Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Riepilogo

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

Criptococcosi è un'infezione pericolosa per la vita causata da funghi patogeni del genere Cryptococcus. L'infezione si verifica su inalazione di spore, che sono in grado di replicare nel polmone profondo. Fagocitosi di Cryptococcus dai macrofagi è uno dei modi in cui la malattia è in grado di diffondere nel sistema nervoso centrale per causare meningoencefalite letale. Pertanto, lo studio dell'associazione tra Cryptococcus e macrofagi è importante per comprendere la progressione dell'infezione. Il presente studio descrive un protocollo step-by-step per studiare macrofagi infettività da C. neoformans in vitro. Usando questo protocollo, il ruolo di steroli ospitanti sulle interazioni ospite-patogeno è studiato. Diverse concentrazioni di metile - ciclodestrina (MCD) sono stati usati per esaurire il colesterolo dal murino reticolo sarcoma macrofago-come linea cellulare J774A.1. Colesterolo esaurimento è stato confermato e quantificato utilizzando sia commercialmente available kit di colesterolo quantificazione e cromatografia su strato sottile. Cellule colesterolo impoverito sono stati attivati ​​mediante Lipopolysacharide (LPS) e interferone gamma (IFNγ) e infettati con anticorpi opsonizzati Cryptococcus neoformans wild-type cellule H99 ad un rapporto effettore-to-target di 1: 1. Le cellule infette sono stati monitorati dopo 2 ore di incubazione con C. neoformans e il loro indice di fagocitosi è stato calcolato. Colesterolo deplezione determinato una significativa riduzione dell'indice fagocitaria. I protocolli presentati offrono un metodo conveniente per imitare l'avvio del processo di infezione in un ambiente di laboratorio e studiare il ruolo della composizione lipidica host infettività.

Introduzione

Fagocitosi è un processo attraverso il quale entita extracellulari vengono internalizzati dalle cellule ospiti. Si tratta di un'arma fondamentale nell'arsenale del sistema immunitario a difendersi contro gli agenti patogeni, ma il processo può spesso essere sovvertita da agenti patogeni per consentire l'internalizzazione e la diffusione in tutto il corpo ^1. Fagocitosi è mediata da diversi eventi di segnalazione che si traducono in attacco e fagocitazione via riarrangiamenti del citoscheletro della cellula ospite. Fagociti 'professionali' sono in grado di riconoscere e legarsi a opsonine sulla superficie del patogeno invasore di segnalare per l'attacco e la formazione di lamellipodia, che fagocitare l'agente patogeno e formano un phagosome ^2. Tra i cosiddetti fagociti 'professionali' sono i macrofagi. I macrofagi sono cellule altamente specializzate che svolgono funzioni di protezione che includono ricercare e eliminare gli agenti patogeni, riparare tessuti danneggiati, e mediare l'infiammazione, la maggior parte deiquesti attraverso il processo di fagocitosi ^1,2.

Cryptococcus neoformans è una specie di lievito patogeno che provoca una grave malattia nota come Criptococcosi. Spore Cryptococcus inalazione dall'host e determinano un'infezione polmonare che di solito è asintomatica. Si ritiene che l'esposizione è estremamente diffuso; un campione di 61 bambini dalle malattie infettive Pediatric Clinic presso il Centro Ospedaliero Bronx-Lebanon trovato che tutti gli intervistati avevano anticorpi al glucuronoxylomannan polisaccaride criptococcica e altri studi hanno dimostrato la prevalenza sia il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) non infetto e adulti infetti ^{3, 4.} macrofagi alveolari sono la prima linea di risposta all'infezione polmonare e in molti casi con successo chiaro patogeno. Tuttavia, in soggetti immunocompromessi (pazienti ad esempio, HIV e AIDS), il lievito è in grado di sopravvivere all'interno dei macrofagi. In questicasi, i macrofagi possono servire come una nicchia per la replicazione del patogeno e possono facilitare la sua diffusione al sistema nervoso centrale (CNS) se la malattia diventa fatale ^{5 - 8.} Si pensa che i macrofagi possono anche consegnare il lievito direttamente nelle meningi, aiutando il lievito di attraversare la barriera emato-encefalica tramite il modello "cavallo di Troia" ^{3,9 - 11.} Pertanto, è importante comprendere il processo di fagocitosi ed i fattori che incidono su di esso, specialmente nelle infezioni da criptococco.

