بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

المستخفيات هو عدوى تهدد الحياة التي تسببها الفطريات المسببة للأمراض من جنس المستخفية. تحدث العدوى عند استنشاق جراثيم، والتي هي قادرة على تكرار في الرئة العميقة. البلعمة من المستخفية بواسطة الضامة هي واحدة من الطرق أن هذا المرض هو قادرة على الانتشار في النظام العصبي المركزي لتسبب التهاب السحايا والدماغ القاتل. لذلك، ودراسة العلاقة بين المستخفية والضامة مهمة لفهم تطور العدوى. تصف هذه الدراسة بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة البلاعم العدوى التي كتبها C. الأدعومية في المختبر. باستخدام هذا البروتوكول، ودرس دور الجامدة المضيف على التفاعلات المضيف الممرض. استخدمت سيكلودكسترين (MCD) في استنزاف الكولسترول من الفئران شبكية ساركوما مثل بلعم خط الخلية J774A.1 - تركيزات مختلفة من الميثيل. وأكد استنزاف الكولسترول وكميا باستخدام كل من المتوفره تجاريامواقع الحكومة الإلكترونية عدة الكولسترول الكمي وطبقة رقيقة اللوني. تم تنشيط خلايا الكوليسترول المنضب باستخدام Lipopolysacharide (LPS) والانترفيرون غاما (IFNγ) وإصابة مع opsonized الأجسام المضادة المستخفية المورمة البرية من نوع الخلايا H99 في نسبة المستجيب إلى الهدف 1: 1. تم رصد الخلايا المصابة بعد 2 ساعة من الحضانة مع C. تم حساب الأدعومية ومؤشر على البلعمة. أدى استنزاف الكولسترول في انخفاض كبير في مؤشر البلعمة. البروتوكولات قدمت وتقدم طريقة مريحة لمحاكاة بدء عملية العدوى في بيئة المختبر ودراسة دور تكوين الدهون المضيف على العدوى.

Introduction

البلعمة هي العملية التي يتم المنضوية كيانات خارج الخلية من قبل الخلايا المضيفة. بل هو سلاح أساسي في ترسانة النظام المناعي للدفاع ضد مسببات الأمراض، ولكن قد تكون في كثير من الأحيان تخريب العملية التي مسببات الأمراض للسماح لاستيعاب ونشر في جميع أنحاء الجسم ^1. وبوساطة البلعمة من قبل العديد من الأحداث يشير إلى أن يؤدي إلى التعلق والغمر عن طريق إعادة ترتيب الهيكل الخلوي الخلية المضيفة. البالعات "الفنية" قادرة على إدراك وربط opsonins على سطح الممرض الغازية للإشارة لمرفق وتشكيل أقدام صفاحية التي تبتلع الممرض وتشكيل يبلوع ^2. ومن بين ما يسمى البالعات 'المهنية' هم الضامة. الضامة هي خلايا متخصصة للغاية التي تنفذ مهام الحماية التي تشمل السعي إلى القضاء على المرض والعوامل المسببة، وإصلاح الأنسجة التالفة، والتوسط من الالتهاب، ومعظمهذه من خلال عملية البلعمة ^1،2.

المستخفية المورمة هي الأنواع من الخميرة الممرضة التي تسبب مرض خطير يعرف باسم المستخفيات. يتم استنشاق الجراثيم المستخفية من قبل المضيف ويؤدي الى عدوى رئوية التي عادة ما تكون أعراض. ويعتقد أن التعرض منتشر للغاية. وقد أظهرت عينة من 61 طفلا من الأمراض المعدية للأطفال عيادة في مركز مستشفى برونكس لبنان وجدت أن كل الذين شملهم الاستطلاع كان الأجسام المضادة للglucuronoxylomannan السكاريد بالمستخفيات وغيرها من الدراسات انتشار في كل من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) غير مصاب والبالغين المصابين ^{3، 4.} الضامة السنخية هي الخط الأول للاستجابة للعدوى رئوية واضح في معظم الحالات بنجاح الممرض. ومع ذلك، في الأفراد المناعة (المرضى على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية والإيدز) الخميرة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الضامة. في هذهالحالات، يمكن للالضامة بمثابة محراب للتكرار من مسببات المرض ويمكن أن تسهل نشرها على الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث يصبح المرض قاتلا ^5-8. ويعتقد أن الضامة حتى يمكن تقديم الخميرة مباشرة في السحايا، مما يساعد الخميرة لعبور حاجز الدم في الدماغ عن طريق "حصان طروادة" نموذج ^{3،9 - 11.} وبالتالي، فمن المهم أن نفهم عملية البلعمة والعوامل التي تؤثر عليه، وخاصة في الالتهابات بالمستخفيات.

