وكالة حماية البيئة الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية وقوع نوروفيروس في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. II. مجموع زروع الفحص الفيروسات

Summary

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Abstract

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency’s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Introduction

الفيروسات المعوية هي مجموعة متنوعة من الفيروسات التي تصيب الجهاز المعوي البشري والتي تنتقل من طريق البراز إلى الفم. هذه الفيروسات تدخل مياه السطحية والجوفية من خلال محطة معالجة مياه الصرف الصحي والنفايات السائلة خزان الصرف الصحي، والمصممة بشكل غير صحيح أو كسر خزانات الصرف الصحي، وخطوط الصرف الصحي المكسورة، وتجاوزات الصرف الصحي جنبا إلى جنب، وغيرها من نقطة وغير نقطة مصادر ^1-4. الإصابات البشرية ومرض من الفيروسات المنقولة عن طريق المياه تحدث عبر استهلاك المياه الملوثة أو تطهيرها بشكل كاف أو من خلال الترفيهية ملامسة الماء. أعراض المرض قد تنطوي خفيفة الى التهاب المعدة والأمعاء الحاد. التهاب الملتحمة؛ حمى؛ الضائقة التنفسية العليا. مرض اليد و القدم و الفم؛ التهاب عضلة القلب. التهاب السحايا العقيم. التهاب الدماغ؛ شلل؛ الإنتان ^5-8، والموت ^9،10.

وكالة حماية البيئة أسلوب 1615 يوفر إجراء لقياس المعدية جزيئات الفيروس المعوي في المياه البيئية والشرب. يمكن أن تحتوي هذه المياه علىخليط من virions المعدية وغير المعدية، ولكن الجسيمات المعدية فقط تشكل خطرا على الصحة. تفقد جزيئات الفيروس المعدية العدوى مع مرور الوقت في المياه البيئية والشرب من فقدان النزاهة البروتين قفيصة، الأضرار التي لحقت الأحماض النووية بسبب الأشعة فوق البنفسجية من أشعة الشمس، والأضرار الناجمة عن أي المطهرات التي قد تكون موجودة ^11-13. ويستند هذا الإجراء فيروس زروع الكلي المنصوص عليها في طريقة على إنتاج آثار الاعتلال الخلوي (CPE) في خط خلية بافالو الأخضر قرد الكلى (BGM). وقد تم اختيار هذا الخط الخلية بسبب الاستخدام الواسع النطاق في مجال علم الفيروسات البيئي ^14،15، على الرغم من أن تقتصر على مجموعة من أنواع الفيروسات المعدية الكشف في المقام الأول إلى بعض الفيروسات المعوية ^15. والغرض من هذه الورقة هو وصف الإجراءات طريقة 1615 لشطف من خمسة بوصة مرشحات خرطوشة كهربي، وتركيز الثانوي، وقياس مجموع الفيروسات زروع. تقييم ليوصف أسلوب شامل في Cashdollar وآخرون. ^16.

Protocol

ملاحظة: الرجاء راجع قسم المواد التكميلية S1 للحصول على قائمة من التعاريف. ووصف إجراءات ضمان الجودة المرتبطة كالة الحماية البيئية أسلوب 1615 في قسم S2 مواد تكميلية.

1. تصفية إجراء شطف

1. شطف الأول
   1. وضع 500 مل من مخزنة 1.5٪ مستخلص اللحم البقري، ودرجة الحموضة 9.0، تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة في الاسطوانة. فتح خرطوشة الإسكان مرشح وإضافة كمية كافية من استخراج لحوم البقر لتغطية فلتر كهربي تماما. استبدال غطاء فلتر السكن وتصب في استخراج لحوم البقر المتبقية في كأس معقم.
   2. بعد 1 دقيقة من وقت الاتصال، وتمرير حل استخراج لحوم البقر في السكن مع أن ما تبقى في الكأس العقيمة ببطء من خلال تصفية باستخدام وعاء الضغط أو مضخة تحوي. جمع شطافة في كوب من الزجاج 2 لتر.
2. شطف الثاني
   1. كرر الخطوات 1.1 باستخدام 500 مل إضافية من مخزنة 1.5٪ مستخلص اللحم البقريولكن زيادة وقت الاتصال في الخطوة 1.1.2 إلى 15 دقيقة.
   2. إضافة استخراج لحوم البقر من شطف الثاني إلى الدورق 2 لتر تحتوي على ذلك من شطف الأول. إضافة بقضيب المعقم في الكأس.

