파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em&gt; 체외</em

요약

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

초록

레이저 또는 발광 다이오드 (LED)에 의해 전달 레드 / 근적외선 요법 (R / NIR-LT)은, 아마도 산화 스트레스를 감소시킴으로써 생체 내에서 중추 신경계 손상, 범위의 기능적 형태 학적 결과를 개선시킨다. 그러나, 산화 스트레스에 R / NIR-LT의 효과는 파장 또는 조사의 강도에 따라 달라질 것으로 나타났다. 치료 매개 변수를 비교하는 연구로 인해 체외 최적화 연구에 넣어 통해 높은에 적합한 여러 파장이나 강도를 제공 상업적으로 사용 가능한 장치의 부재로, 부족하다. 이 프로토콜은 주어진 손상 모델에 필요한 치료 용량을 최적화하는 파장과 강도의 범위에서 빛의 전달을위한 기술을 설명한다. 우리는 파장 및 강도 파라미터를 쉽게 변경 될 수있는 빛을 전달하는 방법은, 활성 산소 종을 감소시키기위한 R / NIR-LT의 최적 투여 량의 결정을 용이하게 할 수 있다는 가설을 세웠다시험 관내 (ROS).

비 간섭 제논 라이트는 다양한 파장 (440, 550, 670의 중심 파장 및 810) 및 플루 언스 제공하는 협 대역 간섭 필터를 통해 여과 (8.5 × 10 ^-3 3.8을 × 10 ^-1 J / cm ²⁾ 빛의 배양 된 세포에. 장치에서 빛 출력은 각각의 파장에서 빛의 치료 관련, 동일한 계량 적 투여 량을 방출하도록 조정했다. 글루타메이트는 DCFH-DA 및 H ₂ O _2에 민감한 형광 염료를 사용하여, 광 처리 된 세포 스트레스에 반응 종을 검출 하였다.

우리는 성공적으로 CNS 손상의 모델로 글루타민산 염에 노출 배양 된 세포에 관련 파장 및 강도 생리 및 치료의 범위에서 빛을 전달했다. 배양 된 세포에 의해 생성 된 ROS에 영향을주지 않았다 현재 연구에 사용 된 R / NIR-LT의 플루 언스 반면, 빛의 전달 방법은 다른 SYST에 적용 할 수있다EMS 더 중요한 생리 학적 또는 미토콘드리아 Organotypic 슬라이스 배양 모델을 포함한 절연 및 산화 대사의 결과 측정의 범위에 영향을 평가하기 위해 사용될 수있다.

서문

반응성 산소 종 (ROS)의 신호 전달 경로와 ^하나의 신경 세포를 포함한 정상적인 대사 반응의 범위에 대해 요구된다. 내인성 항산화 메커니즘은 ROS의 생성을 제어 할 수없는 때, 세포는 산화 스트레스에 굴복 ^2,3-있다. CNS에 손상 후, ROS 및 산화 스트레스의 존재가 증가 연관된 손상 ^4,5의 진행에 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. 평가 된 산화 스트레스를 감쇠하기위한 전략의 광대 한 수에도 불구하고, 신경 외상 ⁽⁶⁾ 다음의 임상 사용 ROS 생산과 관련된 산화 스트레스를 감쇠에 대한 완전히 효과, 임상 적으로 관련된 항산화 전략은 현재 존재하지 않는다. 따라서 산화 스트레스의 감쇠는 치료 적 개입 ^7에 대한 중요한 목표 남아있다.