العمل السابق في أنظمة الممرض أخرى تشير إلى الكولسترول والدهون الطوافات التي شكلتها الكولسترول وجود دور هام في البلعمة ^12-15. الكولسترول هو النوع الأكثر وفرة الدهون في خلايا الثدييات، وتضم 25 - 50٪ من غشاء الخلية الثدييات ^16. وقد وجد أن تلعب دورا في تحوير BIOPخصائص hysical الأغشية عن طريق تغيير صلابة من ^17. الكولسترول والإسفنجية تشكل معا microdomains الدهون داخل غشاء المعروفة باسم الطوافات الدهنية. تم العثور على الطوافات الدهنية أن تشارك في تشكيل caveolae، فضلا عن توفير مجال معزولة لأنواع معينة من إشارات ^16-18. نظرا لصغر حجمها، فمن الصعب لدراسة الطوافات الدهنية في الجسم الحي. طريقة واحدة مفيدة لدراسة دور الطوافات الدهنية هو تغيير ناخبيهم. الميثيل-β-سيكلودكسترين (MβCD) هو مركب التي تم العثور عليها في استنزاف الكولسترول من الأغشية الثدييات ويستخدم عادة لدراسة دور الطوافات الدهنية ^18.

في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة لاستنزاف الكولسترول من أغشية الخلية المضيفة وقياس تأثير استنزاف على قدرة الخلايا المضيفة في phagocytose C. الأدعومية في المختبر. هذا الإجراء يجعل من استخدام زراعة الخلايا TECHNIQUES على البلاعم خلد مثل خط الخلية (J774A.1) كنموذج للعدوى. تم انجازه استنزاف الكولسترول عن التعرض لMβCD، والذي له نواة مسعور محدد لحجم الجامدة وغير قادرة على بمثابة بالوعة للالكولسترول لاستدراجه للخروج من غشاء ^19. وقد تم قياس نضوب الكولسترول كميا باستخدام عدة المتاحة تجاريا ونوعيا باستخدام بلي-داير استخراج الدهن تعديل تليها طبقة رقيقة اللوني (TLC) ^20. . تم قياس البلعمة عن طريق إصابة خط الخلية مع ثقافة الخميرة opsonized مختلطة مع كوكتيل من انترفيرون γ وlipopolysaccharide في تفعيل الضامة وopsonized المستخفية باستخدام glucuronoxylomannan (GXM) الأجسام المضادة ^21-23. تلطيخ والتجارب المجهري سمحت لرؤية الخلايا وحساب مؤشر أكلة لتقييم درجة البلعمة. أخذت معا، وهذا البروتوكول دescribes طريقة الأساسي الذي يدمج تغيير تركيبة الدهون مع عملية الفسيولوجية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. الكولسترول استنفاد الخلايا J774A.1 مع MβCD

1. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 ⁵ J774A.1 الخلايا الشبيهة بلعم لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S). احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ O / N.
2. إزالة وسائل الاعلام من أحادي الطبقة الخلية وغسل الخلايا مرتين مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تم تصفيتها أو تعقيمها.
3. إضافة 200 ميكرولتر من حل MβCD في تركيز (10 ملم أو 30 ملم في PBS) أو برنامج تلفزيوني 1X على النحو المرغوب فيه السيطرة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C مع اهتزاز. إزالة طاف والاحتياطي في RT للتحليل الكمي مع عدة المتاحة تجاريا باتباع الإجراء على الفور.
4. غسل الخلايا مرتين إلى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X أو المصل DMEM مجانا وتواصل مع العدوى أو ليز الخلايا عن طريق pipettiنانوغرام مرتين إلى ثلاث مرات مع H ₂ O منزوع الأيونات لتحليل مع طبقة رقيقة اللوني أو مع عدة.
   ملاحظة: بعد نضوب الكولسترول والمتاحة تجاريا عدة الكولسترول الكمي يمكن استخدامها. انظر القسم المواد للحصول على التفاصيل. اتبع تعليمات الشركة الصانعة كما هو مكتوب.

