عزل بالسكان خلية متميزة من المخيخ تطوير من تسليخ مجهري

Summary

الأسلاف، معربا عن Nestin هي التي تم تشخيصها حديثا من السكان الأسلاف العصبية في المخيخ النامية. باستخدام تقنية تسليخ مجهري المقدمة هنا في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية، ويمكن تنقية هذا السكان الخلية مع عدم وجود تلوث من المناطق الأخرى للدماغ ويمكن تربيتها لمزيد من الدراسات.

Abstract

تسليخ مجهري هو أسلوب الرواية التي يمكن عزل مناطق معينة من الأنسجة وإزالة التلوث من مصادر الخلوية في المناطق المجاورة. وقد استخدمت هذه الطريقة لأول مرة في دراسة Nestin، معربا عن الأسلاف (NEPS)، يبلغ عدد سكانها التي تم تشخيصها حديثا من الخلايا في الطبقة الخارجية للدماغ جرثومي (EGL). باستخدام تسليخ مجهري في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، تم جمع السكان نقية من NEPS بشكل منفصل عن التقليدية السلائف الحبيبية الخلايا العصبية في EGL من تلويث وخلايا Nestin، معربا عن الأخرى في المخيخ. دون تسليخ مجهري، والتحليلات الوظيفية للNEPS لم يكن ممكنا مع الأساليب المتاحة حاليا، مثل التدرج Percoll الطرد المركزي والقبض على الليزر تسليخ مجهري. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية للاستخدام مع الأنسجة المختلفة التي تحتوي إما مناطق معروفة أو خلايا fluorescently المسمى. الأهم من ذلك، الميزة الرئيسية لهذا microdissectioن الأسلوب هو أن الخلايا المعزولة يعيشون ويمكن تربيتها لمزيد من التجارب، وهو حاليا غير ممكن مع الأساليب المذكورة الأخرى.

Introduction

يتكون المخيخ من طبقات خلايا متعددة، تحتوي على كل أنواع الخلايا متميزة. خلال التنمية، وEGL يحتوي المتكاثرة السلائف الحبيبية الخلايا العصبية (الناتج القومي الإجمالي) في حين أن طبقة طبقة الجزيئية والعصبية تحتوي على بيرجمان الدبقية والخلايا العصبية، على التوالي. في عمق المخيخ تكمن المادة البيضاء، والذي يحتوي على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) و oligodendrocytes ^1.

القنفذ الصوتي (شش) يلعب دورا حاسما في تنظيم وتطوير المخيخ على وجه الخصوص، أنه يعزز انتشار الناتج القومي الإجمالي عن طريق ملزمة لمستقبله مرقع (PTC)، منظم السلبي للشش يشير ^2-4. تفعيل الشاذة من شش الإشارات يولد نخاعي (MB)، ورم خبيث في الدماغ الأكثر شيوعا في الأطفال ^5،6.

المؤسسة العامة للاتصالات MB متحولة نماذج الماوس المعدلة وراثيا هي أدوات قوية لدراسة MB وتطوير الأورام تشبه MB ^7،8 البشري. باستخدام هذهالفئران، تم اكتشاف أن الناتج القومي الإجمالي هي خلايا المنشأ للالقنفذ من نوع MB ^7. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى الناتج القومي الإجمالي، حددنا مؤخرا السكان فريد من الأسلاف العصبية داخل EGL من المخيخ النامية التي يمكن أن تؤدي إلى MB. هذه الخلايا التعبير عن مستويات عالية من النوع السادس بروتين خيوط وسيطة، Nestin، وصفته NEPS ^9. وتقع NEPS داخل الجزء العميق من EGL وجود عابر فقط خلال تطوير المخيخ الولدان. انهم ملتزمون النسب الخلية الحبيبية حيث الناتج القومي الإجمالي ولكنها متميزة كما هي هادئة ولا تعبر Math1، علامة راسخة لالناتج القومي الإجمالي التقليدية ^10. بالإضافة إلى ذلك، NEPS تثير MB أكثر كفاءة من الناتج القومي الإجمالي بعد تفعيل شش ⁹ إشارات الطريق، مما يجعلها أصل الرواية لMB تكون الأورام.

