طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي<em&gt; في المختبر</em

Summary

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Abstract

أحمر / العلاج شبه ضوء الأشعة تحت الحمراء (R / NIR-LT)، وسلمت عن طريق الليزر أو ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED)، ويحسن النتائج الفنية والصرفية في مجموعة من إصابات الجهاز العصبي المركزي في الجسم الحي، وربما عن طريق الحد من الإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، فقد ثبت آثار R / NIR-LT على الاكسدة تختلف اعتمادا على الطول الموجي أو شدة الإشعاع. الدراسات التي تقارن المعلمات العلاج غير موجودة، نظرا لعدم وجود الأجهزة المتوفرة تجاريا التي تقدم موجات متعددة أو شدة، ومناسبة لأعلى مستوى من خلال وضع في الدراسات الأمثل المختبر. يصف هذا البروتوكول تقنية للتسليم من الضوء على مجموعة واسعة من الأطوال الموجية وشدة لتحسين الجرعات العلاجية المطلوبة للنموذج إصابة معينة. لقد افترضنا أن وسيلة لإيصال الضوء، والتي يمكن بسهولة تغيير الطول الموجي وشدة المعلمات، يمكن أن يسهل تحديد جرعة المثلى لR / NIR-LT للحد من أنواع الاكسجين التفاعلية(ROS) في المختبر.

تم تصفيتها غير متماسك زينون الضوء من خلال مرشحات تدخل ضيقة النطاق لتقديم موجات متفاوتة (موجات مركز 440، 550، 670 و 810nm) وfluences (8.5 × 10 ^-3 إلى 3.8 × 10 ^-1 J / سم ²⁾ من الضوء إلى الخلايا المستزرعة. تم معايرة الضوء الناتج من الجهاز لتنبعث منها جرعات كمي ذات الصلة علاجيا، متساوية من الضوء في كل الطول الموجي. تم الكشف عن الأنواع المتفاعلة في وأكدت الغلوتامات الخلايا المعالجة مع الضوء، وذلك باستخدام DCFH-DA وH ₂ O ₂ الأصباغ الفلورية الحساسة.

سلمنا بنجاح الضوء على مجموعة من الناحية الفسيولوجية وعلاجيا موجات وشدة ذات الصلة، إلى الخلايا المستزرعة تتعرض لالغلوتامات كنموذج للإصابة الجهاز العصبي المركزي. في حين أن fluences من R / NIR-LT المستخدمة في الدراسة الحالية لم ممارسة تأثير على ROS التي تولدها الخلايا المستزرعة، وطريقة التسليم الخفيف ينطبق على نظم ال آخريننظم الإدارة البيئية بما في ذلك الميتوكوندريا أو أكثر من الناحية الفسيولوجية نماذج ثقافة شريحة عضوي النمط ذات الصلة معزولة، ويمكن استخدامها لتقييم الآثار على مجموعة من التدابير نتائج الأيض التأكسدي.

Introduction

يرجى ملء أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) لطائفة من إشارة مسارات نقل وردود الفعل الطبيعية من الأيض الخلوي، بما في ذلك الحماية العصبية ^1. ومع ذلك، عندما آلية مضادة للأكسدة الذاتية غير قادرة على السيطرة على إنتاج ROS، الخلايا قد فريسة لالاكسدة ^2،3. وبعد إصابة في الجهاز العصبي المركزي، ويعتقد أن الزيادات المرتبطة بحضور ROS والاكسدة للعب دور كبير في تطور الضرر ^4،5. على الرغم من العدد واسعة من استراتيجيات لتخفيف الاجهاد التأكسدي التي تم تقييمها، وهناك حاليا أي والاستراتيجيات المضادة للأكسدة فعالة تماما ذات الصلة سريريا لتخفيف إنتاج ROS والاكسدة المرتبطة بها في الاستخدام السريري التالية رضح عصبي ^6. وبالتالي تخفيف الإجهاد التأكسدي يبقى هدفا مهما للتدخل العلاجي ^7.