개선 사항은 다음과보내고 R / NIR-LT는 부상 아마도 산화 스트레스를 줄임으로써 심근 경색 크기, 당뇨병 및 간 동안 신장 합병증, 망막 변성, CNS 손상 및 뇌졸중 ^(8)의 감소를 포함하여 다양한 질환에서보고되었다. CNS 부상에 특히 관련하여, 670nm의 빛의 효능 임상 연구는 망막 변성 ^9-11, 척수 손상 ^(12), 신경 세포의 죽음 ^(13)의 모델에 좋은 효과를 보여 주었다. 임상 시험은 그러나이 실험의 결과는 ^{15 매개} 변수 효과적인 치료를 사용하는 것이 아마도 장애로 인해 유망 나타나지 않습니다, 황반 변성 관련 마른 나이 수행과 뇌졸중 ^(14)에 대해 현재 진행되고있다. 따라서, R / NIR-LT 널리 비 침습적, 관리하기 쉽고 상대적으로 저렴한 치료에도 불구하고, 신경 외상 정상 임상 실습의 일환으로 채택되지 않았습니다. 임상 번역 장벽은 CL의 부족을 포함초기 표준화 효과적인 치료 프로토콜 ^{16, 17의} 행동과 부재의 메커니즘을 이해했다. 빛 치료에 대한 현재 문헌 조사 소스에 대해 (LED 또는 레이저), 파장 (예를 들어, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), 조사의 총 용량 (주울 / 치료 매개 변수의 변화의 과다를 보여 단위 영역), 지속 시간 (노광 시간), 타이밍 (예정 모독 또는 포스트), 치료의 빈도 및 전달 모드 () 펄스 또는 연속 ^8. 연구와 치료 매개 변수의 변동성 비교 어렵고 효능 ^(16)에 대한 회의론에 기여하고있다.

따라서, R / NIR-LT의 최적화는 명확 여러 변수를 비교하는 데 필요한 높은 처리량 스크리닝 기법을 제공 할 수있는 세포 배양 시스템이 필요하다. 그러나 워싱턴를 통해 충분한 유연성과 제어를 제공 할 수 몇 상업적으로 이용 가능한 조명 시스템이 있습니다velength 강도는 최적화 실험을 수행 할 수 있습니다. 시판 LED 장치는 일반적으로 강도뿐만 아니라 다를 수 있습니다 다른 제조 업체, 여러 LED 소자를 사용하는 연구자의 결과로 여러 파장이나 강도를 제공 할 수뿐만 아니라 방출되는 빛의 파장의 스펙트럼하지 않습니다. 우리는 따라서 R / NIR-LT의 파라미터의 근접, 정확한 제어를 허용하며, 파장 및 빛의 플루 언스의 범위를 생성하는 협 대역 간섭 필터를 통해 여과 광대역 크세논 광원을 사용함으로써이 문제를 해결했다.

그것은 치료의 치료 학적 투여 량은 R / NIR-LT의 경우 사이토 크롬 C 산화 효소 (COX) ^(18)로 가정하고, photoacceptor (발색단)와 상호 작용하는 광자의 수에 의해 정의된다는 점에주의하는 것이 중요하다. 전달 광자 에너지는 파장에 따라 달라집니다; 서로 다른 파장의 에너지의 동일한 용량을 의미하는 것은 COM 될 것입니다광자의 상이한 수의 입상. 따라서, 소자로부터 방출 된 광이 테스트에 선택된 파장의 광자를 각각 동일한 수의 방출하도록 조정 하였다. 생체 외에서 세포의 파장과 강도의 범위에서 R / NIR-LT를 전달하는데 사용될 수있는 시스템을 개발하고 실시 세포에서 ROS 생성에 전달되는 R / NIR-LT의 효과를 측정 할 수있는 능력을 입증 글루타민산 염 스트레스.

