Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu

Özet

Nestin-salgılayan progenitorlar gelişen beyincikte nöronal progenitörlerinin yeni tespit edilen bir gruptur. Floresan-aktive edilmiş hücre sıralama ile kombinasyon halinde burada sunulan mikrodiseksiyon tekniği kullanarak, bu hücre popülasyonu, diğer beyincik bölgelerinin herhangi bir bulaşma ile saflaştırılabilir ve daha ileri araştırmalar için kültürlenebilir.

Özet

Mikrodisseksiyon bir doku spesifik bölgelerini izole ve komşu bölgelerde hücresel kaynaklardan kirlenmeyi ortadan kaldırabilir yeni bir tekniktir. Bu yöntem, ilk çalışmada kullanılmıştır Nestin salgılayan progenitorlar (döküntüler), serebellar dış germinal tabakadan (EGL) hücrelerin yeni tespit edilen bir popülasyon. Floresan-aktive edilmiş hücre tasnifi (FACS) ile kombinasyon halinde kullanılması mikrodiseksiyon, neps saf nüfus serebellumda EGL geleneksel granül nöron habercilerden ve diğer kirletici Nestin salgılayan hücrelerin ayrı olarak toplanmıştır. Mikrodiseksiyonu olmadan, NEP'lerin fonksiyonel analizleri gibi Percoll santrifüj ve lazer yakalama mikrodiseksiyon olarak kullanılabilir mevcut yöntemleri ile mümkün olmazdı. Bu teknik aynı zamanda tanınan bölgeleri veya floresan ile etiketlenmiş ya da hücreleri içeren çeşitli dokularda kullanılmak için de uygulanabilir. Bu microdissectio en önemlisi büyük bir avantajdırn, teknik izole edilmiş canlı hücreler ve başka tarif edilen yöntemler ile mümkün değil ayrıca deney için kültürlenebilir olmasıdır.

Giriş

Beyincik, çok hücreli bir katman, her biri farklı hücre tiplerinde meydana gelir. Moleküler tabaka ve purkinje katman sırasıyla Bergmann glia ve purkinje nöronları içeren ise gelişme sırasında, EGL granül nöron öncüleri (kişi başına milli geliri) çoğalan içerir. Beyincik içinde derin nöral kök hücreler (NSC'lerde) ve oligodendrositleri ¹ içeren beyaz madde, yatıyor.

Sonic dikenli proteini (Shh) serebellar gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı ve özellikle de, kendi reseptörü olan yamalı (PTC), Shh, ^2-4, sinyal bir negatif düzenleyicisi bağlanarak kişi başına milli geliri çoğalmasını teşvik eder. Sus sinyal anormal aktivasyonunun Medulloblastom (MB), çocuklarda ^5,6 en sık görülen kötü huylu beyin tümörü oluşturur.

Ptc mutant MB transgenik fare modelleri MB çalışma için güçlü araçlar vardır ve insan MB ^7,8 benzeyen tümörler gelişebilir. Kullanarak bufarenin, bu kişi başına milli geliri kirpi tipi MB ⁷ kökenli hücre olduğu keşfedildi. Ayrıca, ek olarak kişi başına milli geliri, yakın zamanda da MB ortaya çıkmasına neden olabilir gelişen beyincikte de EGL içinde nöronal progenitörlerin benzersiz bir popülasyonu tespit ettik. Bu hücreler, tip VI filaman protein Nestin yüksek seviyelerde ifade etmek ve NEP ⁹ olarak adlandırılır. NEP EGL derin bölümü içinde yer alan ve sadece yenidoğan serebellar gelişme sırasında geçici olarak mevcut olurlar. Onlar kişi başına milli geliri olarak granül hücre soyu kararlıdır ama onlar sakin ve Math1, konvansiyonel kişi başına milli geliri ¹⁰ köklü bir işaretleyici ifade yok gibi farklıdır edilmektedir. Buna ek olarak, NEP onları MB tümörogenez için yeni bir kökeni yapar Şşş sinyal yolunun ⁹ aktivasyonu sonrası MB yol daha verimli kişi başına milli geliri verir.

