מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Summary

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Abstract

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Introduction

מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 כוללים מקטע ATPase מרכזי כמו ^SNF2-1,2. פונקציה מסוימת כמו SNF2-ATPases כאנזימים למקטע אחד, בעוד שאחרים לתפקד כמקטע קטליטי של מתחמים רב למקטע גדולים יותר. הבהרת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו כל אחד מיחידות המשנה של הכרומטין מתחמי שיפוץ לתרום לפעילויות שלהם דורש את היכולת לבצע מבחני ביוכימיים שלנתח את תהליך שיפוץ.

שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP על ידי מורכב INO80 האנושי ואנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים יכול להיות שחזה כתהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של אנזים שיפוץ לnucleosomes, ואחרי הפעלה של דנ"א ו / או ATPase הנוקלאוזום תלוי, טרנסלוקציה של אנזים שיפוץ על DNA nucleosomal, ומיצוב מחדש סופו של הדבר nucleosomes ^1,2. הבנת הפרטים המולקולריים של r תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATPequires נתיחה של תגובת שיפוץ לשלבים הבודדים שלה והגדרתה של תרומתם של יחידות משנה נפרדות של מתחם שיפוץ הכרומטין לכל צעד של התגובה. ניתוח מסוג זה דורש היכולת לנתח שיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות אחרות באמצעות מצעים מולקולריים מוגדרים במבחנה.

בפרוטוקול יופיטר קודם, שתארנו תהליכים המשמשים ליצירת מתחמי INO80 שיפוץ הכרומטין וsubcomplexes עם יצירות למקטע מוגדרים ^3. כאן, אנו מציגים שלושה מבחני ביוכימיים שיאפשר ניתוח כמותי של הנוקלאוזום המחייב, דנ"א וATPase מופעל הנוקלאוזום, ופעילויות שיפוץ הנוקלאוזום הקשורים למתחמים כאלה.

Protocol

מבחני Remodeling הנוקלאוזום .1 תלוי ATP

כדי למדוד ATP תלוי פעילויות הנוקלאוזום שיפוץ, immunopurified INO80 או subcomplexes INO80 מודגרת עם ATP ומצע mononucleosomal, המכיל הנוקלאוזום יחיד ממוקם בקצה אחד של קטע DNA 216-BP, שכותרתו-P ^32. תוצרי התגובה לאחר מכן נתון לאלקטרופורזה בג'ל פולי-acrylamide ילידים.