프로토콜

1. 광학 보정 : 측정 광 출력

1. 광 전달 장치를 준비하기 위해, 광대역 광원을 연결 (예를 들어, 제논 램프 또는 텅스텐)에 적합한 전원 공급 장치에 관한 것이다. 광의 시준 된 빔을 생성하는 광원 앞의 콜리 메이팅 렌즈를 배치. 광속에서 대부분의 열을 제거하기 위해 액체 열 필터를 통해 광을 통과. 애플리케이션에 따라, 빛의보다 유연한 전달 (예., 인큐베이터) 제공 액체 광 가이드의 입사 개구에 평행 빔에 초점.
2. 액체 광 가이드의 타단에, 시준 렌즈를 제하고 간섭 및 감광 필터의 위치 홀더. 이 배열은 원하는 파장 대역과 강도의 빛의 균일 조명 자리를 생산하고 있는지 확인합니다.
   참고 : 라이트 가이드와 시편 평면의 끝 사이의 거리에 따라 달라질 필요가 있습니다조명되어야하지만 지역 도광 증가 단부로부터의 거리로, 광 강도가 감소한다는 것을 기억. 본 연구에서는,이 거리가 14cm이고 균일 96- 웰 플레이트에 3 × 3 웰 영역을 조명 빔 단면을 생성한다.
3. 램프와 관련 광학 부품으로부터 미광을 확인하는 것은 시편에 도달 할 수 없습니다.
4. 액체 열 필터 물 쿨러의 전원을 켜고 필터 재킷을 통해 물 교환이 확인합니다. 램프 전원을 켜고 안정 될 때까지 광대역 광원 적어도 5 분 동안 기다립니다. 주 : 물 냉각기의 사용은 장치의 과열을 방지 할 필요가있다.
5. 조명의 원하는 파장 대역을 생성하는 (보통 반 최대 (FWHM) 대역폭에서 자신의 중심 파장, 피크 투과율 및 전체 폭에 의해 기술) 협 대역 간섭 필터를 선택합니다. 참고 : 본 연구에 사용 된 협 대역 간섭 필터 (4)이었다42 나노 미터, 550 나노 미터, 671 nm에서 810 nm의.
6. 시편은 치료 중에 위치하도록 평면에서 램프에 의해 생성 된 광을 측정한다. 제조업체의 지시에 따라 적부 소프트웨어를 사용하여, 적절한 접속 분광 방사 조도 교정 프로브 (코사인 콜렉터)을 사용하여 광을 측정한다.
7. 원하는 출력이 얻어 질 때까지의 광의 강도를 조정하는 감광 필터를 사용한다. 참고 : 본 연구에서, 각각의 간섭 필터에 의해 통과 된 광의 강도는 네 개의 처리 wavebands 각각에서 동일한 계량 적 출력을 제공하도록 조정된다. 이 램프 출력이 변경 될 수 있습니다로, 정기적으로 교정을 확인하는 것이 중요합니다.
   주 : 장치의 셋업이 이어, 세포를 조명 될 준비가 하나가 현재 연구에 사용 된 광 전달 장치의 그림 표현이다..

빛 전달 장치. 일러스트 그림 1. 이미지는 빛 전원 주택, 시준 렌즈, 물 필터, 입구 조리개, 액체 라이트 가이드, 초 콜리 메이팅 렌즈, 필터 홀더, 처리 프레임과 매트 블랙 카드 크세논 램프입니다. 협 대역의 파장과 강도 필터가 표시되지 않습니다.