Biz daha önce mikrodisseksiyon tekniği ile doğum sonrası 4. günde (P4) de serebellar EGL gelen NEPS izoleburada ⁹ nitelendirdi. Dokunun direkt mikroskopik ile mikrodiseksiyon serebellar EGL belirli diseksiyon sağlar. Nestin da serebellar beyaz cevher ve moleküler tabaka ^1,7,11,12 Bergmann glia ile NSC'lerde ifade ve analizleri etkileyebilecek gibi o, bu hücreler dahil edilmemesi çok önemliydi gibi bu gereklidir. Microdissected dokudan izole edilen hücreler moleküler analiz için hemen kullanılabilir ya da daha fazla uygulama için kültürlenebilir.

Özellikle EGL Microdissecting yardımcı olmak için ve daha fazla nepler arıtmak için Math1-GFP (yeşil floresan protein) farenin Nestin-CFP (mavi floresan protein) fareler ile çaprazlandı. Math1 spesifik kişi başına milli geliri ve GFP ifadesi ile anlatılmak istenen, transkripsiyon faktörü EGL ^9,13 açıkça görülebilir. Nestin-CFP farenin CFP nükleer şeklinde ifade ve kolayca moleküler tabakanın ^9,14 olarak görselleştirilebilir. Birlikte, GFP ve CFP ifade EGL mikrodiseksiyonu için sınırlarını oluşturmak (Şekil 1). CFP pozitif NEP daha sonra kesilmiş EGLs enzimatik ayrışma sonrasında, FACS ile izole edilmiştir.

Şu anda, EGL hücreleri izole etmek için en çok kullanılan yöntem, tüm beyincik dokusuna ^15,16 Percoll gradient santrifüjleme. Ancak bu metot, tam olarak moleküler tabakanın beyaz maddeden Nestin + hücre popülasyonlarının dahil yapamaz ve dolayısıyla neps çalışma için kullanılamaz. Ilgi hücreleri çıkarmak için lazer enerjisinin transferini kullanan lazer yakalama mikrodiseksiyon, heterojen bir doku ^17,18 içinde belirli hücreleri izole etmek için kullanılabilir, ancak yakalanan hücreleri sadece DNA, RNA ve proteinin geri kazanılması için kullanılan ve değildir başka bir yöntemdir edebilmek yetiştiriciliğine.

Bu protokol, özellikle EGL gelen NEP'lerin bir canlı, saf bir nüfusunu yalıtmak için bir yol sağlar.Bu teknik aynı zamanda tanınan anatomik mimari veya flüoresan etiketli hücre / alanlara sahip farklı doku türlerine uygulanabilir. Bu nedenle, hücre izolasyon protokolleri, bu yeni mikrodiseksiyon tekniği içeren en büyük avantajı, hücreler, doku komşu kirletici ortadan kaldırmak için özel doku bölgeleri izole edilebilir ve hücreler, diğer uygulamalar için veya kültür analizi için hemen elde edilebilmesidir.

Protokol

Bu protokolde hayvanların kullanımı Fox Chase Kanser Merkezi'nde Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Göstergeler, Çözümler ve lameller 1. Hazırlık