1. על מנת ליצור את, בר ³² שכותרתו P '601' DNA, להגביר מpGEM-3Z-601 ⁴ שבר 216 נ"ב DNA המכיל 601 רצף מיצוב הנוקלאוזום מיקום סוף, באמצעות oligonucleotides 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG ו5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG כ קדימה ולאחור פריימרים.
   1. הגדר את תגובת PCR 100 μl כפי שמתואר בטבלה 1.
   2. לבצע PCR התגובות בCycler תרמית באמצעות התכנית הבאה: 1 דקות ב96 מעלות צלזיוס, followeד על ידי 45 שניות על 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב57 ° C, 60 שניות ב72 מעלות צלזיוס במשך 30 מחזורים; כלה ב7 דקות ב72 מעלות צלזיוס.
   3. לאחר תגובת PCR נגמרה, להסיר את נוקלאוטידים מאוגדים על ידי העברת תוצרי התגובה פעמיים באמצעות עמודות ספין nuclease חינם.
   4. לרוץ 5 μl של מוצר PCR המטוהר בagarose ג'ל 1.2% כדי לאשר שתגובת PCR שנוצרה קטע DNA נ"ב הרצוי ~ 216.
   5. לדלל 5 μl של מוצר PCR המטוהר פי 20, ולמדוד את ריכוז DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. התשואה הממוצעת היא ~ 40 ng / μl.
   6. מדוד את הרדיואקטיביות של 1 μl של מוצר PCR המטוהר במונה נצנץ. להעריך את יעילות התיוג על ידי חישוב עותקים לדקה / ng. תגובת תיוג מוצלחת צפויה להניב ~ 15,000 עותקים לדקה / ng של 601 קטע DNA.
2. העבר את nucleosomes תא הלה על DNA 601 שכותרתו באמצעות שיטת דילול סדרתי ^5.
   1. לערבב 2 pmol של³² קטע DNA 601 עם כותרת P 6 מיקרוגרם של nucleosomes הלה (שהוכן כמתואר ⁵⁾ ב50 μl של מאגר המכיל 1.0 M NaCl, 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 מ"מ PMSF, ו1 מ"מ DTT ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
   2. רצף לדלל את התערובת ל0.8 M, 0.6 M, ו0.4 M NaCl על ידי דילול עם 12.5 μl, 20.8 μl, ו41.6 μl, בהתאמה, של 10 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 מ"מ PMSF, ו 1 מ"מ DTT, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס לאחר כל דילול.
   3. יתר על כן לדלל את התערובת ל0.2 M ולאחר מכן ל0.1 M NaCl על ידי תוספת של 125 μl ולאחר מכן 250 μl מאותו המאגר המכיל 0.1% Nonidet P-40, גליצרול 20%, ו200 מיקרוגרם / מ"ל ​​BSA, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס בין שני דילולים הסופיים. אחסן את מצע mononucleosome ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
3. לבצע תגובות הנוקלאוזום הזזה ATP תלויות בנפח כולל של 10 μl. המחשבהרכיבי ction מפורטים בטבלה 2. מאז ריכוז NaCl האופטימלי לפעילות שיפוץ הנוקלאוזום INO80 הוא ~ 50 mM NaCl (תוצאות לא פורסמו), להתאים את הריכוז הכולל של NaCl בכל תגובה ל50 מ"מ, תוך לקיחה בחשבון את כמות NaCl הכלולה ב הכנות של nucleosomes ואנזים.
   1. לפני שיתחיל בלהגדיר את מבחני, להטיל ג'לי פולי-acrylamide ילידים (18 x 16 סנטימטר). כדי להכין ג'ל יחיד המכיל 5% acrylamide (acrylamide: bisacrylamide 37.5: 1), TBE 0.5x (45 borate מ"מ טריס, 1 mM EDTA), 0.01% persulfate אמוניום (APS), ו0.001% N, N, N', -tetramethylethylenediamine N'(TEMED), לערבב את החומרים המפורטים בטבלה 3. אפשר ג'ל לפלמר לפחות שעה 2 ב RT.
   2. בינתיים, לכל תגובה שיש לבצע, לשלב בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge מראש צונן siliconized ~ 20 ננומטר INO80 או subcomplex INO80 (שהוכן כמתואר ³⁾ עם סכום של חיץ EB100 ( לוח 4) מספיק כדי לתת נפח של 4.75 μl. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 שנותרו בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי.
   3. הגדר את קוקטייל הורים עם שאר החומרים, גמלון בפקטור של "X" (כאשר X = מספר כולל של תגובות +3). הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובת 10 μl בודדת מופיע בטבלה 5; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר של תגובות שיש לבצע. מערבבים היטב על ידי הקשה על הצינור או על ידי pipetting למעלה ולמטה עם Pipetman ולסובב את הצינור לכמה שניות בmicrocentrifuge המעבדתיים.
   4. לוותר 5.25 μl של קוקטייל האדון לכל אחד מצינורות התגובה הוקמו בצעד 1.3.2. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. התחל את התגובות על ידי העברת צינורות תגובה לאמבטית גוש חום C 30 מעלות או מים ודגירה עבור שעה 2.
   5. בינתיים, להכין את 'הסרת לערבב' קוקטייל המכיל DNA מתחרהוnucleosomes, גמלון בפקטור של X (X = מספר הכולל של תגובות + 4). הסכום של כל מרכיב הדרוש כדי להכין 1.5 μl הסרת תערובת לתגובה יחידה מופיע בלוח 6; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר מבחני שיש לבצע.
   6. לסיים תגובות על ידי הוספת 1.5 μl של תמהיל הסרת. מערבבים היטב, ספין למטה, ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות.
   7. בינתיים, לפני לרוץ ג'ל polyacrylamide הילידים ביחידת אלקטרופורזה אנכית ב100 V ל30 דקות ב 4 ° C, באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל עם בר ומערבב מגנטי בתוך החדר התחתון כדי לשמור על זרימת דם למאגר קבועה.
   8. כדי לטעון את המדגם, להוסיף 2.5 μl של טעינת צבע המכיל 3x TBE, גליצרול 30%, 0.25% כחול bromophenol, ו0.25% Cyanol FF קסילן. מערבבים היטב, ספין בקצרה הדגימות, ולהעמיס אותו על ג'ל באמצעות עצות לטעינה.
   9. הפעל את הג'ל על 200 V ל4.5 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ.
   10. כדי לזהות את האות, להעביר את הג'ל לערימה של שני גיליונות של נייר סינון. לעטוף את נייר הסינון עם ג'ל על גבי באמצעות ניילון נצמד ברור, ולאחר מכן לחשוף אותו למסך זרחן האחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי.
   11. סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה.