Impieghi precedenti in altri sistemi patogeni puntare colesterolo e lipidi zattere formate da colesterolo come aventi un ruolo importante da svolgere in fagocitosi ^12-15. Il colesterolo è la specie di lipidi più abbondante in cellule di mammifero e comprende 25 - 50% della membrana cellulare di mammifero ^16. Si è trovato un ruolo nella modulazione della BIOPproprietà hysical di membrane di cambiare la loro rigidità ^17. Colesterolo e sfingolipidi insieme formano microdomini lipidici all'interno della membrana nota come zattere lipidiche. Raft lipidici sono stati trovati ad essere coinvolti nella formazione di caveolae, oltre a fornire un dominio isolato per alcuni tipi di segnalazione ^{16 - 18.} A causa delle loro piccole dimensioni, è difficile studiare zattere lipidiche in vivo. Un modo utile per studiare il ruolo dei raft lipidici è quella di modificare i loro elettori. Metil-β-ciclodestrina (MβCD) è un composto che è stato trovato per esaurire il colesterolo dalle membrane mammiferi ed è comunemente utilizzato per studiare il ruolo dei raft lipidici ^18.

In questo protocollo, presentiamo un metodo per esaurire il colesterolo dalle membrane della cellula ospite e quantificare l'effetto della deplezione sulla capacità delle cellule ospiti di fagocitare C. neoformans in vitro. Questo procedimento si avvale di coltura cellulare techniqUES su un macrofago immortalato come linea cellulare (J774A.1) come modello di infezione. Colesterolo deplezione stato compiuto mediante esposizione a MβCD, che ha un core idrofobico specifica alla dimensione di steroli ed è in grado di agire come un dissipatore per il colesterolo per disegnare fuori della membrana ^19. Colesterolo esaurimento è stata misurata quantitativamente usando un kit disponibile in commercio e qualitativamente con una estrazione del grasso Bligh-Dyer modificato seguita da cromatografia su strato sottile (TLC) ^20. . Fagocitosi è stata misurata infettando la linea cellulare con una cultura di lievito opsonizzati mescolato con un cocktail di interferone-γ e lipopolysaccharide per l'attivazione dei macrofagi Cryptococcus stata opsonizzati utilizzando un anticorpo glucuronoxylomannan (GXM) ^{21 - 23.} Colorazione e esperimenti di microscopia consentito per la visualizzazione delle cellule e calcolo dell'indice fagocitaria per valutare il grado di fagocitosi. Nel loro insieme, questo protocollo dEscribes un metodo di base che integra l'alterazione della composizione lipidica con un processo fisiologico.

Protocollo

1. Colesterolo esaurimento delle Cellule J774A.1 con MβCD

1. In un armadio biosicurezza sterili, 10 ⁵ J774A.1 macrofagi come seme per bene su una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti in 200 ml di Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (P / S). Incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ O / N.
2. Rimuovere i supporti dal monostrato cellulare e lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS), che è stata filtrata o in autoclave.
3. Aggiungere 200 ml di soluzione MβCD alla concentrazione desiderata (10 mM mM o 30 in PBS) o PBS 1x come controllo e incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione. Rimuovere il surnatante e riserva a RT per l'analisi quantitativa con kit disponibile in commercio subito dopo la procedura.
4. Lavare le cellule due o tre volte con PBS 1x o siero DMEM gratuito e continuare con infezione o lisi delle cellule di pipetting due o tre volte con H ₂ O deionizzata per l'analisi mediante cromatografia su strato sottile o con un kit.
   NOTA: Dopo colesterolo deplezione un kit disponibile in commercio colesterolo quantificazione può essere utilizzato. Vedere la sezione Materiali per i dettagli. Seguire le istruzioni del produttore come scritto.