1. # 5 ince forseps temiz iki takım, 7. bir set ince kavisli forseps, büyük bir cerrahi makas, bir Microdissecting makas, bir spatula ve bir delikli kaşık. Kendi kendine yapışan bir sterilizasyon kese ve otoklav içindeki aletleri yerleştirin. Kullanıma hazır olana kadar kese aletleri tutun.
2. % 3 düşük erime sıcaklığına sahip bir agaroz çözelti hazırlayın.
   1. Kabarcıklar ortaya çıkıncaya kadar steril Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde 50 ml 1.5 g agarozun Add mikrodalga ve ısı yerleştirin. Tüm agaroz kadar girdap içinde eritildi ve yeniden ısıtma çözülene. Kümeleri görüldüğünde ısıtmadan önce bir karıştırma çubuğuna sahip olan çözüm karıştırın.
   2. Bir 37 ° C su banyosunda solüsyon deposu kadar gerekli.
   3. Uzun süreli Saklama Sistemi İçine ay boyunca oda sıcaklığında ya da 4 ° C 'de gelecekte kullanılmak üzere agaroz çözüm saklayın. Sıvılaştırılması için mikrodalga ısıtın. Agaroz çözeltinin tekrar ısıtılması için ılık steril damıtılmış su ile başlangıç ​​ağırlığı korumak için ısıtmadan önce şişeyi tartın.
3. Daha önce tarif edildiği gibi ² papain temelli hücre ayrılması için aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   1. Steril fenol kırmızı DPBS ihtiva eden papain (100 U / ml), sistein (0.2 mg / ml) ve DNAse (250 U / ml) ile bir papain çözeltisi.
   2. Büyükbaş hayvan serum albümini ile bir ovomukoid çözeltisi (BSA, 8 mg / ml), soya fasulyesi tripsin önleyici (8 mg / ml)) ve DNaz (250 U / ml) steril kırmızı olmayan fenol ihtiva eden DPBS.
      Filtre hem çözümler sterilize ve fenol kırmızı içeren DPBS orijinal rengini geri dönmek için pH ayarlamak.
4. Hücre kültürü ortamı (NB / B27) hazırlanması: 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin,% 1 penisilin-streptomisin (P / S), B27 eki ile bir bazal ortam ek. FilteR, sterilize ve ışıktan korur. Kullanımdan önce, 37 ° C'de ve ortam% 5 _CO2 dengelenmesi.
5. FACS tamponu hazırlayın:% 5 fetal sığır serumu, DPBS (FBS). 47.5 ml DPBS 2.5 ml FBS ekleyin.
6. Poli-D-lisin (PDL) kaplı lamelleri hazırlayın.
   1. Otoklav Yeni cam lamelleri.
   2. Kaplayın PDL lamelleri (steril damıtılmış su içinde 100 ug / ml) ve 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir ve gece boyunca oda sıcaklığı.
   3. Yıkama steril damıtılmış su ile lamelleri. NB / B27 medya ile bir kez yıkayın. Lamelleri kullanmak için önce doku kültürü kaputu tamamen kurumasını bekleyin.

Doku Dilimleri 2. Diseksiyon ve Hazırlık

1. Diseksiyon gününde, emici bir ped ile% 70 etanol ve kapak ile diseksiyon alanı silin.
2. Sterilizasyon kesesinden diseksiyon aletleri çıkarın. Buz soğuk, buz üzerinde küçük bir petri ve yere steril DPBS /% 1 P / S ekleyin.
3. Decapitate P4 Math1-GFBüyük cerrahi makas ile P / Nestin-OBP fare yavrular sonra ince kavisli bir forseps ile kafa basılı tutun. Cilt kaldırın ve yavaşça ince forseps daha sonra bir spatula kullanarak kafatası beyin kepçe ve DPBS /% 1 P / S içeren Petri kabı aktarmak # 5 ile kafatasını soymaya.
   1. # 5 ince forseps kullanarak, dikkatli bir beynin geri kalanından beyincik ayrı. Mümkün olduğunca çabuk bir defada bir yavru incelemek için emin olun.
   2. Moleküler ve işlevsel analiz için yeterli lif düğümlerinin elde edilmesi için 8 cerebella az toplayın.
4. % 3 düşük erime sıcaklığına sahip bir agaroz çözeltisiyle 2 x 2 x 2 cm büyüklüğünde bir gömme kalıp doldurun. Agaroz sıcaklığı fazla 37 ° C olduğundan emin olun.
5. Laboratuar doku yavaşça dabbing beyincik fazla sıvıyı çıkarın. Dikey konumda kalıba beyincik yerleştirin. Hızlı bir şekilde katılaşmasına izin vermek için buz üzerinde kalıp yerleştirin. Blok başına ~ 4 cerebella kullanın.
6. Li edinintitreşimli bıçak vibratom ile Ving doku bölümleri. Bir jilet ile serebellası içeren agaroz blok Trim. Dikey konumda yönlendirilmiş cerebella ile vibratome plakasına agaroz blok tutkal.
7. Altında buz-soğuk steril DPBS'de / 1% P / S ve yer buz ile vibratome tepsiyi doldurun.
   1. Beyincik tüm uzunluğu boyunca 600 um kesitler halinde kesilmiştir. Delikli bir kaşık kullanarak buz tepsiden bölümleri toplayın. Buz üzerinde DPBS /% 1 P / S ile dolu bir Petri tabağına yerleştirin bölümleri.