نحن معزولة سابقا NEPS من EGL المخيخ في يوم ما بعد الولادة 4 (P4) بواسطة تقنية تسليخ مجهريالموصوفة هنا ^9. تسليخ مجهري عبر التصور المجهري المباشر من الأنسجة يسمح للتشريح محدد من EGL المخيخ. وهذا أمر ضروري كما يعبر Nestin أيضا NSCs في المادة البيضاء للدماغ وبيرجمان الدبقية في طبقة الجزيئية ^1،7،11،12 وكان من الأهمية بمكان أن هذه الخلايا لم تدرج، لأنها نخلط التحليل. خلايا معزولة عن الأنسجة microdissected يمكن استخدامها على الفور للتحليل الجزيئي أو أنها يمكن تربيتها لمزيد من التطبيقات.

للمساعدة في microdissecting تحديدا EGL، ومواصلة تنقية NEPS، وقد عبرت Math1-GFP (ببروتين أخضر) الفئران مع Nestin-CFP (سماوي البروتين الفلوري) الفئران. عامل النسخ يتم التعبير Math1 تحديدا من الناتج القومي الإجمالي وGFP التعبير مرئيا بوضوح في EGL ^9،13. الفئران Nestin-CFP تعبر عن شكل النووي الحراجية ويمكن تصور بسهولة في طبقة الجزيئية ^9،14. معا، وGFP CFP التعبير خلق الحدود للتسليخ مجهري من EGL (انظر الشكل 1). تم NEPS CFP إيجابية ثم عزل من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية، في أعقاب تفكك الأنزيمية للEGLs تشريح.

حاليا، الأسلوب الأكثر استخداما جيدا لعزل الخلايا من EGL هو Percoll الطرد المركزي التدرج من الأنسجة دماغ كامل ^15،16. هذه الطريقة، ومع ذلك، غير قادر على أن تستبعد كليا السكان الخلية Nestin + من الطبقة الجزيئية والمادة البيضاء، وبالتالي لا يمكن استخدامها لدراسة NEPS. القبض على الليزر تسليخ مجهري، والذي يستخدم نقل طاقة الليزر لإزالة الخلايا من الفائدة، هو طريقة أخرى تستخدم لعزل خلايا معينة داخل الأنسجة غير المتجانسة ^17،18 ولكن يمكن فقط أن تستخدم الخلايا والقبض لاسترداد DNA، RNA والبروتين وليس قادرة على أن تكون مثقف.

يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل وحيا، والسكان نقية من NEPS من EGL على وجه التحديد.ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لأنواع الأنسجة المختلفة التي إما بنية تشريحية أو التعرف fluorescently المسمى خلايا / المناطق. ولذلك، فإن الميزة الرئيسية لدمج هذه التقنية الجديدة في تسليخ مجهري بروتوكولات العزل الخلية أن الخلايا يمكن أن تكون معزولة من مناطق الأنسجة محددة للقضاء على تلوث الأنسجة المجاورة والخلايا يمكن جمعها فورا للتحليل أو مثقف لتطبيقات أخرى.

Protocol

وقد تم تنفيذ استخدام الحيوانات في هذا البروتوكول وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة مركز سرطان رعاية الحيوان واستخدام فوكس تشيس.