تحسينات تتبعتم الإبلاغ جي R / NIR-LT في مجموعة واسعة من الإصابات والأمراض بما في ذلك تخفيض في فؤادي حجم احتشاء، والمضاعفات الكلوية والكبدية أثناء مرض السكري، وتنكس الشبكية أو الإصابة CNS والسكتة الدماغية ^8، ربما عن طريق الحد من الإجهاد التأكسدي. مع إيلاء اهتمام خاص إلى إصابة الجهاز العصبي المركزي، وقد أظهرت الدراسات قبل السريرية من فعالية ضوء 670nm آثار جيدة في نماذج من تنكس الشبكية ^9-11، واصابات الحبل الشوكي ^12، موت الخلايا العصبية ^(13). وقد أجريت التجارب السريرية لسن الجافة بتحلل البقعة الصفراء والتي تجرى حاليا للسكتة الدماغية ^14، إلا أن نتائج هذه التجارب لا تظهر واعدة، وربما يرجع ذلك إلى عدم توظيف علاج فعال المعلمات ^15. على هذا النحو، لم يعتمد R / NIR-LT على نطاق واسع كجزء من الممارسة السريرية العادية في رضح عصبي، على الرغم من كونه وسيلة سهلة لإدارة، غير الغازية والعلاج غير مكلفة نسبيا. وتشمل الحواجز على الترجمة السريرية عدم وجود CLأدركت منذ البداية آلية العمل وعدم وجود موحد فعال ^16،17 بروتوكول العلاج. الأدب الحالي بشأن العلاج بالضوء يكشف عن عدد كبير من التباين في المعايير في المعاملة بين مصادر الإشعاع (LED أو ليزر)، والطول الموجي (على سبيل المثال، 630، 670، 780، 810، 830، 880، 904nm)، الجرعة الإجمالية (جول من الإشعاع / وحدة المساحة)، ومدة (زمن التعرض) والتوقيت (إهانة ما قبل أو ما بعد)، وتواتر العلاج وطريقة التسليم (نبض أو مستمر) ^8. التباين في المعاملة بين المعلمات دراسات يجعل المقارنة صعبة وساهم في الشكوك بشأن فعالية ^16.

لذلك، والتحسين من R / NIR-LT مطلوب بشكل واضح، مع أنظمة قادرة على توفير آلية فحص عالية الإنتاجية اللازمة لمقارنة متغيرات متعددة ثقافة الخلية. ولكن هناك عدد قليل من النظم الإضاءة المتاحة تجاريا التي يمكن أن توفر ما يكفي من المرونة والسيطرة على واvelength وشدة لأداء مثل هذه التجارب الأمثل. تجاريا المتاحة أجهزة LED هي عموما ليست قادرة على تقديم الأطوال الموجية أو شدة متعددة، مما أدى إلى المحققين توظيف عدة أجهزة LED من مختلف الصانعين، والتي قد تختلف ليس فقط في شدة، ولكن أيضا الطيف من الطول الموجي للضوء المنبعث. لقد تناولت هذه القضية من خلال توظيف مصدر ضوء زينون النطاق العريض التي تمت تصفيتها من خلال مرشحات تدخل الضيق، وبالتالي توليد مجموعة من الأطوال الموجية للضوء وfluences، مما يسمح ثيقة، مراقبة دقيقة من المعلمات من R / NIR-LT.

من المهم أن نلاحظ أن الجرعة العلاجية من العلاج تم تعريفه من قبل عدد من الفوتونات التفاعل مع photoacceptor (حامل اللون)، والتي، وافترض في حالة R / NIR-LT أن تكون السيتوكروم ج أوكسيديز (COX) ^18. طاقة الفوتون تسليمها يختلف مع الطول الموجي. وهذا يعني جرعات متساوية للطاقة في أطوال موجية مختلفة يكون كومنفيسة من أرقام مختلفة من الفوتونات. ولذلك، فإن الضوء المنبعث من الجهاز تم معايرة لتنبعث منها عدد متساو من الفوتونات لكل من الأطوال الموجية المختار لفحصها. قمنا بتطوير نظام التي يمكن استخدامها لتقديم R / NIR-LT في مجموعة واسعة من الأطوال الموجية وشدة إلى خلايا في المختبر، وأثبت القدرة على قياس الآثار المترتبة على تسليمها R / NIR-LT على الإنتاج ROS في الخلايا تعرض ل الإجهاد الغلوتامات.