2 מבחני כריכת Mononucleosome

לassay הזיקה המחייבת של מורכב INO80 ניתנו לmononucleosomes, לבצע Shift electrophoretic ניידות Assay (Emsa) באמצעות מצע mononucleosomal שנוצר בשלב 1.2.

1. הגדר את תגובת תערובות לכריכה מבחני כפי שתואר עבור מבחני שיפוץ הנוקלאוזום אבל להשמיט ATP ותמהיל הסרת מהתגובות; לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
2. הוסף 2.5 μl של טעינת צבע לכל תערובת תגובה, ותחול על ג'ל polyacrylamide ילידים המכיל 3.5 acrylamide% (acrylamide: bis 31), 1% גליצרול, TBE 0.5x, APS 0.01%, ו0.001% TEMED: 7.5.
3. באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל, הפעל את הג'ל על 200 V ל2.5 שעה על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ ולחשוף למסך זרחן האחסון.

.3 דנ"א והנוקלאוזום תלוי מבחני ATPase

לבצע מבחני ATPase בתערובות תגובת 5 μl מכילות 20 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 60 mM NaCl, 6.6 מ"מ MgCl _2, 0.8 mM EDTA, 0.015% Nonidet P-40, גליצרול 2.5%, 0.1 מ"ג / מ"ל BSA, 1 מ"מ DTT, 0.1 מ"מ PMSF, 2 מ"מ ATP, 2 μCi של [P ³² α-] ATP (3,000 Ci / mmol). עבור כל מורכב INO80 או כמות מורכבת INO80 להיות assayed הקים שלוש תגובות מקבילות, חיץ EB100 מכיל אחד למדוד דנ"א או הנוקלאוזום עצמאי ATPase, אחד מכיל סגורות פלסמיד דנ"א העגול (נ"ב 5,000, ~ 30 ננומטר) כדי למדוד דנ"א ATPase תלוי, ואחד המכיל oligonucleosomes הלה (~ 185 ננומטר) כדי למדוד ATPase הנוקלאוזום תלוי. הגדר את כל התגובות על קרח.