1. إعداد الآلات، حلول، وCoverslips

1. نظيفة مجموعتين من # 5 ملقط غرامة، مجموعة واحدة من رقم 7 ملقط المنحنية الجميلة، واحدة كبيرة مقص جراحي، مقص microdissecting واحدة، ملعقة واحدة وملعقة مثقوبة واحد. وضع الصكوك في الحقيبة التعقيم الختم الذاتي والأوتوكلاف. إبقاء الأدوات في الحقيبة حتى جاهزة للاستخدام.
2. إعداد 3٪ درجة حرارة انصهار منخفضة الحل الاغاروز.
   1. إضافة 1.5 غرام الاغاروز في 50 مل من العقيمة Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) ثم وضع في الميكروويف والحرارة حتى تظهر فقاعات. وقد حل قارورة دوامة ويسخن حتى كل الاغاروز. مزيج حل مع بقضيب قبل التدفئة إذا ظهرت كتل.
   2. مخزن حل في 37 ° C حمام الماء لحين الحاجة إليها.
   3. لstorag على المدى الطويلالإلكترونية، وتخزين الحل الاغاروز لاستخدامها في المستقبل في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجة مئوية لمدة أشهر. يسخن في الميكروويف لتسييل. لتسخين المتكررة من الحل الاغاروز، وزن القارورة قبل تسخين للحفاظ على الوزن الأولي بالماء المقطر المعقم الدافئ.
3. إعداد الحلول التالية للغراء التفكك القائم على خلية كما هو موضح سابقا ^2:
   1. والحل مع غراء غراء (100 U / مل)، السيستين (0.2 ملغ / مل) والدناز (250 U / مل) في الفينول الأحمر العقيمة التي تحتوي DPBS.
   2. حل مخاطاني البيض مع ألبومين المصل البقري (BSA و 8 ملغ / مل)، فول الصويا مثبط التربسين (8 ملغ / مل)) والدناز (250 U / مل) في العقيمة التي تحتوي على الفينول الأحمر DPBS.
      فلتر تعقيم كل من الحلول وضبط درجة الحموضة للعودة اللون الأصلي من الفينول التي تحتوي الأحمر DPBS.
4. تعد وسائل الإعلام ثقافة الخلية (ملحوظة / B27): استكمال وسائل الاعلام القاعدية مع 1 ملي البيروفات الصوديوم، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين الستربتوميسين (P / S) وB27 الملحق. Filteص تعقيم وحماية من الضوء. تتوازن وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ قبل الاستخدام.
5. إعداد عازلة FACS: 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) في DPBS. إضافة 2.5 مل FBS إلى 47.5 مل DPBS.
6. إعداد بولي-D-يسين (PDL) coverslips -coated.
   1. الأوتوكلاف coverslips الزجاج جديدة.
   2. معطف لل coverslips مع PDL (100 ميكروغرام / مل في الماء المقطر المعقم)، واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
   3. غسل coverslips مع الماء المقطر المعقم. يغسل مرة واحدة مع ملاحظة / B27 سائل الإعلام. دعونا coverslips تجف تماما في الأنسجة الثقافة غطاء محرك السيارة قبل استخدامها.

2. تشريح وإعداد شرائح الأنسجة

1. في يوم تشريح، مسح أسفل منطقة تشريح مع الايثانول 70٪ والغطاء مع وسادة ماصة.
2. إزالة أدوات تشريح من الحقيبة التعقيم. إضافة الجليد الباردة، DPBS العقيمة / 1٪ P / S لطبق بيتري صغير ومكان على الجليد.
3. قطع رأس P4 Math1-GFP / Nestin-CFP الجراء الفأر مع مقص جراحي كبيرة ثم تمسك الرأس إلى أسفل مع ملقط المنحنية الجميلة. إزالة الجلد وقشر بلطف بعيدا الجمجمة مع # 5 ملقط غرامة ثم مغرفة من الدماغ من الجمجمة باستخدام ملعقة وتحويلها إلى طبق بتري تحتوي DPBS / 1٪ P / S.
   1. باستخدام # 5 ملقط غرامة، بعناية فصل المخيخ عن بقية الدماغ. تأكد من تشريح الجرو في وقت واحد في أسرع وقت ممكن.
   2. جمع ما لا يقل عن 8 مخيخات من أجل الحصول على ما يكفي من NEPS للالتحليلات الجزيئية والوظيفية.
4. ملء القالب تضمين قياس 2 × 2 × 2 سم 3٪ مع انخفاض درجة حرارة انصهار الحل الاغاروز. تأكد من أن درجة حرارة الاغاروز لا تتجاوز 37 درجة مئوية.
5. إزالة السائل الزائد من المخيخ بواسطة اللمس بلطف على الأنسجة المختبر. وضع المخيخ في القالب في وضع عمودي. وضع القالب على الجليد لتمكينه من ترسيخ بسرعة. استخدام ~ 4 مخيخات لكل كتلة.
6. الحصول لىأقسام الأنسجة فينج مع تهتز شفرة vibratome. تقليم التي تحتوي على مخيخات كتلة الاغاروز بشفرة حلاقة. الغراء كتلة agarose إلى لوحة vibratome مع مخيخات الموجهة في وضع عمودي.
7. ملء علبة من vibratome مع الجليد الباردة DPBS العقيمة / 1٪ P / S ومكان تحت الجليد.
   1. قطع 600 ميكرون من خلال أقسام طول كل من المخيخ. جمع المقاطع من علبة الجليد باستخدام ملعقة مثقوبة. أقسام مكان في طبق بتري مليئة DPBS / 1٪ P / S على الجليد.