الإجراءات التركيز 2. التلبد العضوية

1. تعقيم مزيج من نوع ودرجة الحموضة الكهربائي مع 0.525٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 5 دقائق على الأقل. شطف الكهربائي مع العقيمة O ₂ درهم ثم dechlorinate مع 0.05 م وحمض الصوديوم. معايرة متر الرقم الهيدروجيني باستخدام الرقم الهيدروجيني 4 و 7 المعايير.
2. ضع الكأس الذي يحتوي على شطافة على طبق من ضجة. بدوره على لوحة وزيادة سرعة التحريك حتى يتم تشكيل دوامة.
3. ضبط درجة الحموضة من شطافة إلى 3.5 ± 0.1 ببطء قطرة بالإضافة الحكيمة 1.2 M حمض الهيدروكلوريك إلى شطافة. إضافة حمض الهيدروكلوريك قطرة من الحكمة لأن بالإضافة السريع ووقف نشاط الفيروس. خلال هذا الوقت شطافة سوف يصبح غائما مع بدء راسب لتشكيل.
4. الحد من جمعية مهندسي البترول الاختلاطإد إلى ضجة بطيئة ومن ثم الاستمرار في مراقبة والحفاظ على درجة الحموضة في شطافة بنسبة 3.5 ± 0.1 في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
5. صب عجلت استخراج لحوم البقر تعليق في واحد أو أكثر من الزجاجات الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2500 x ج في 4 درجات مئوية. إزالة زجاجات من أجهزة الطرد المركزي وإما نضح أو صب ببطء طاف لمنع فقدان يعجل مكعبات. تجاهل طاف.
   ملاحظة: يمكن أن يكون هناك تباين كبير بين استخراج لحوم البقر الكثير في كمية ونوعية راسب. سوف يعجل المنتجة من بعض الكثير تذوب بسرعة في حين أن من الكثير غيرها يذوب بصعوبة.
6. إضافة 30 مل من 0.15 M فوسفات الصوديوم إلى زجاجة الطرد المركزي التي تحتوي على راسب.
   1. استخدام 0.15 M فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 9.0 لرواسب من لحم البقر استخراج الكثير التي تذوب في 5 دقائق. يحرك المزيج لمدة 10 دقيقة بعد حل متعجل تماما، ثم انتقل على الفور إلى الخطوة 2.7.
   2. استخدام 0.15 M فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7،0-7،5 لجميع الرواسب الأخرى. يحرك المزيج لمدة 10-15 دقيقة إلى حل، أو لرواسب أكثر صعوبة، وكسر لهم حتى مع ملعقة معقمة، عن طريق رسم مرارا الحل صعودا وهبوطا خلال اثارة مع ماصة، عن طريق هز راسب في 160 دورة في الدقيقة على شاكر المداري، أو من خلال مزيج من هذه الإجراءات.
      ملاحظة: عند استخدام زجاجة الطرد المركزي أكثر من واحد، والجمع بين رواسب تستخدم أقل من 30 مل من فوسفات الصوديوم ثم استخدام الجزء المتبقي من 30 مل لشطف الزجاجات بعد الجمع بين الرواسب في زجاجة واحدة أو كوب.
   3. إذا كان راسب جنبا إلى جنب في زجاجة الطرد المركزي مسطحة القاع، إضافة بقضيب إلى القمقم. انتقل إلى الخطوة 2.6.5.
   4. إذا كان راسب جنبا إلى جنب في زجاجة الطرد المركزي مع قاع مخروطي الشكل، ونقل ذلك إلى كوب زجاجي صغير وإضافة بقضيب إلى الدورق.
   5. وضع زجاجة أو كوب على محرك مغناطيسي، ويحرك حتى العلاقات العامةقد حلت ecipitate تماما.
   6. إعادة تعقيم نوع الجمع بين درجة الحموضة الكهربائي مع 0.525٪ هيبوكلوريت الصوديوم وdechlorinate مع وحمض 0.05 M الصوديوم كما هو موضح في الخطوة 2.1. معايرة متر الرقم الهيدروجيني باستخدام الرقم الهيدروجيني 7 و 10 المعايير. ببطء ضبط درجة الحموضة من راسب حلت تماما إلى 9.0 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم ثم يحرك المزيج لمدة 10 دقيقة.
7. إزالة شريط ضجة وأجهزة الطرد المركزي يعجل المنحل لمدة 10 دقيقة في 4،000-10،000 x ج و 4 درجات مئوية.
8. صب بعناية طاف في كوب زجاجي من دون إزعاج بيليه. إضافة بقضيب إلى الكأس وتجاهل بيليه.
9. ضع الكأس على محرك مغناطيسي، ويحرك الحل. إضافة 1.2 انخفاض M حمض الهيدروكلوريك الحكمة لضبط درجة الحموضة إلى 7،0-7،5.
10. فلتر تعقيم طاف قبل المرور عبر فلتر تعقيم تحتوي على prefilter التي تم سابقة التجهيز مع 15 مل من 1.5٪ مستخلص اللحم البقري، 0.05 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 7،0-7،5.
11. نظام القبول عينة الفحصه (S) الحسابات:
    1. استخدام المعادلة 1 لحساب S لجميع عينات الاختبار إلا مختبر المحصنة فارغة ومختبر الكاشف فارغ،
       المعادلة 1
       حيث D (حجم عينة المياه الأصلي يعاير) هو 500 لتر للمياه الجوفية، TSV (إجمالى حجم العينة) هو حجم العينة الحقل مرت 5 بوصة خرطوشة كهربي مرشح من قبل المختبر وردت، وFCSV (النهائي المركزة حجم العينة) هو حجم التالية الترشيح في الخطوة 2.10. ويرد مثال في تكميلية القسم المواد S4.1.
    2. حساب S لمختبر المحصنة فارغة (LFB، أي لمراقبة الجودة إيجابية باستخدام كاشف المياه الصف المصنف) ومختبر الكاشف فارغ (LRB، أي لمراقبة الجودة السلبية باستخدام كاشف المياه الصف) بضرب FCSV بنسبة 0.3.
12. تقسيم FCSV إلى ثلاث،العينات الفرعية ه.
    1. إعداد العينات الفرعية 1 و 2 مع حجم مساو الى 1.04 أضعاف حجم عينة الفحص. تجميد هذه العينات الفرعية عند أو أقل من -70 درجة مئوية إذا لم يمكن تحليلها باستخدام الكلي فحص زروع فيروس (عينة فرعية 1، الخطوة 4) أو معالجتها لفحوصات الجزيئية (لا يظهر) خلال 24 ساعة. خلاف ذلك، عقد في 4 درجات مئوية.
    2. تجميد حجم المتبقية (عينة فرعية 3) عند أو أقل من -70 درجة مئوية.
13. حساب حجم اللقاح بقسمة S بنسبة 10.