Protocol

1. بصري المعايرة: قياس الضوء الناتج

1. لإعداد جهاز تسليم خفيفة، توصيل مصدر الضوء النطاق العريض (على سبيل المثال، زينون أو مصباح التنجستن) لامدادات الطاقة المناسب. ضع العدسة الموازاة أمام مصدر الضوء لإنتاج شعاع موازى للضوء. تمرير الضوء من خلال مرشح الحرارة السائل لإزالة معظم الحرارة من شعاع ضوء. اعتمادا على التطبيق، والتركيز شعاع موازى إلى فتحة مدخل دليل ضوء السائل، والذي ينص على تسليم أكثر مرونة من الضوء (على سبيل المثال، إلى حاضنة).
2. في الطرف الآخر من دليل ضوء السائل، ضع العدسة الموازاة الثانية ثم حامل للتدخل ومرشحات الكثافة محايدة. تحقق من أن هذا الترتيب ينتج بقعة مضيئة بالتساوي من ضوء و waveband المطلوب وشدة.
   ملاحظة: المسافة بين نهاية نور الهداية والطائرة العينة قد تحتاج إلى تختلف تبعا لالمنطقة التي يجب أن تكون مضيئة، ولكن تذكر أن والمسافة من نهاية الزيادات دليل الخفيفة، وشدة الضوء ستنخفض. في هذه الدراسة، هذه المسافة هي ل 14cm وتنتج المقطع العرضي شعاع الذي ينير بالتساوي على المنطقة جيدا 3X3 على طبق من ذهب 96-جيدا.
3. تأكد من أن الضوء الشارد من مصباح والمكونات البصرية المرتبطة بها غير قادر على الوصول إلى العينة.
4. بدوره على برودة الماء لتصفية حرارة السائل وضمان عدم وتبادل المياه من خلال سترة التصفية. بدوره على مصدر الطاقة مصباح والانتظار لمدة 5 دقائق على الأقل لمصدر ضوء النطاق العريض لتحقيق الاستقرار. ملاحظة: مطلوب استخدام برودة الماء لمنع الإفراط في التدفئة للجهاز.
5. اختر مرشح تدخل الضيق (التي توصف عادة من قبل الطول الموجي لها مركز، النفاذية الذروة والعرض الكامل في نصف كحد أقصى (FWHM) عرض النطاق الترددي) لتوليد و waveband المطلوب من الإضاءة. ملاحظة: وكانت المرشحات تدخل الضيق المستخدمة في الدراسة الحالية 442 نانومتر و 550 نانومتر، 671 نانومتر و 810 نانومتر.
6. قياس الضوء التي تنتجها مصباح في الطائرة حيث العينة هو وضعه خلال فترة العلاج. قياس الضوء باستخدام مسبار الإشعاع معايرة (جيب التمام جامع) متصلة مقياس الطيف مناسبة، وذلك باستخدام برنامج اللياقة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
7. استخدام مرشحات الكثافة محايدة لضبط شدة الضوء حتى يتم الحصول على النتيجة المرجوة. ملاحظة: في هذه الدراسة، ويتم ضبط شدة مرت من قبل كل مرشح تدخل ضوء لإعطاء ناتج كمي على قدم المساواة في كل من wavebands العلاج الأربعة. فمن المهم للتحقق من معايرة بانتظام، والإخراج المصباح هو عرضة للتغيير.
   ملاحظة: بعد مجموعة تتكون من جهاز، والخلايا جاهزة للمضيئة الشكل 1 هو تمثيل لجهاز تسليم ضوء المستخدمة في الدراسة الحالية.

الشكل 1. صورة الجهاز تسليم خفيفة. المصور هي مصدر الطاقة الخفيفة، مصباح زينون مع السكن، عدسة الموازاة، تصفية المياه، ومدخل الفتحة، دليل ضوء السائل، عدسة الموازاة الثانية، حامل مرشح، والإطار العلاج وغير لامع بطاقة سوداء. لاحظ أن الضيق الطول الموجي وشدة المرشحات لا تظهر.