3. Mikrodisseksiyon ve Hücre Ayrılma

1. Bir floresan mikroskop altında doku dilim içeren Petri kabı yerleştirin.
   1. Dikkatle (Şekil 1 'de noktalı çizgi bakınız) CFP + moleküler tabakası ve GFP + EGL arasında kesilmesi yoluyla ince pensler kullanılarak bir serebellar bölümün geri kalanından ayırmak EGL. Neden olacaktır, moleküler tabakanın herhangi bir bölümünü dahil değil dikkatli olunNestin-ifade Bergmann glia kontaminasyon.
   2. Mümkün olduğunca çabuk bu adımı tamamlayın ve hücre ölümünü önlemek için buz üzerinde doku tutun.
   3. Bir sonraki aşamaya geçmeden önce dokuyu çevreleyen agaroz çıkarın.
2. Daha önce tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tarif edildiği gibi ² papain tabanlı bir protokol kullanarak microdissected EGL doku Digest.
   1. FACS üzerinden CFP-pozitif hücrelerin toplanması için FACS tampon hücreleri yeniden askıya.

4. Hücre Sıralama ve Kaplama

1. Uygun bir CFP filtresini içeren ve buz üzerinde FACS tamponu hücreleri toplamak sitometresi steril, yüksek hızlı akışı kullanılarak CFP floresan için sıralama hücreleri. Her P4 beyincik yaklaşık 100.000 NEPS edinin.
2. 5 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj hücreleri. Daha fazla deney için moleküler analiz veya kültür için hemen hücreleri kullanır.
3. Kültür hücreleri, önceden ısıtılmış NB / B27 m hücreleri yeniden askıyaPDL kaplı lamelleri edia ve plaka daha önce ² nitelendirdi.

Sonuçlar

Şekil 1A'da gösterildiği gibi, serebellar dilim hangi serebellar EGL GFP ifade kişi başına milli geliri hakim ve moleküler tabaka CFP pozitif glial hücreler tarafından zenginleştirilmiş P4 Math1 GFP / Nestin-CFP farelerden hazırlandı. (Şekil 1A kesikli hattı boyunca) EGL derin kısmında bulunan lif düğümlerini izole etmek için, dilimler EGL ve moleküler tabaka arasında microdissected edildi. Disseke EGLs (Şekil 1B) daha sonra...

Tartışmalar

Burada anlatılan yöntem mikrodiseksiyon moleküler ve fonksiyonel analizlerde kullanım için canlı hücreler saf bir popülasyonu izole etmek mümkün ilk işlemdir. Li ve ark. ⁹ ile gösterildiği gibi, Bu yöntemle elde edilen NEP kültürlenmiştir ve çeşitli deneyler dahil edilir ve olduğu gibi yüksek saflıkta, aynı zamanda mikro-dizi analizi için de kullanılabilir edilebilir.

Bu mikrodisseksiyon tekniğiyle ustalaşmanın zaman çok önemlidir....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal media	Gibco	21103-049
PDL	Millipore	A-003-E
Ultra pure low melting temperature agarose	Invitrogen	16520-050
DPBS	Gibco	14190144