3. إجمالي زروع الفيروسات كمي الفحص

ملاحظة: للحصول على جميع الخطوات يضيف دائما حلول بعناية لتجنب إزعاج أحادي الطبقة الخلية.

1. صب أو وسائل الإعلام نضح من أوعية الاختبار يحتوي على أحادي الطبقة من الخلايا BGM في 3-6 أيام بعد تقسيم ثم قم بإضافة حجم محلول ملحي متوازن على قدم المساواة إلى وسائل الإعلام إزالتها.
2. صب أو نضح محلول ملحي متوازن من الشركة المصرية للاتصالات زراعة الخلاياسفن الحادي وتستخدم ثم تطعيم الأوعية اختبار ثقافة خلية
   1. تطعيم 10 أوعية الاختبار لكل عينة الاختبار مع حجم عينة فرعية 1 مساو لحجم اللقاح جنبا إلى جنب مع مجموع فيروس زروع ضوابط فحص كمي (مواد تكميلية قسم S2.4).
   2. لLFB ومختبر العصائر مصفوفة عينة (LFSM، أي المصنف مصفوفة عينة المياه)، وإعداد 5-، 25-، و 125 أضعاف التخفيفات باستخدام عينة فرعية 3 و 0.15 M فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7،0-7،5 كما مخفف. تم اعطاء مثال من إجراءات لجعل التخفيفات في تكميلية قسم المواد S3. تطعيم 10 غسلها أوعية الاختبار ثقافة خلية لكل سلسلة تخفيف باستخدام وحدة تخزين اللقاح على كل سفينة اختبار بالإضافة إلى السفن تلقيح مع عينة فرعية غير مخفف 1 في الخطوة 3.2.1.
   3. للحصول على أي عينة الاختبار من الخطوة 3.2.1 (غير تلك الملقحة في الخطوة 3.2.2) الذي يحتوي CPE في جميع مكررات 10 بعد 14 يوما من الحضانة (انظر الخطوة 3.3)، قبلحلج التخفيفات 5-، 25-، و125-، و 625 ضعفا من عينة فرعية 3. تلقيح 10 غسلها أوعية الاختبار ثقافة خلية لكل سلسلة تخفيف باستخدام وحدة تخزين اللقاح على كل سفينة اختبار جنبا إلى جنب مع مجموعة جديدة من مجموع كمومي فيروس زروع ضوابط فحص (مواد تكميلية قسم S2.4).
   4. توزيع اللقاح على سطح الطبقات الوحيدة الخلية عن طريق إمالة السفن ذهابا وإيابا. احتضان أوعية الاختبار في درجة حرارة الغرفة ل80-120 دقيقة على منصة هزاز الميكانيكية في 1-5 التذبذبات / دقيقة أو مع هزاز الأوعية كل 15-20 دقيقة للسماح أي فيروس الحالي إلى كثف إلى الخلايا.
   5. إضافة المتوسطة صيانة prewarmed، ثم احتضان أوعية الاختبار في 36.5 ± 1 درجة مئوية.
3. ابحث عن ظهور CPE في كل سفينة الاختبار باستخدام المجهر يوميا لأول د 3 ومن ثم دراستها كل 2-3 أيام حتى يوم 14. نقل أي اختبار السفن التي تظهر ≥75٪ CPE إلى الثلاجة وضعت في أودون -70 درجة مئوية. تجميد جميع الثقافات المتبقية ومجموع فيروس زروع ضوابط فحص كمي عند أو أقل من -70 درجة مئوية بعد فحص السفن في اليوم الأخير.
