر من مزيج إزالة. تخلط جيدا، وتدور إلى أسفل، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
   7. وفي الوقت نفسه، قبل تشغيل هلام بولي أكريلاميد الأصلي في وحدة الكهربائي العمودي في 100 فولت لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وذلك باستخدام 0.5X TBE كما يعمل عازلة مع شريط مغناطيسي داخل مجلس النواب للحفاظ على دوران مستمر عازلة.
   8. لتحميل عينة، إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغ تحميل تحتوي على TBE 3X، و 30٪ الجلسرين، 0.25٪ برموفينول الأزرق، و 0.25٪ الزيلين Cyanol FF. تخلط جيدا، وتدور لفترة وجيزة العينات، وتحميلها على هلام باستخدام نصائح تحميل.
   9. تشغيل هلام في 200 V ل 4.5 ساعة في 4 درجات مئوية مع دوران العازلة.
   10. للكشف عن إشارة، ونقل هلام إلى كومة من ورقتين من ورق الترشيح. التفاف ورقة الترشيح مع هلام على رأس باستخدام التفاف البلاستيك الشفاف، ثم تعريضها إلى شاشة تخزين الفوسفور في 4 درجة مئوية لمدة الوقت المطلوب.
   11. مسح الشاشة مع نظام الماسح الضوئي التصوير النظير وتحليل البيانات باستخدام البرمجيات المناسبة.

2. Mononucleosome ملزم فحوصات

لفحص تقارب ملزم من مجمع INO80 نظرا لmononucleosomes، إجراء التحول الكهربي التنقل الفحص (EMSA) باستخدام الركيزة mononucleosomal إنشاؤها في الخطوة 1.2.

1. إعداد رد فعل يمزج لفحوصات ملزمة كما هو موضح لفحوصات إعادة النيوكليوسومات لكن حذفت ATP وإزالة مزيج من التفاعلات؛ احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغ لتحميل كل خليط التفاعل، وتنطبق على هلام بولي أكريلاميد الأصلية التي تحتوي على مادة الأكريلاميد 3.5٪ (الأكريلاميد: مكرر 37.5: 1)، 1٪ الجلسرين، TBE 0.5X، 0.01٪ APS، و 0.001٪ TEMED.
3. باستخدام 0.5X TBE كما يعمل العازلة، تشغيل هلام في 200 V 2.5 ساعة في 4 درجات مئوية مع دوران العازلة وفضح إلى شاشة تخزين الفوسفور.

3. DNA- والنيوكليوسومات التي تعتمد على فحوصات أتباز

إجراء فحوصات أتباز في مخاليط رد فعل 5 ميكرولتر تحتوي على 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 60 مم كلوريد الصوديوم، 6.6 ملم MgCl _2، 0.8 ملي EDTA، 0.015٪ Nonidet P-40، 2.5٪ الجلسرين، 0.1 ملغ / مل BSA، 1 ملي DTT، 0.1 ملي PMSF، 2 مم ATP، 2 μCi من [α- ³² P] ATP (3،000 تسى / ملمول). لكل مجمع INO80 أو كمية مجمع INO80 أن يعاير إقامة ثلاثة ردود فعل موازية، واحدة تحتوي على عازلة EB100 لقياس DNA- أو جسيم نووي مستقل أتباز، واحدة تحتوي على الحمض النووي بلازميد دائرية مغلقة (5،000 نقطة أساس، ~ 30 نانومتر) لقياس DNA- أتباز المعالين، واحدة تحتوي على هيلا oligonucleosomes (~ 185 نانومتر) لقياس النيوكليوسومات التي تعتمد أتباز. إعداد كافة ردود الفعل على الجليد.

لكل رد فعل، والجمع بين 10-50 نانومتر من INO80 أو INO80 subcomplexes immunopurified مع مبلغ EB100 عازلة كافية لإعطاء حجم 2.2 ميكرولتر في مرحلة ما قبل المبردة مشحم 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. على الفور إعادة تجميد أي الكسور التي تحتوي على INO80 في الثلج الجاف المجفف أو النيتروجين السائل.