2. Osservazione di colesterolo contenuti da cromatografia su strato sottile (TLC)

1. Lavare un serbatoio TLC due volte con acetone e una volta con una soluzione di etere di petrolio: etere dietilico: acido acetico (65: 30: 1 in volume). Saturare il serbatoio con l'etere di petrolio: etere dietilico: acido acetico (65: 30: 1 in volume) e lasciare soluzione O / N.
   NOTA: Organic solventi devono essere utilizzati sotto una cappa per evitare l'inalazione di vapori. Guanti e camice da laboratorio devono essere indossati in ogni momento. L'acido acetico è un acido forte e deve essere usato con cautela.
2. In un armadio biosicurezza sterile, seme 10 ⁶ J774A.1 i macrofagi per bene su un ce 6-benell piastra di coltura in un volume di 5 ml di DMEM calda supplementato con 10% FBS e 1% P / S. Incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ O / N.
3. Esaurire macrofagi di colesterolo seguendo i passaggi 1,2-1,4, sostituendo 1 ml per 200 microlitri se del caso per tenere conto delle dimensioni ben più grandi.
4. Aggiungere 500 ml di tripsina-EDTA ad ogni pozzetto, incubare per 3 minuti a 37 ° C, e raschiare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare.
5. Trasferire in una provetta per microcentrifuga e aggiungere ulteriori 500 ml di DMEM caldo supplementato con 10% FBS e 1% P / S.
6. Spin le cellule per 5 minuti a 300 xg e rimuovere il surnatante.
7. Aggiungere altri 500 ml di DMEM supplementato con calda 10% FBS e 1% P / S al pellet e risospendere accuratamente pipettando su e giù.
8. Rimuovere 10 ml di cellule e contare le cellule su un emocitometro. Normalizzare la concentrazione cellulare di ciascun campione e aggiungere un numero uguale di cellule di tubi di vetro.
   NOTA: A questo punto, si puòscegliere di combinare cellule dagli stessi gruppi di trattamento per ottenere un estratto lipidico finale più concentrato.
9. Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere i supporti.
10. Aggiungere 2 ml di metanolo e vortex. Quindi, aggiungere 1 ml di cloroformio e vortex. Controllare lo stato di fase per assicurarsi che la soluzione in monofasica.
    NOTA: tubi può essere conservato a 4 ° CO / N.
11. Centrifugare a 1700 xg per 10 minuti a RT e trasferire il surnatante in una nuova provetta
12. Aggiungere un ulteriore 1 ml di cloroformio seguita da 1 ml di dH ₂ O. Vortex due volte per 30 sec. Centrifugare a 1700 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
13. Pesare un tubo di vetro ad una bilancia sensibile e utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per trasferire la fase inferiore nel tubo di vetro del peso noto.
14. Asciugare giù lipidi in un evaporatore centrifuga fino a secco (circa 2 ore). Pesare tubo con lipidi secchi e calcolare il peso a secco di lipidi.
    NOTA: lipidi secco può essere memorizzato in -20 ° C fino al momento di effettuare TLC.
15. Diluire lipidi essiccati in cloroformio sufficiente per normalizzare la concentrazione di lipidi (di solito 20 - 50 microlitri) e 20 microlitri di carico del lipide diluito su una piastra di TLC silice. Carico 20 mg di colesterolo diluito in 20 ml di cloroformio come standard.
16. Aggiungere piastra TLC essiccato al serbatoio TLC saturi e consentire solvente migrare fino a 1 cm prima piastra di bordo. Rimuovere la piastra TLC dal serbatoio e lasciarlo asciugare circa 5 min.
17. Visualizza lipidi mettendo in un serbatoio vapori di iodio per controllare la migrazione. Rimuovere e consentono punti di dissolvenza per circa 10 - 15 minuti sotto il cofano.
    NOTA: Lo iodio è un pericolo per inalazione. Utilizzare sempre sotto una cappa aspirante.
18. Preparare una soluzione per la colorazione lipidi neutri combinando 60 ml di metanolo con 60 ml di H ₂ O deionizzata, 4 ml di acido solforico, e 630 mg di cloruro di manganese.
19. Lentamente e con cautela immergere la piastra TLC nella soluzione lipidica colorazione neutra in un vassoio e rimuovere senza desquamazione della silice layer.
    NOTA: La soluzione lipidica colorazione neutra può essere riutilizzato più volte e in modo che possa essere recuperato dal vassoio e rimesso in una bottiglia per un uso successivo.
20. Lasciare piastra asciugare sotto il cofano a RT finché è scomparsa tutte le bolle. Riscaldare la piastra TLC su un set blocco termico a 160 ° C e char al colore desiderato.
    NOTA: Un programma densitometria come Vision Lavori LS può essere utilizzato per quantificare le bande carbonizzati per confrontare i campioni di lipidi.