4. ذوبان الجليد من كل الثقافات وتصفية ≥15٪ من المتوسط ​​من كل سفينة اختبار CPE إيجابي من خلال 0.2 ميكرون تعقيم التصفية. إذا لا يمكن تمرير حجم محدد من خلال تصفية بسبب انسداد، الطرد المركزي والمتوسطة لمدة 10 دقيقة في 1،500-18،000 x ج و 4 درجات مئوية قبل الترشيح.
5. إجراء مرور الثاني من كل ^شارع أوعية الاختبار مرور 1 باستخدام غسلها أوعية الاختبار BGM.
   1. تطعيم الأوعية اختبار جديد مع حجم التلقيح التي تمثل 10٪ من متوسط ​​إذابة من جميع أوعية الاختبار سلبية ومن المتوسط ​​تصفيتها من السفن إيجابية.
   2. كرر الخطوات 3.2.4-3.4.3، ولكن تجميد أي سفينة الاختبار الذي كان سلبيا في ^الحادي مرور 1 و إيجابية علي ^{الثانية} 2 كما هو موضح في الخطوة 3.3. أداء تمريرة 3 ^{الثالثة}عمر كما هو موضح في المقطع 2 ^{الثانية} فقط باستخدام ضوابط الفحص سلبية والثقافات الخلية التي كانت سلبية خلال ^الحادي مرور 1 وايجابية في مرور 2 ^{الثانية.}
6. تحديد أوعية الاختبار الفردية وفيروس إيجابي عندما تظهر CPE في كل من ^شارع 1 و 2 الممرات ^{الثانية،} أو في الحالة التي يكون فيها CPE لا يحدث حتى مرور 2 ^{الثانية،} في كل من 2 ^{الثانية والثالثة} 3 الممرات.
7. استخدام عدد حاسبة الأكثر احتمالا وكالة حماية البيئة مع إعدادات البرنامج الافتراضية تعيين كما هو موضح في الجدول S2 لحساب التتر الفيروس من جميع عينات الاختبار.
   1. إدخال عدد من فيروس أوعية الاختبار تكرار إيجابية من الخطوة 3.6 لكل عينة الاختبار الى آلة حاسبة لتحديد MPN / قيمة مل (M _مل) والعلوي (CL _UML) وانخفاض (CL _LML) 95٪ حدود الثقة / القيم مل .
   2. Obtain لمبن / قيمة L (M _L) من عينة اختبار المقابلة باستخدام المعادلة 2.
      المعادلة 2
      M _مل هي القيمة / مل مبن في الخطوة 3.7، S هو الفحص حجم العينة، ودال هو حجم عينة المياه الأصلي يعاير.
   3. حساب العلوي الثقة الحد / L عن طريق استبدال قيمة CL _UML لقيمة M _مل. حساب انخفاض ثقة الحد / L عن طريق استبدال قيمة CL _LML لقيمة M _مل. ويرد على حساب سبيل المثال في تكميلية القسم المواد S4.2.
   4. قيم تقرير M _مل من 0 كما ≤ 1 / D. على سبيل المثال، ≤ 0.002 MPN / L (≤ 1/500 L) لعينات المياه الجوفية.
   5. حساب مبن و 95٪ القيم الحدية الثقة لكل مختبر العصائر فارغة ومختبر إعادةوكيل فارغ بضرب أولا القيم / مل تم الحصول عليها في الآلة الحاسبة التي كتبها S ومن ثم قسمة الناتج على 0.3.