انشاء كوكتيل الرئيسي. يتم سرد كمية كل عنصر اللازمة لفعل واحد في الجدول 7. توسيع نطاق صفة من خلال زيادة بمعامل 3 (X + 2) +1، حيث X = عدد الاستعدادات INO80 أن يعاير.

لإعداد تحتوي العازلة "المولوتوف الفرعية" فقط، DNA، أو nucleosomes، الاستغناء 2.5 (X + 2) ميكرولتر من الكوكتيل الماجستير في ثلاثة أنابيب منفصلة. إضافة 0.3 (X + 2) ميكرولتر من EB100 إما مغلقة DNA البلازميد دائري (1.5 ميكروغرام / ميكرولتر)، أو هيلا oligonucleosomes (1.5 ميكروغرام / ميكرولتر) وتخلط جيدا.

الاستغناء 2.8 ميكرولتر من الكوكتيل الفرعي المناسب للأنابيب رد فعل تحتوي على الانزيم الذي أنشئ في الحادي وEP 3.1. ماصة بلطف صعودا وهبوطا إلى المزيج؛ تجنب إدخال فقاعات.

لبدء التفاعلات، نقل أنابيب رد الفعل إلى 30 ° C كتلة الحرارة.

بعد 5، 15، 30، و 60 دقيقة من الحضانة، بقعة 0.5 ميكرولتر من كل خليط التفاعل اللوني في الصعود إلى طبقة السليلوز polyethyleneimine رقيقة (TLC) لوحة (20 × 10 سم) في خط مستقيم 1.5 سم على الأقل من الحافة السفلى . العودة فورا أنابيب رد فعل على 30 ° C الحرارة كتلة يمكن أن تؤخذ نقاط زمنية متعددة لذلك من أنبوب واحد. بعد اكتشاف، تجف لوحات TLC باستخدام مجفف ضربة.

نقل لوحات TLC إلى غرفة زجاجية تحتوي على ما يكفي 0.375 فوسفات البوتاسيوم M (3.5 درجة الحموضة) للسماح لل0.5 سم السفلى من لوحة TLC إلى أن يغطس في الحل.

تغطية الغرفة، ووضع حتى أمام الطور السائل تصل إلى الجزء العلوي من لوحات TLC. الفورية الجافة لوحات بدقة باستخدام مجفف ضربة.

فضح لوحات TLC المجففة إلى شاشة الفوسفور التخزين في RT.مسح الشاشة مع نظام الماسح الضوئي التصوير النظائر وتحديد مقدار المشعة الركيزة ATP والمنتجات ADP.

لحساب كمية ATP تحلل، مضاعفة ATP تحلل٪ من كمية ATP موجودة في بدء خليط التفاعل باستخدام الصيغة التالية: بمول تحلل ATP = 10 ATP بمول في بدء رد فعل خ [ADP / (ATP + ADP)]

النتائج

وتشير الأرقام نتائج ممثلة من فحوصات البيوكيميائية المستخدمة لتوصيف الأنشطة INO80، بما في ذلك النيوكليوسومات انزلاق (الشكل 1) وملزمة (الشكل 2) المقايسات وDNA- أو المقايسات أتباز تعتمد على النيوكليوسومات (الشكل 3).

Discussion

لضمان إعادة النيوكليوسومات والأنشطة أتباز نلاحظ في المقايسات تعتمد على النشاط التحفيزي المجمعات INO80، وليس على إعادة تلويث و / أو الأنزيمات أتباز، فإننا النيوكليوسومات الفحص بشكل روتيني ويعيد النشاط أتباز من الإصدارات نشطة حفاز المجمعات INO80، طهروا في بالتوازي مع ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR reaction buffer	Roche Applied Science	11435094001
Roche Taq DNA Polymerase	Roche Applied Science	11435094001
NucAway Nuclease-free Spin Columns	Ambion	Cat. # AM10070
ultrapure ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
bovine serum albumin	Sigma	A9418
40% Acrylamide/Bis 37.5:1	Amresco	0254-500ML
Sonicated salmon sperm DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10% ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonase	Novagen	Cat. No. 70664
dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertical electrophoresis unit	Hoefer	SE600X-15-1.5
lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes	Costar	3207
Storage Phosphor Screen	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM filter paper	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant software	GE Healthcare	ver2003.02
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe	Biodex	Model 14C