1. עבור כל תגובה, לשלב 10-50 ננומטר של subcomplexes INO80 או INO80 immunopurified עם סכום של חיץ EB100 מספיק כדי לתת נפח של 2.2 μl ב1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge משומן מראש צונן. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי.
2. הגדר את הקוקטייל שני. הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובה יחידה מופיע בלוח 7. בהיקף של עד המתכון לפי קנה מידה על ידי גורם של 3 (X + 2) +1, כאשר X = מספר הכנות INO80 להיות assayed.
3. כדי להכין מאגר המכיל 'משנה הקוקטיילים' בלבד, DNA, או nucleosomes, לוותר 2.5 (X + 2) μl של קוקטייל האב לשלושה צינורות נפרדים. הוספת 0.3 (X + 2) μl של שתי EB100, DNA הסגור המעגלי פלסמיד (1.5 מיקרוגרם / μl), או (1.5 מיקרוגרם / μl) oligonucleosomes הלה ומערבבים היטב.
4. לוותר 2.8 μl של תת הקוקטייל המתאים לצינורות תגובה המכיל אנזים שהוקמו בstep 3.1. פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב; למנוע החדרת בועות.
5. כדי להתחיל את תגובות, להעביר את צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות.
6. לאחר 5, 15, 30, ו60 דקות של דגירה, לזהות 0.5 μl של כל תערובת תגובה על כרומטוגרפיה שכבה דקה polyethyleneimine תאית צלחת (TLC) (20 x 10 סנטימטר) בקו ישר לפחות 1.5 ס"מ מהקצה התחתון . מייד לחזור צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות ניתן לקחת נקודות זמן כל כך רבות מצינור אחד. אחרי שהבחנתי ב, לייבש את צלחות TLC באמצעות מכת מייבש.
7. העבר את צלחות TLC לתא זכוכית המכיל מספיק פוספט 0.375 M אשלגן (pH 3.5) כדי לאפשר 0.5 סנטימטר תחתית צלחת TLC להיות שקוע בפתרון.
8. כסה את התא, ולפתח עד החלק הקדמי של השלב הנוזלי מגיע העליון של צלחות TLC. מיידי לייבש את הצלחות באמצעות מכת מייבש ביסודיות.
9. לחשוף את צלחות TLC המיובשים למסך זרחני אחסון ב RT.סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולקבוע את סכום מצע ATP רדיואקטיבי לבין מוצר ADP.
10. כדי לחשב את הסכום של ATP הידרוליזה, להכפיל את ATP% הידרוליזה על ידי הכמות של הווה ATP בתערובת התגובה החל שימוש בנוסחה הבאה: ATP pmol הידרוליזה ATP pmol = 10 במתחילים x תגובה [ADP / (ATP + ADP)]

תוצאות

הנתונים מראים תוצאות נציג של מבחני ביוכימיים משמשים כדי לאפיין פעילויות INO80, כוללים הנוקלאוזום הזזה (איור 1) ומחייב (איור 2) מבחני ודנ"א או מבחני הנוקלאוזום תלוי ATPase (איור 3).

הניסוי שמוצג באיור 1

Discussion

כדי להבטיח ששיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות ATPase שאנו רואים במבחנים תלויים בפעילות הקטליטית של מתחמי INO80, ולא על זיהום ו / או אנזימי ATPase שיפוץ, אנו הנוקלאוזום באופן שגרתי assay שיפוץ ופעילות ATPase של גרסאות כקטליזאטור פעילים של מתחמי INO80, מטוהר ב במקביל עם הסוג בר INO80 תוך שימוש ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR reaction buffer	Roche Applied Science	11435094001
Roche Taq DNA Polymerase	Roche Applied Science	11435094001
NucAway Nuclease-free Spin Columns	Ambion	Cat. # AM10070
ultrapure ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
bovine serum albumin	Sigma	A9418
40% Acrylamide/Bis 37.5:1	Amresco	0254-500ML
Sonicated salmon sperm DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10% ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonase	Novagen	Cat. No. 70664
dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertical electrophoresis unit	Hoefer	SE600X-15-1.5
lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes	Costar	3207
Storage Phosphor Screen	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM filter paper	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant software	GE Healthcare	ver2003.02
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe	Biodex	Model 14C