النتائج

وتركز الفيروس من المياه الجوفية مصدر من ثلاث محطات لمعالجة مياه الشرب وخاصة جيدا باستخدام مرشحات كهربي. مجموعتين عينة، تتألف من العينة الميدانية ومراقبة LFSM، تم جمعها من محطات المعالجة في مناسبات منفصلة، ​​وجمعت مجموعة واحدة عينة من البئر الخاص. تم تحديد العام للاسترداد الفيروس باستخدام عينات LFSM من اثنين من النباتات وكذلك الخاص (عينتين من مصنع واحد وعينة واحدة من آخر استبعدت من الحساب لأنه لا يمكن تحديد قيمة مبن من البذور المستخدمة مع كل عينة بدقة بسبب إلى نتائج CPE غير طبيعية بين قوارير مكرر). يعني انتعاش فيروس شلل الأطفال من عينات المياه الجوفية في المتوسط ​​58٪ مع معامل الاختلاف من 79٪ (الشكل 2) ^16. تم الكشف عن أي فيروس زروع في أي من العينات الميدانية المياه المكررة الأرض غير المصنف.

وقد تم قياس الأداء الأسلوب أيضا باستخدام LFB الصورةamples تعديلها باستخدام مستويين مختلفة من البذور. تم استخدام "منخفض" عيار 300 مبن من فيروس شلل الأطفال لتقييم الأداء على مستويات أقل من 500 مستوى مبن LFB "قياسي" المستخدمة في أسلوب وكالة حماية البيئة 1615. وعيار "عالية" من كان يستخدم 1000 مبن من فيروس شلل الأطفال لاختبار الأداء في مستوى السيطرة LFSM. هذه الضوابط أداء مماثل مع انتعاش متوسط ​​من 111٪ ومعامل الاختلاف من 100٪ (الشكل 2). وكانت جميع LRB سلبية العينات وجميع العينات LFB أداء ضمن نطاق القبول (الجدول المواد التكميلية S1).

ويظهر الشكل 1. تصفية شطف. التخطيطي لاستخدام وعاء الضغط لتصفية خرطوشة شطف. يستخدم ضغط الهواء الإيجابي لدفع لحم البقر استخراج الحل في حاوية ضغط من خلال يخدع خرطوشة الإسكانtaining تصفية خرطوشة كهربي. يمكن أن تكون بديلا مضخة تحوي للحاوية الضغط، مع مدخل المضخة التي وضعت في حاوية عقد استخراج اللحم البقري حل.