3. L'infezione dei macrofagi con C. neoformans (H99)

1. In un armadio biosicurezza sterili, semi di 10 celle ⁵ macrofagi come per bene su una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti in 200 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e 1% P / S. Incubare a 37 ° C, 5% CO _2, 5% CO ₂ O / N.
   NOTA: L'infezione può essere effettuata anche in fondo di vetro piatti confocale per l'imaging più facile; tutti gli importi rimangono gli stessi.
2. Crescere una cultura di C. neoformans (H99)inoculando 10 ml di YNB con una colonia ottenuto da una piastra colpito e incubando è O / N a 30 ° C con agitazione.
3. Lavare e contare C. neoformans (H99), le cellule.
   1. Centrifuga C. cultura neoformans O / N a 1.700 xg per 10 min a 4 ° C.
   2. Rimuovere il supporto e scartare. Lavare le cellule con 5 ml di 1x PBS. Centrifugare a 1.700 xg per 10 min a 4 ° C.
   3. Rimuovere PBS e lavare con 5 ml di filtrato 1x PBS. Centrifugare a 1.700 xg per 10 min a 4 ° C. Ripetere questa operazione altre 2 volte.
   4. Rimuovere PBS e risospendere in 5 ml di 1x PBS.
   5. Fare diluizioni seriali in PBS per ottenere una diluizione 1: 500 della cultura lavato.
      1. Aggiungere 100 microlitri del campione originale 900 microlitri di PBS 1x per ottenere una diluizione 1:10.
      2. Aggiungere 100 ml di 01:10 campione diluito a 900 ml di 1x PBS per ottenere una diluizione 1: 100.
      3. Aggiungere 200 ml di 1: campione diluito 100 a 800 ml di PBS 1x per ottenere un 1: 500 dilutisu
   6. Prendere 10 ml di diluizione 1: 500 e contare su emocitometro per calcolare il numero di cellule.
4. Preparare soluzione di lavoro per l'attivazione dei macrofagi e opsonizzare C. neoformans.
   1. Diluire LPS e IFNγ 100x di soluzioni di riserva con l'aggiunta di 10 ml a 990 ml.
      NOTA: LPS e IFNγ vengono utilizzati per migliorare l'assorbimento dei fagociti, ma non sono necessari per la fagocitosi. Se c'è un interesse per l'attività fungicida dei macrofagi, effettuare l'attivazione O / N a 37 ° C con agitazione prima dell'infezione.
   2. Per esempio combinano 7,5 ml di LPS diluito, 1,25 ml di IFNγ diluita, 1,25 ml di anticorpi GXM e il volume del C. cultura neoformans che dà 1,25 x 10 ⁵ cellule. Portare il volume fino a 250 ml, moltiplicato per il numero di campioni con DMEM supplementato con 10% FBS e 1% P / S.
   3. Vortex e incubare soluzione per 20 minuti a 37 ° C con agitazione.
      NOTA:Colesterolo esaurimento (i passaggi 1,2-1,4) può essere fatto in concomitanza con la fase di opsonizzazione. Assicurati di trattare macrofagi prima di combinare la soluzione di lavoro, in quanto le cellule opsonizzati devono essere utilizzati in modo ottimale non più di 20 minuti dopo la fase di incubazione 3.4.3.
5. Infettare macrofagi
   1. Macrofagi lavare due volte con siero DMEM gratuito e aggiungere 200 ml di opsonizzati C. neoformans soluzione di lavoro di ogni bene.
   2. Incubare per 2 ore a 37 ° C.
6. Fix e colorare le cellule
   1. Rimuovere i supporti e lavare le cellule 2 volte con DMEM.
   2. Far asciugare il monostrato cellulare per 10 minuti e aggiungere 200 ml di metanolo ghiaccio freddo per fissare le cellule.
   3. Incubare per 15 minuti a RT e rimuovere il metanolo rimanente.
   4. Aggiungere 200 ml di 10x Giemsa e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Lavare 2 - 3 volte con acqua deionizzata e asciugare O / N con cappuccio.
      NOTA: Imaging può essere fatto il giorno dopo o fino a una settimana following colorazione.
7. Visualizza e Conte
   1. Utilizzando un microscopio, conta 300 cellule per punto dati (se ci sono 2 dello stesso trattamento contare 150 per bene) e annotare il numero di macrofagi infetti e il numero di cellule Cryptococcus inghiottito.
      NOTA: Per assicurare anche il campionamento per use punto dati 2 piastre per condizione, selezionare 3 aree non sovrapposte per piastra e conta 50 cellule per zona.
   2. Calcolare indice phagocytic moltiplicando la percentuale di macrofagi infettati dal numero medio di C. neoformans per macrofagi. Normalizzare indice phagocytic esprimendo i valori in percentuale del 1x PBS trattati di controllo. Dopo diverse prove calcolare il valore medio e la deviazione standard della media per determinare le tendenze nell'indice fagocitosi. Utilizzare studente t-test per stabilire significatività.
   3. Prendere microscopio di cellule a 1,000X o 400X di ingrandimento.