3. تسليخ مجهري والتفكك خلية

1. وضع طبق بتري تحتوي على شرائح الأنسجة تحت المجهر الفلورسنت تشريح.
   1. فصل بعناية EGL عن بقية القسم المخيخ باستخدام ملقط غرامة من قبل في تشريح بين CFP + طبقة الجزيئية وGFP + EGL (يرجى الرجوع إلى الخط المنقط في الشكل 1). كن حذرا حتى لا يتضمن أي جزء من طبقة الجزيئية، الأمر الذي سيؤدي فيتلوث، معربا عن Nestin بيرجمان الدبقية.
   2. إتمام هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن والحفاظ على الأنسجة على الجليد لتجنب موت الخلية.
   3. إزالة الأنسجة المحيطة الاغاروز قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
2. هضم الأنسجة EGL microdissected باستخدام بروتوكول القائم على غراء كما هو موضح سابقا ² للحصول على تعليق خلية واحدة.
   1. إعادة تعليق الخلايا في عازلة نظام مراقبة الأصول الميدانية لجمع الخلايا CFP إيجابية عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية.

4. خلية الفرز والتصفيحات

1. نوع خلايا لمضان CFP باستخدام معقم، وارتفاع سرعة تدفق عداد الكريات التي تحتوي على عامل تصفية الحراجية المناسبة وجمع الخلايا في المخزن FACS على الجليد. الحصول على ما يقرب من 100،000 NEPS من كل المخيخ P4.
2. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. استخدام خلايا فورا للتحليل الجزيئي أو ثقافة لمزيد من التجارب.
3. إلى خلايا الثقافة، واعادة تعليق الخلايا في مرحلة ما قبل تحسنت NB / B27 موالقانونين لوحة coverslips على PDL المغلفة كما سبق وصفه ^2.

النتائج

كما هو مبين في الشكل 1A، تم إعداد شرائح من دماغ P4 Math1-GFP / الفئران Nestin-CFP، الذي سيطر على EGL المخيخ من الناتج القومي الإجمالي، معربا عن GFP وإثراء طبقة الجزيئية الخلايا الدبقية CFP إيجابية. لعزل NEPS التي تقع في الجزء العميق من EGL، تم microdissected بين شرائح EGL وطبقة ...

Discussion

طريقة تسليخ مجهري الموصوفة هنا هو الإجراء الأول قادرا على عزل السكان نقية من الخلايا الحية لاستخدامها في التحليلات الجزيئية والوظيفية. كما يتبين من لي وآخرون. ^9، NEPS التي حصلت عليها هذه الطريقة يمكن تربيتها ودمجها في التجارب المختلفة وبسبب نقاء عالية...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal media	Gibco	21103-049
PDL	Millipore	A-003-E
Ultra pure low melting temperature agarose	Invitrogen	16520-050
DPBS	Gibco	14190144