2. خلية التحضير

1. وR / NIR-LT طريقة التسليم وصفها يمكن تطبيقها على أي نوع من الخلايا أو في نظام نموذجي المختبر. على هذا النحو الأوصاف التالية من زراعة الخلايا هي عامة، وذلك باستخدام تقنيات راسخة لورم القواتم الثقافة (PC12)، مولر (rMC1) وخلايا الشبكية المختلطة الابتدائية.
2. قبل البذر خلية للعلاج الخفيفة والأكسدة الإجهاد الفحص، تخليد ثقافة الخلايا في وسائل الإعلام الخاصة النمو منها تحتوي على المكملات المناسبة (على سبيل المثال، FBS والمضادات الحيوية) في إف إل أي إس T75كانساس حتى 70-80٪ متموجة.
3. فصل خلايا خلدت من قوارير T75، وذلك باستخدام الطريقة المناسبة لنوع من الخلايا لفحصها على سبيل المثال.، التربسين. إذا لزم الأمر، قبل الشروع في البذر من الخلايا في 96-جيدا لوحات الفحص والآبار لوحة معطف مقايسة مع 10μg / مل بولي-L-ليسين ل1H (على سبيل المثال، للخلايا PC12) أو 10μg / مل بولي-L-ليسين ل 1H يعقبه O / N الحضانة مع 10μg / مل laminin (على سبيل المثال، للخلايا الشبكية مختلطة).
4. خلايا الطرد المركزي لجمع حسب الاقتضاء (على سبيل المثال، 3 دقائق في 405 x ج لخلايا PC12 أو 10 دقيقة في 218 x ج لخلايا rMC1)، وإزالة وطاف resuspend في 8 مل من المناسب سائل الإعلام ثقافة الخلية.
5. إذا خلايا الشبكية مختلطة هي لاستخدامها، وإعداد من P0-5 الفئران الوليدة حديثي الولادة عن طريق الهضم الأنزيمي (غراء) وفقا للإجراءات المقررة ¹⁹
6. حساب عدد خلايا قابلة للحياة باستثناء 0.4٪ (ث / ت) صبغة زرقاء التريبان، وذلك باستخدام haemocytometer.
7. ضبط كثافة الخلية يرغب، يمثح أن الخلايا ستكون حوالي 70-80٪ متموجة بعد 24 أو 48H في الثقافة. (للخلايا PC12 كثافة البذر هي 4.0 × 10 ⁵ خلايا قابلة للحياة / مل، للخلايا rMC1، فمن 2.5 × 10 ⁵ خلايا قابلة للحياة / مل وللخلايا الشبكية المختلطة هو 8 × 10 ⁵ خلايا قابلة للحياة / مل). بعد إضافة خلايا إما لوحات 96-جيدا واضحة أو السوداء (التي تستخدم لH ₂ O ₂ أو DCFH-DA فحص على التوالي)، في 100 ميكرولتر من وسائط النمو المناسب، والسماح لوحة للجلوس على سطح مستو عند 37 درجة مئوية، 5 ٪ CO ₂ (أو أيا كان الظروف المناسبة لنوع خلية معينة) لا يقل عن 24 ساعة للسماح الالتزام الخلية.
8. خلايا الثقافة في وسائل الاعلام النمو في مناسبة 96 صواني جيدا حتى تكون 70-80٪ متموجة (24H لPC12 والخلايا rMC1، 48H لخلايا الشبكية مختلطة).

3. إضافة الغلوتامات الضغوطات إلى خلايا

1. إعداد أحادية الصوديوم حمض تركيزات هيدرات الملح الضغوطات-L الجلوتاميك من 0-10mM في تنمو الكامل المناسبعشر وسائل الإعلام الثقافة.
2. إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وغسل بلطف الخلايا 3 مرات مع PBS (PC12) أو HBSS (rMC1 وخلايا الشبكية مختلطة). يغسل بعد، إضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على الغلوتامات إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد.

4. الأولى جرعات من العلاج الخفيفة

1. فور إضافة الغلوتامات أو الإجهاد في الاختيار، وفضح الخلايا لعلاج الضوء على موجات المطلوب وشدة عن طريق وضع تحت جهاز استعداد تسليم النور. تأكد من تغيير المخرجات كمي من شعاع ضوء باستخدام تركيبات الثابتة للمرشحات الكثافة محايدة اعتمادا على الطول الموجي تدار.
   ملاحظة: في التجارب الحالية، وتعريض الخلايا لعلاج الخفيفة لمدة 3 دقائق حفاظ على درجة الحرارة التي يستريح لوحات جيدا 96 على ³⁷ درجة سادة C الحرارة. يجوز تغيير وقت العلاج على النحو المطلوب.
   1. وضع بطاقة سوداء ماتي تحت الخلايا لمنع الضوء المنعكس في الآبار المجاورة في-96 أهلا وسهلال علبة المخصصة لمعلمات العلاج الأخرى.
2. إذا كان المطلوب العلاج لفترات أطول من الوقت، إضافة عازلة 25MM HEPES للحفاظ على درجة الحموضة وسائل الإعلام ثقافة الخلية أو من الناحية المثالية، ووضع لوحات الأجهزة والعلاج داخل حاضنة مع CO ₂ تركيز ينظم إلى 5٪ CO _2، أو الظروف التي هي الأمثل لنوع خلية معينة.
3. وبعد الانتهاء من العلاج الخفيفة، ووضع الخلايا على سطح مستو واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ (أو أيا كان الظروف المثالية للنوع من الخلايا) ل24H.
   ملاحظة: يمكن أن تدار جرعات إضافية من R / NIR-LT كما هو موضح أعلاه، كما تريد.