2. 셀 준비

1. 기재된 R / NIR-LT 배송 방법은 어떠한 세포 유형 또는 시험 관내 모델 시스템에 적용될 수있다; 세포 배양의 다음과 같은 설명은 배양 갈색 세포종 (PC12), 뮐러 (RMC1)와 일차 혼합 망막 세포에 잘 확립 된 기술을 사용하여, 일반적으로이다.
2. 빛 치료 및 산화 스트레스 분석을위한 세포 파종하기 전에, 문화는 T75의 flas에서 적절한 보조제 (예., FBS, 항생제)를 포함하는 각각의 성장 배지에서 세포를 불멸화70-80% 합류 할 때까지 KS.
3. 예를 테스트하기 위해 세포 유형에 적합한 방법을 사용하여 T75 플라스크로부터 불사 화 세포를 분리., 트립신. 필요한 경우, 96 웰 분석 플레이트에서 세포의 파종 진행하기 전에, 코트 분석 플레이트 (PC12 세포에 대한 예.) 1 시간에 대한 10μg / ml의 폴리 -L- 라이신과 우물 또는 10μg / ml의 폴리 -L- 라이신 10μg와 O / N 배양 한 다음 1 시간 / ㎖ 라미닌 (예., 혼합 망막 세포).
4. 원심 분리 세포 (예., PC12 세포에 대한 405 XG 또는 RMC1 전지용 218 XG에 10 분에서 3 분)와 같은 적절한 수집 할 적절한 세포 배양 배지 8 ㎖에 상청에 resuspend 제거.
5. 혼합 망막 세포가 사용되는 경우, 확립 된 절차에 따라 ¹⁹ 소화 효소 (파파인)에 의해 P0-5 신생아 래트 새끼로부터 제조
6. 혈구 계를 사용하여, 0.4 % (W / V) 트립 판 블루 염색 배제 생존 세포 수를 계산.
7. 셀 밀도 SUC를 조정세포 배양에서 24 또는 48 시간 후 약 70~80% 합류 될 것입니다 시간. (PC12 세포에 대한 시딩 밀도 RMC1 세포를 들어, 2.5 × 10 ⁵ 생세포 / ㎖이고, 혼합 망막 세포 것이 8 × 10 ⁵ 생세포 / ㎖이며, 4.0 × 10 ⁵ 생세포 / ㎖ 임). 셀을 추가 한 후 중 적절한 성장 배지 100 ㎕에, (H ₂ O ₂ 또는 DCFH-DA 분석 각각 사용) 명확한 또는 검은 색 96 웰 플레이트, 플레이트는 37 ° C, 5 평평한 표면에 앉아 할 수 있도록 % CO ₂ 세포 부착을 허용하는 최소 24 시간 동안 (또는 어떤 조건은 특정 세포 유형에 적합한).
8. 해당 96 웰 트레이 성장 미디어 문화의 세포들은 70 ~ 80 %의 합류 (PC12 및 RMC1 세포에 대한 24 시간, 혼합 망막 세포 48)까지.

3. 세포에 글루타민산 스트레스 추가

1. 적절한 성장한다 전체에 0-10mM의 L 글루탐산 모노 나트륨 염 수화물 스트레스 농도 준비일 문화 미디어.
2. 세포에서 미디어를 제거하고 부드럽게 PBS (PC12) 또는 HBSS (RMC1과 혼합 된 망막 세포)와 세포를 3 회 세척한다. 세척 후 / 웰에 100㎕의 총 부피로 글루타메이트 - 함유 배지를 추가한다.

라이트 치료 4. 첫 번째 투여 량

1. 즉시 글루타메이트 또는 선택의 스트레스 요인의 추가에 따라, 제조 된 광 전달 장치 아래에 배치하여 원하는 파장과 강도 빛 치료에 세포를 노출합니다. 파장에 따라 중립적 인 밀도 필터의 설치 조합을 사용하여 광선의 계량 적 출력 관리중인 변경해야합니다.
   참고 : 현재의 실험에서, 3 분 동안 빛 치료에 세포를 노출 37 ^O C 열 패드의 96 웰 플레이트를 놓아 온도를 유지한다. 요구되는 처리 시간은 변할 수있다.
   1. 96 아 인접 우물에 반영하는 빛을 방지하기 위해 세포 아래에 매트 블랙 카드를 놓습니다L 트레이는 다른 치료 매개 변수에 대한 지정.
2. 처리는 시간의 긴 길이에 대해 요구되는 경우, 최적 또는 조건을 세포 배양 배지의 pH를 유지 또는 이상적으로, 5 % CO _2로 조절 CO ₂ 농도 인큐베이터 내에서 장치 및 처리 판을 배치하고 25mM HEPES 완충 추가 특정 세포 유형.
3. 광처리 종료 후, 평평한 표면에 세포를 넣고 37 ℃, 5 % CO _2에서 24 시간 배양한다 대 (또는 어떤 상황 세포 유형에 대해 최적).
   주의 : 전술 한 바와 같이 필요에 따라 R / NIR-LT의 추가의 투여 량은, 투여 할 수있다.