4. Trypan Blue Assay

1. In un armadio biosicurezza sterile, sementi 10 ⁶ i macrofagi per pozzetto su una piastra di coltura cellulare 6 pozzetti in un volume di 5 ml di mezzo minimo essenziale di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale ed 1% di penicillina / streptomicina . Incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ O / N.
2. Esaurire macrofagi di colesterolo seguendo i passaggi 1,2-1,4 sostituendo 2 ml per 200 microlitri se del caso per tenere conto delle dimensioni ben più grandi.
   NOTA: Assicurarsi di includere un controllo trattato con 1x PBS, nonché un controllo che viene raschiata prima di qualsiasi trattamento.
3. Aggiungere 500 ml di 1x PBS in ciascun pozzetto e raschiare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare. Trasferire in una provetta per microcentrifuga e sospendere le cellule pipettando gentilmente su e giù.
4. Rimuovere 10 ml di cellule e macchia con 1 ml di 4% Trypan blu.
5. Contare le cellule su un emocitometro e calcolare la vitalità utilizzando la seguente equazione:% redditività = [1 - (cellule blu / cellule totali)]x 100. I valori Normalizzare al controllo che è stato non trattato. Dopo diverse prove calcolare il valore medio e la deviazione standard per determinare le tendenze in redditività. Utilizzare studente t-test per stabilire significatività.

Risultati

Colesterolo Depletion

Analisi del surnatante riservato al punto 1.3 del protocollo, seguendo le istruzioni del produttore del kit Colesterolo Assay Amplex Red produce un'elevata concentrazione di colesterolo nel campione MβCD trattati rispetto al controllo 1x PBS. A seconda del tipo di cellula e l'esaurimento colesterolo concentrazione MβCD utilizzato può variare. Per J774 trattati con MβCD 10 mM, è stato osservato un esaurimento di circa il 50%. Depletion può essere calcolato uti...

Discussione

Lavorando con questo protocollo è importante per ottenere il conteggio delle cellule accurate quando placcatura cellule di mammifero e opsonizzare C. cellule neoformans. Questo minimizza variazione tra prove e assicura un'accurata 1: 1 bersaglio rapporto effettore tutto lo studio. È anche fondamentale per coordinare la tempistica della deplezione di colesterolo e per prevenire l'infezione delle cellule di lievito o cellule opsonizzati macrofagi trattati di riposo a RT tra le procedure. Lunghi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Class II type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	3460009
J774A.1 cell line	ATCC	TIB-67	Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus	Gibco	10082-147	Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator	Fisher Scientific		Model # 3530
96-Well culture dish	Corning Inc. Costar	3595
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma Life Science	C4555-10G	Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations
Orbital shaker	Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Life Technologies Molecular Probes	A12216	All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax microplate reader	Molecular Devices		Model F5
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498-4L
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC Paper	Whatman	3030917	Cut down to size needed for TLC tank
Fume hood			Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards
6-Well plate	Corning Inc. Costar	3506
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Cell scraper	Corning Inc. Costar	3010
Hemocytometer	Hausser Scientific	1490
Centrifuge	Beckman Coulter		Model Alegra x-30R
Votex mixer	Fisher Scientific	12-812
Balance	Mettler Toledo		Model # MS104S meaures down to 0.1 mg
Glass Pasteur pipette	Fisherbrand	13-678-20A
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000
SpeedVac concentrator	Thermo Scientific		Model # SPD2010
Petroleum ether	Fisher Scientific	E139-1
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone	Analytical Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
Iodine chips	Sigma-Aldrich	376558-50G
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging System	Ultra-Violet Products Ltd.		Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass bottom confocal dish	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			Obtained from Duke University Medical Center
YNB	BD	239210	See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide	Sigma	L4391-1MG	Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma	Sigma	I4777	Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)			Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml
Giemsa	MP Biomedicals	194591	Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope	Zeiss		Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images