الشكل 2. متوسط ​​فيروس شلل الأطفال الاسترداد (٪) من الأرض والكاشف الصف المياه. وأظهرت انتعاش متوسط ​​في المئة لفيروس شلل الأطفال من الأرض ( . ن = 4) والصف كاشف المياه ( . ن = 12) عينات. شملت عينات المياه اثني عشر الصف كاشف ستة المصنف مع 300 مبن وستة المصنف مع 1000 مبن من فيروس شلل الأطفال. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري.

Discussion

وكالة حماية البيئة أسلوب 1615 تم تطويرها للاستخدام خلال دورة الرصد الثالثة على غير المنظم الملوثات تنظيم الرصد (UCMR3) ¹⁷ و تهدف في المقام الأول لقياس حدوث الفيروس في المياه الجوفية. وتشترك في عدد من الخطوات المشتركة مع أسلوب جمع المعلومات القاعدة (مجلس النواب)، ^15،18 ولكن اثنين من الاختلافات الطفيفة. كلا استخدام فحوصات كمي لقياس الفيروس التي تنتج CPE على الطبقات الوحيدة الخلية BGM مع الكميات التي تستند إلى معظم (MPN) حسابات عدد محتمل. طريقة 1615 يسمح باستخدام فلتر كهربي أحدث لتركيز الفيروس من مختلف المصفوفات المياه ويقلل من عدد من زراعة الخلايا عاء الاختبار نسخ متماثلة في التخفيف من 20 إلى 10. كل التغييرات الطفيفة خفض التكاليف طريقة الشاملة. التخفيض في عدد مكررات يقلل من العمل، ولكن النتائج في حد اكتشاف أقل قليلا. على الرغم من أن من المتوقع أن يكون تركيز أقل من الفيروسات من المياه السطحية المياه الجوفية، ^19،20 ثمبلغ (ه) من عينة يعاير خمس مرات من المياه السطحية، وتعويض جزئيا عن الاختلافات. فإن استخدام عدد أقل من مكررات تكون كافية لمعظم المياه السطحية، ولكن بعض سيتطلب تخفيف عينة.

طريقة 1615 لديها العديد من الخطوات الحاسمة والقيود. تختلف مقتطفات لحوم البقر من الكثير الكثير. كل الكثير ينبغي اختبار لفعالية شطف الفيروس والقدرة على تركيز الفيروس من خلال الخطوات تركيز الثانوية كما هو موضح هي مواد تكميلية قسم S2.3. يستخدم الأسلوب الصيغ دقيقة لحساب كمية عينة لتطعيم على مزارع الخلايا BGM وتحديد التتر الفيروس. سيتم إنشاء نتائج غير دقيقة إذا لم يتم اتباع هذه الصيغ بدقة. يجب استخدام تقنية العقيم المناسبة للحفاظ على الثقافات الخلية. غير المصابة BGM الضوابط ثقافة الخلية التي تظهر الضيق أثناء فترة الحضانة لمدة 14 يوما على الأرجح يشير إلى مشاكل مع صيانة ثقافة الخلية. عناية كبيرة يجب أن يكون أيضا تاكين خلال pipetting لالخطوات المتبعة مع تلقيح وبالإضافة المتوسطة لقوارير زراعة الخلايا لتجنب انتقال التلوث. ومراقبة الجودة وصفها في القسم التكميلي المواد S2 يجب اتباعها بدقة. كما يوفر قسم S2 المشورة حل لمشاكل قضايا الجودة.