5. النهائي جرعة من العلاج الضوء والكشف عن ROS

1. قبل تنفيذ الجولة الاخيرة من العلاج الخفيفة، وإعداد الكواشف لاستخدامها للكشف عن ROS. إعداد 50MM عازلة سيترات (pH6.0)، تريتون X100، وH ₂ O ₂ كشف كاشف العمل(نسبة 97 من 10MM H ₂ O ₂ الكشف عن حل الأسهم كاشف، و 10 U / مل البيروكسيديز الفجل، 50MM سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.0) 1: 2) حل. إعداد DCFH-DA بتركيز نهائي من 100μM في وسائل الإعلام المناسبة.
   ملاحظة: DCFH-DA كاشف للخلايا PC12 في وسائل الإعلام RPMI، DCFH-DA كاشف للخلايا rMC1 هو في وسائل الاعلام DMEM. لاحظ أن الكواشف كشف المتاحة تجاريا لها الحساسيات التفاضلية لROS محددة ويجب اختيارها بعناية الكواشف لتوفير المعلومات المطلوبة لتطبيق الفردية.
2. إدارة العلاج الخفيفة إلى الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 4.1-4.1.2. يعالجون ضمان الخلايا مع المطلوب fluences / الأطوال الموجية للضوء.
3. فورا بعد العلاج الخفيفة، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الغلوتامات ويغسل مرتين مع حل العازلة المناسب (للخلايا PC12، ويستخدم برنامج تلفزيوني وللخلايا rMC1، ويستخدم HBSS). إجراء فحوصات ROS على الخلايا على النحو التالي:
   1. H ₂ O ₂ الفحص: إضافة 45 ميكرولتر من 50MM عازلة سيترات (الرقم الهيدروجيني 6.0) و 5 ميكرولتر تريتون X100 إلى كل من الآبار. بلطف يهز الخلايا على شاكر المداري لمدة 30 ثانية واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 15 دقيقة. إضافة 50 ميكرولتر من H ₂ O ₂ حل العاملة الكشف واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. قياس مضان باستخدام قارئ لوحة مع الطول الموجي الإثارة من 530nm الطول الموجي وانبعاث 480nm.
   2. DCF الفحص: إضافة 100 ميكرولتر من حل 100 ميكرومتر من DCFH-DA إلى كل من الآبار واحتضان لمدة 30min في في 37 ° C وCO ₂ 5٪. إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على 100 ميكرومتر DCFH-DA، ويغسل مع حل العازلة المناسب (كما هو موضح أعلاه) مرتين. إضافة 90 ميكرولتر من حل العازلة و 10 ميكرولتر تريتون X100 إلى كل من الآبار ويهز بلطف على شاكر المداري لمدة 30 ثانية قبل 15 دقيقة الحضانة عند 37 درجة مئوية. قياس DCF مضان المستمدة باستخدام قارئ لوحة مع الطول الموجي الإثارة من 480nm ويفل الانبعاثاتength من 530nm.
   3. صريحة ROS تقدر نسبة إلى تركيز البروتين من الخلايا المتبقية في الآبار، وذلك باستخدام مجموعة اللونية لقياس تركيز البروتين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع الإشارة إلى منحنى القياسية لحساب ملغم بروتين.

النتائج

تم معايرة إخراج ضوء ألقاها في طول موجة من 670nm باستخدام مرشحات الكثافة محايدة من أجل أشرق الخلايا مع مجموعة من fluences تشمل جرعة من الضوء 670nm هو موضح سابقا أن تكون مفيدة في الجسم الحي (0.3 J / سم ^{2) 20.} حيث بلغ عدد مرشحات الكثافة محايدة أمام مصدر الضوء زيادة، وشدة (W / م <...

Discussion

لقد تكيفت بنجاح نظام تسليم ضوء دقيقة ومحسوبة لتوفير آلية لدراسة تعظيم الاستفادة من R / NIR-LT في المختبر. الطول الموجي وشدة معالم R / NIR-LT قادرين على معالجته بدقة وفاعلية استخدام هذا النظام. أنشأنا أن العلاج الخفيفة من الخلايا لم تؤدي إلى موت الخلايا، على الرغم من ROS لم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B