2. مراقبة من الكولسترول المحتوى من قبل اللوني طبقة رقيقة (TLC)

1. غسل خزان TLC مرتين مع الأسيتون ومرة ​​واحدة مع محلول الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم). تشبع الخزان مع الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم) حل وترك O / N.
   ملاحظة: يجب دائما العضوية المذيبات أن تستخدم تحت غطاء الدخان لمنع استنشاق بخار. يجب ارتداء القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات. حمض الخليك هو حمض قوي وينبغي أن تستخدم بحذر.
2. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 ⁶ J774A.1 مثل بلعم الخلايا لكل بئر على م 6-جيدالوحة الثقافة ليرة لبنانية في حجم 5 مل من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ O / N.
3. المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4، استبدال 1 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر.
4. إضافة 500 ميكرولتر من التربسين-EDTA إلى كل بئر، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية، وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية.
5. نقل إلى أنبوب microfuge وإضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S.
6. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ج وإزالة طاف.
7. إضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S إلى الخلية بيليه و resuspend بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
8. إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا والعد الخلايا على عدادة الكريات. تطبيع تركيزات خلية من كل عينة وإضافة عدد متساو من الخلايا لأنابيب زجاجية.
   ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن للمرءاختيار الجمع بين الخلايا من مجموعات العلاج نفسه للحصول على أكثر تركيزا النهائي استخراج الدهون.
9. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT وإزالة وسائل الإعلام.
10. إضافة 2 مل من الميثانول ودوامة. ثم، إضافة 1 مل من الكلوروفورم ودوامة. التحقق من حالة المرحلة للتأكد من الحل في الطور.
    ملاحظة: أنابيب يمكن تخزينها في 4 درجات CO / N.
11. أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة في RT ونقل طاف لأنبوب جديد
12. إضافة 1 مل إضافية من كلوروفورم تليها 1 مل من درهم ₂ O. دوامة مرتين لمدة 30 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
13. تزن أنبوب زجاجي على ميزان حساس واستخدام ماصة باستير الزجاج لنقل المرحلة الدنيا في أنبوب زجاجي من الوزن المعروفة.
14. تجف أسفل الدهون في المبخر الطرد المركزي حتى تجف (حوالي 2 ساعة). تزن أنبوب مع الدهون المجففة وحساب الوزن الدهون الجاف.
    ملاحظة: الدهون الجافة يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لأداء TLC.
15. تمييع الدهون المجففة في الكلوروفورم يكفي لتطبيع تركيز الدهون (عادة 20-50 ميكرولتر) وتحميل 20 ميكرولتر من الدهون المخففة على TLC لوحة السيليكا. تحميل 20 ميكروغرام من الكولسترول مخففة في 20 ميكرولتر من كلوروفورم كمعيار.
16. إضافة المجففة لوحة TLC إلى خزان TLC المشبعة والسماح مذيب للهجرة يصل إلى 1 سم قبل وحة الحافة. إزالة TLC لوحة من دبابات واتركه حتى يجف حوالي 5 دقائق.
17. تصور الدهون عن طريق وضع في خزان بخار اليود للتحقق الهجرة. إزالة البقع والسماح لتتلاشى لحوالي 10 - 15 دقيقة تحت غطاء محرك السيارة.
    ملاحظة: اليود هو خطر استنشاق. استخدام دائما تحت غطاء الدخان.
18. يعد حل لتلطيخ محايد الدهون عن طريق الجمع بين 60 مل من الميثانول مع 60 مل من H ₂ O منزوع الأيونات، 4 مل من حمض الكبريتيك، و 630 ملغ من كلوريد المنغنيز.
19. بعناية وببطء تراجع لوحة TLC في حل الدهون تلطيخ محايد في علبة وازالة دون النزع قبالة السيليكا لآير.
    ملاحظة: الحل الدهون تلطيخ محايد يمكن إعادة استخدامها عدة مرات وبحيث يمكن استرجاعها من علبة وضعها مرة أخرى في زجاجة لاستخدامها لاحقا.
20. تسمح لوحة لتجف تحت غطاء محرك السيارة في RT حتى اختفت جميع فقاعات. تسخين لوحة TLC على مجموعة كتلة الحرارة إلى 160 درجة مئوية، وشار إلى اللون المطلوب.
    ملاحظة: برنامج قياس كثافة مثل LS الرؤية الأشغال يمكن استخدامها لقياس العصابات المتفحمة لمقارنة عينات الدهون.