الآلية الأولى من امتصاص الفيروس إلى كهربي المرشحات هو التفاعل تهمة تتعلق قوة شحنة موجبة على مرشح وقوة الشحنة السالبة للفيروس "تتعلق نقطة تساوي الكهربية والرقم الهيدروجيني للمياه التي يجري اختبارها ^21. شطف من المرشحات أيضا يتأثر قوة هذه التفاعلات. لأنها تختلف بين أنواع الفيروسات وحتى بين السلالات داخل نفس النوع، شطف من المرشحات ليست موحدة. وهذا يعني أن أي نتيجة قد نقلل من المستوى الفعلي للفيروس الحالي في المياه البيئية. استخدام خط الخلية BGM واحد أيضا يقلل حدوث الفيروس. النطاقفيروس المعوي التي يمكن أن تنتج CPE في هذا الخط خلية في المقام الأول يقتصر على فيروس شلل الأطفال والأنماط المصلية الأنواع الفيروسة المعوية B وكذلك بعض reoviruses ^14،15،22. لن يتم الكشف عن أنواع الفيروسات المعدية الأخرى.

اجتمع المستردة فيروس شلل الأطفال من المياه الجوفية والصف كاشف الطريقة وكالة حماية البيئة 1615 معايير القبول الأداء لكل من تقييم الأداء (PE، أي عينات من المياه المصنف كاشف الصف مع التتر غير معروفة لأحد المحللين التي تستخدم لتقييم أداء المحلل قبل بدء دراسة) وعينات LFB (مواد تكميلية الجدول S1). استعادة 58٪ من المياه الجوفية باستخدام الإجراء الثقافة هي مماثلة لتلك التي ذكرت من قبل الآخرين باستخدام ماء الصنبور ^23،24. التقى متوسط ​​التعافي من عينات LFB من 111٪ مع معامل الاختلاف (CV) من 100٪ أيضا معايير القبول أداء طريقة حتى ولو كانت أعلى من تلك التي لوحظت لعينات PE الدرجي في مجلس النواب. مجلس النواب يعني كان الانتعاش بين المختبرات 56٪ مع معامل الاختلاف (CV) من 92٪ في حين المبالغ المستردة intralaboratory متوسط ​​تنوعت 36-85٪ (السير الذاتية 58-131٪، بيانات غير منشورة من قاعدة البيانات النواب PE). وقد لوحظت المبالغ المستردة أعلى في هذه الدراسة لعينات LFB البذور منخفضة من عينات البذور أعلى (122 مقابل 42٪). في الوقت الذي النواب كان يجري التخطيط، كان من المتوقع أن عينات PE تلقي القيم البذور منخفضة سيكون الانتعاش أقل أن أولئك الذين يتلقون بذور عالية. مماثلة لتلك التي لوحظت هنا للحصول على عينات LFB، كان الانتعاش فيروس شلل الأطفال لعينات مجلس النواب PE 71٪ (CV 100٪) و 54٪ (CV 69٪)، و 44٪ (CV 71٪) للقيم البذور ≤300 مبن، 300- 1500 مبن، و> 1500 مبن على التوالي.

هناك العديد من الطرق لقياس الفيروسات المعدية في عينات المياه ^25. هذا الأسلوب هو مهم بالنسبة للطرق الأخرى في درجة التوحيد. توحيد يشمل ليس فقط الجودة والأداء الضوابط،ولكنه يستخدم أيضا كميات وصيغ محددة لضمان أن جميع المختبرات التحليلية أداء أسلوب مماثل. دون التوحيد، فمن الصعب مقارنة النتائج بين المختبرات، وبالتالي توحيد ضروري عند إجراء دراسات واسعة النطاق في المختبرات التحليلية متعددة. مع توحيد المدمج في ويمكن توسيع نطاق هذا الأسلوب في المستقبل لتشمل أنواع فيروس إضافية وخطوط الخلايا. وتجري حاليا بحوث لتوفير بيانات لإدراج اتش في الأسلوب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beef extract, desiccated powder	BD Bacto	211520
Cryogenic tubes	Thermo Fisher	3775/945373
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	14170-112
Mechanical rocking platform	Daigger	EF4907G
Orbital shaker	Thermo Fisher	14-285-729
Sterilizing filter with prefilter	VWR	28143-295
Sterilizing syringe filter	Corning	431219
pH Standards	Sigma-Aldrich	33643, 33646, 33648
MEM	Sigma-Aldrich	M1018 or M4642
Leibovitz L-15	Sigma-Aldrich	L4386
Sodium bicarbonate, 7.5%	Sigma-Aldrich	S8761
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Trypsin, EDTA	Invitrogen	25200072