ROS의 빛 치료와 탐지 5. 최종 복용량

1. 광처리의 최종 라운드를 수행하기 전에 시약 ROS 검출에 사용될 준비. ₂ O ₂ 검출 시약 작업을 50mM의 구연산 완충액 (pH6.0), 트리톤 X100 및 H 준비용액 (1 : 2 : 10 mM이 H ₂ O ₂ 검출 시약 원액의 비율 97 10 U / ㎖의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제, 50 mM의 시트르산 나트륨 (PH 6.0)). 적절한 미디어에서 100μM의 최종 농도 DCFH-DA를 준비합니다.
   주 : PC12 세포에 DCFH-DA를위한 시약 RPMI 매체이며, RMC1 전지용 DCFH-DA 시약 DMEM 배지에서이다. 시판 검출 시약 특정 ROS에 차동 감도를 가지고 시약 개별 애플리케이션에 요구되는 정보를 제공하기 위해주의 깊게 선택되어야합니다.
2. 4.1-4.1.2 단계에 기재된 바와 같이, 세포에 광처리를 관리. 확인 세포는 빛의 원하는 플루 언스 / 파장으로 처리되고있다.
3. 즉시 글루타메이트 - 함유 배지를 제거하고 적절한 완충 용액으로 두 번 세척 광처리는 다음의 (PC12 세포 위해 PBS를 사용하고, 셀 RMC1 위해 HBSS가 사용된다). 다음과 같이 세포의 ROS 분석을 수행합니다 :
   1. H ₂ O ₂ 분석은 : 각각의 웰에 50 mM의 구연산 완충액 (pH 6.0) 및 5 μL의 트리톤 X100 45 μL를 추가한다. 부드럽게 30 초 동안 진탕 기에서 세포를 흔들어 15 분 동안 CO _2를 37 ° C에서 품어 5 %. H의 50 μL ₂ O ₂ 탐지 작업 솔루션을 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. 을 530nm의 여기 파장 및 ~ 480㎚의 발광 파장을 갖는 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정한다.
   2. DCF 분석은 : 각각의 웰에 DCFH-DA의 100 μM 용액 100 μl를 추가하고 37 ° C에서 30 분, 5 % CO ₂ 배양한다. 100 μM DCFH-DA가 포함 된 용지를 제거하고 위에서 설명한대로 두 번 적절한 완충 용액으로 세척한다. 각각의 웰에 완충 용액 10 μL 트리톤 X100의 90 μl를 추가하고 부드럽게 37 ° C에서 30 초 15 분 전에 배양을위한 궤도 진탕 기에서 흔들어. ~ 480㎚의 여기 파장과 발광 wavel와 플레이트 판독기를 이용하여 유도 된 DCF 형광 측정을 530nm의 ength.
   3. 익스프레스 ROS는 단백질 MG를 계산하는 표준 곡선을 참조하여, 제조업체의 지시에 따라 단백질 농도를 비색 정량 키트를 이용하여 웰에 남아있는 세포의 단백질 농도에 대하여 값.

결과

670nm의 파장에서 전달되는 빛의 출력은 이전에 생체 내 (0.3 J / cm ^{2) (20)에} 유익한 것으로 도시 670nm 광의 도즈 포괄 플루 언스의 범위로 셀을 조사하기 위해 감광 필터를 사용하여 보정 하였다. 증가 된 광원의 앞에 중성 밀도 필터의 개수, 강도 (W / m ²⁾ 이하 광 표적 영역에 전달할 수 있도록, 감소 하였다. 표 1은 파장 필터 장착 광원으로부터 발생 670nm 광의 교정 데이터...

토론

우리는 성공적이 R / NIR-LT 시험관 최적화 연구기구를 제공하기 위해 정밀한 보정 광 전송 시스템을 채택했다. R의 파장 및 강도 파라미터 / NIR-LT는이 시스템을 이용하여 정확하고 효율적으로 조작 될 수있다. ROS 테스트 세포 유형에서 제공되는 파장과 투여 량 감소되지 않았다하더라도 우리는 세포 죽음으로 이어질하지 않은 세포의 빛 치료를 설립했다. 670nm (20.11W / m ^2)에서 현재 시?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B