3. إصابة الضامة مع C. الأدعومية (H99)

1. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 خلايا تشبه البلاعم ⁵ لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2، 5٪ CO ₂ O / N.
   ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم العدوى في الزجاج القاع أطباق مبائر لتسهيل التصوير. لا تزال جميع المبالغ نفسها.
2. تنمو ثقافة C. الأدعومية (H99)، فحقن 10 مل من YNB مع مستعمرة واحدة تم الحصول عليها من لوحة ضرب واحتضان أنه O / N عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز.
3. غسل والاعتماد C. الأدعومية (H99) الخلايا.
   1. الطرد المركزي C. الأدعومية O / N الثقافة في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
   2. إزالة وسائل الاعلام وتجاهل. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
   3. إزالة برنامج تلفزيوني ويغسل مع 5 مل من تصفيتها برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر.
   4. إزالة PBS و resuspend في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
   5. جعل التخفيف المتسلسل في برنامج تلفزيوني للحصول على 1: 500 التخفيف من ثقافة غسلها.
      1. إضافة 100 ميكرولتر من العينة الأصلية إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول 1:10 التخفيف.
      2. إضافة 100 ميكرولتر 1:10 عينة المخفف إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 100 التخفيف.
      3. إضافة 200 ميكرولتر من 1: عينة المخفف 100 إلى 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 500 dilutiفي
   6. يستغرق 10 ميكرولتر من 1: 500 التخفيف والاعتماد على عدادة الكريات لحساب عدد من الخلايا.
4. يعد حل يعملون لتفعيل الضامة وopsonizing C. الأدعومية.
   1. تمييع LPS وIFNγ 100X من الحلول الأسهم من خلال إضافة 10 ميكرولتر إلى 990 ميكرولتر.
      وتستخدم LPS وIFNγ لتعزيز امتصاص أكلة ولكن ليست مطلوبة لالبلعمة: ملاحظة. إذا كان هناك مصلحة في النشاط فطريات الضامة، نفذ تفعيل O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قبل الإصابة.
   2. في عينة الجمع بين 7.5 ميكرولتر من LPS المخفف، 1.25 ميكرولتر من المخفف IFNγ، 1.25 ميكرولتر من GXM الأجسام المضادة وحجم C. ثقافة الأدعومية الذي يعطي 1.25 × 10 ⁵ الخلايا. جعل حجم ما يصل الى 250 ميكرولتر مضروبا عدد العينات مع DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S.
   3. دوامة واحتضان الحل لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز.
      ملاحظة:نضوب الكولسترول (الخطوات 1،2-1،4) يمكن أن يتم بالتزامن مع خطوة طهاية. تأكد لعلاج الضامة قبل الجمع بين حل العاملة، حيث أن خلايا opsonized يجب أن تستخدم على النحو الأمثل لم يعد من 20 دقيقة بعد الحضانة خطوة 3.4.3.
5. إصابة الضامة
   1. الضامة غسل مرتين مع المصل DMEM الحرة وإضافة 200 ميكرولتر من opsonized C. حل الأدعومية العمل على كل بئر.
   2. احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
6. الإصلاح وصمة عار الخلايا
   1. إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا 2 مرات مع DMEM.
   2. الهواء الجاف أحادي الطبقة خلية لمدة 10 دقيقة وإضافة 200 ميكرولتر من الميثانول الجليد الباردة لإصلاح الخلايا.
   3. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT وإزالة أي الميثانول المتبقية.
   4. إضافة 200 ميكرولتر من 10X بالغيمزا واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
   5. يغسل 2-3 مرات مع الماء منزوع الأيونات وO جاف / N مع غطاء قبالة.
      ملاحظة: التصوير يمكن القيام به في اليوم التالي أو ما يصل إلى followi الأسبوعنانوغرام تلطيخ.
7. تصور وعدد
   1. باستخدام المجهر، عد 300 خلية لكل نقطة بيانات (إذا كان هناك 2 من نفس المعاملة العد 150 لكل بئر) ولاحظ عدد من الضامة المصابة وعدد الخلايا المستخفية اجتاحت.
      ملاحظة: لضمان حتى أخذ العينات في استخدام نقطة بيانات لوحات 2 في حالة، واختيار 3 مناطق غير متداخلة في لوحة وتعول 50 خلية في المنطقة.
   2. حساب مؤشر أكلة بضرب النسبة المئوية للالضامة المصابة حسب متوسط ​​عدد C. الأدعومية في البلاعم. تطبيع مؤشر أكلة بالإعراب عن القيم كنسبة مئوية من برنامج تلفزيوني 1X تعامل السيطرة. بعد عدة محاكمات حساب القيمة المتوسطة والانحراف المعياري للمتوسط ​​لتحديد الاتجاهات في مؤشر البلعمة. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية.
   3. اتخاذ الميكروسكوب من الخلايا في 1،000X أو 400X التكبير.

4. التريبان الأزرق الفحص

1. في خزانة معقمة للسلامة الأحيائية، والبذور 10 ⁶ خلايا تشبه البلاعم لكل بئر على 6 جيدا لوحة الثقافة خلية في حجم 5 مل من Dulbecco والحد الأدنى من المتوسط ​​ضروري (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين . احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ O / N.
2. المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4 استبدال 2 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر.
   ملاحظة: تأكد من تضمين عنصر تحكم تعامل مع برنامج تلفزيوني 1X فضلا عن التحكم التي يتم كشط قبل أي علاج.
3. إضافة 500 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية. نقل إلى أنبوب microfuge وتعليق الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
4. إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا وصمة عار مع 1 ميكرولتر من 4٪ التريبان الأزرق.
5. عد الخلايا على عدادة الكريات وحساب الجدوى باستخدام المعادلة التالية:٪ الجدوى = [1 - (خلايا الأزرق / مجموع الخلايا)]س 100. القيم تطبيع إلى عنصر التحكم الذي كان دون علاج. بعد عدة محاكمات حساب قيمة المتوسط ​​والانحراف المعياري لتحديد الاتجاهات في قدرتها على البقاء. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الكولسترول استنفاد

تحليل طاف محفوظة في الخطوة 1.3 من البروتوكول باتباع إرشادات الشركة المصنعة في Amplex الأحمر الكولسترول الفحص عدة غلة تركيز مرتفع من الكولسترول في عينة MβCD تعامل على أنها مقارنة بالكنترول برنامج تلفزيوني 1X. اعتمادا ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في العمل مع هذا البروتوكول من المهم الحصول على عدد خلايا دقيقة عندما تصفيح خلايا الثدييات وopsonizing C. خلايا الأدعومية. هذا يقلل من التباين بين التجارب ويضمن ودقيقة 1: 1 هدف إلى نسبة المستجيب طوال فترة الدراسة. فمن الأهمية بمكان لتنسيق توقيت استنزاف الكولسترول و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Class II type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	3460009
J774A.1 cell line	ATCC	TIB-67	Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus	Gibco	10082-147	Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator	Fisher Scientific		Model # 3530
96-Well culture dish	Corning Inc. Costar	3595
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma Life Science	C4555-10G	Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations
Orbital shaker	Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Life Technologies Molecular Probes	A12216	All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax microplate reader	Molecular Devices		Model F5
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498-4L
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC Paper	Whatman	3030917	Cut down to size needed for TLC tank
Fume hood			Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards
6-Well plate	Corning Inc. Costar	3506
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Cell scraper	Corning Inc. Costar	3010
Hemocytometer	Hausser Scientific	1490
Centrifuge	Beckman Coulter		Model Alegra x-30R
Votex mixer	Fisher Scientific	12-812
Balance	Mettler Toledo		Model # MS104S meaures down to 0.1 mg
Glass Pasteur pipette	Fisherbrand	13-678-20A
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000
SpeedVac concentrator	Thermo Scientific		Model # SPD2010
Petroleum ether	Fisher Scientific	E139-1
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone	Analytical Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
Iodine chips	Sigma-Aldrich	376558-50G
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging System	Ultra-Violet Products Ltd.		Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass bottom confocal dish	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			Obtained from Duke University Medical Center
YNB	BD	239210	See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide	Sigma	L4391-1MG	Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma	Sigma	I4777	Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)			Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml
Giemsa	MP Biomedicals	194591	Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope	Zeiss		Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images